人CYP2C19基因分型檢測試劑性能驗證*

呂 園，朱莉穎，張 健，李 萍，鄔 蘭，張秀梅，王海鵬，俞 楊△

1.江蘇省南京市第一醫院/南京醫科大學附屬南京醫院核醫學科實驗診斷部，江蘇南京 210006；2.江蘇省人民醫院/南京醫科大學第一附屬醫院血液科，江蘇南京 210000

在臨床檢驗過程中，從質量管理的角度考慮，任何一種全新的用于常規檢驗的檢測系統、試劑或方法學，在其投入臨床使用前，均需進行相應的性能驗證[1]。性能驗證能夠提高實驗室對檢測系統、試劑和方法學相關性能指標的認識和理解，對實驗室技術質量管理和控制水平的提高具有重要作用[2-3]。本研究參照中國合格評定國家認可委員會(CNAS)2019年2月15日發布并實施的CNAS-GL039：2019《分子診斷檢驗程序性能驗證指南》(以下簡稱2019版指南)[4]，對人CYP2C19基因分型檢測試劑盒[熒光聚合酶鏈反應(PCR)法]進行方法符合率、檢出限、交叉反應以及抗干擾能力4個方面的性能驗證[5]。

1 材料與方法

1.1材料 方法符合率：15例臨床樣本(10例突變型+5例野生型)靜脈血；檢出限：1例雜合突變型(*2/*3型)臨床樣本基因組DNA；交叉反應：5例野生型(*1/*1型)臨床樣本靜脈血；抗干擾能力：2例突變型(*2/*3型和*1/*2型)臨床樣本靜脈血。以上基因型均已通過Sanger測序證實。

1.2儀器與試劑 天隆NP968自動化核酸提取儀(西安天隆科技有限公司)；超微量紫外-可見光分光光度計NanoDrop One(賽默飛世爾科技中國有限公司)；SLAN-96P熒光定量PCR儀(上海宏石醫療科技有限公司)；全自動血液基因組DNA提取試劑(西安天隆科技有限公司)；人CYP2C19基因分型檢測試劑盒(熒光PCR法，蘇州曠遠生物分子技術有限公司)。

1.3靜脈血基因組DNA提取 采用天隆NP968自動化核酸提取儀進行靜脈血基因組DNA提取。所提取的基因組DNA經超微量紫外-可見光分光光度計NanoDrop One測定，水平為10～100 ng/μL，純度A260/280值為1.8～2.0。

1.4熒光PCR檢測 按照人CYP2C19基因分型檢測試劑盒(熒光PCR法)說明書，進行CYP2C19基因分型檢測(*2和*3等位基因，c.681G>A和c.636G>A)，同時檢測陰性和陽性對照(試劑盒自帶)，分為*2G、*2A、*3G和*3A 4個反應體系。用SLAN-96P熒光定量PCR儀及相應配套軟件進行熒光定量PCR反應。PCR反應條件：37 ℃ 2 min(去污染)；95 ℃ 3 min(預變性)；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，65 ℃ 45 s，10個擴增循環；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s※(信號采集點)，65 ℃ 45 s，30個擴增循環，設置檢測信號Ct(FAM)/內參信號Ct(ROX)雙通道采集熒光信號；25 ℃ 1 min，程序結束，機器冷卻至室溫。

1.5結果判讀 在Ct(ROX)值≤20，且擴增曲線有明顯指數增長期的情況下，分別計算樣本Ct(FAM)值與Ct(ROX)值的差值，參照說明書判斷樣本CYP2C19基因型。常見6種基因型結果：CYP2C19*1/*1(636 GG；681 GG)、CYP2C19*1/*2(636 GG；681 GA)、CYP2C19*1/*3(636 GA；681 GG)、CYP2C19*2/*2(636 GG；681 AA)、CYP2C19*2/*3(636 GA；681 GA)、CYP2C19*3/*3(636 AA；681 GG)[6]。

1.6性能驗證

1.6.1方法符合率 按照樣本檢測程序，采用參比方法(金標準Sanger測序法)和候選方法(熒光PCR法)平行檢測15例臨床樣本(突變型10例，野生型5例)[7]靜脈血，其中6例為正常樣本稀釋10倍獲得的弱陽性樣本(基因組DNA水平約為20 ng/μL)。Sanger測序工作委托華大基因科技有限公司完成。

1.6.2檢出限 選取1例雜合突變型(*2/*3型)臨床樣本基因組DNA。測定其水平為80 ng/μL，純度A260/280=1.94，將上述基因組DNA梯度稀釋5個水平范圍，分別為80、40、20、10、5 ng/μL。每個水平稀釋后的基因組DNA重復檢測5次。

1.6.3交叉反應 選取5例野生型(*1/*1型)臨床樣本靜脈血，分別加入CYP2C19*17等位基因(c.-806C>T)和同源基因CYP2C9(c.1075A>C)突變型質粒，分別重復檢測3次。

1.6.4抗干擾能力 選取2例突變型(*2/*3型和*1/*2型)臨床樣本靜脈血，分別稀釋10倍獲得弱陽性樣本(基因組DNA水平約為20 ng/μL)。分別加入終水平為血紅素=20.0 g/L，膽紅素=60.0 μmol/L，甘油三酯=11.0 mmol/L(廠商聲明的最高抗干擾水平)的干擾物質，分別重復檢測3次。

2 結 果

2.1方法符合率 15例臨床樣本檢測結果見表1，參比方法(金標準Sanger測序法)和候選方法(熒光PCR法)檢測的符合率為100%。

表1 方法符合率結果比對

2.2檢出限 雜合突變型(*2/*3型)臨床樣本基因組DNA經梯度稀釋后，其中80、40、20、10 ng/μL 4個水平5次檢測結果基因型均為*2/*3型，而5 ng/μL水平4次檢測結果基因型為*2/*3型，1次檢測無結果。根據試劑盒說明書要求，判定檢出限為10 ng/μL。

2.3交叉反應 5例野生型(*1/*1型)臨床樣本靜脈血，分別加入CYP2C19*17等位基因(c.-806C>T)和同源基因CYP2C9(c.1075A>C)突變型質粒，CYP2C19基因分型檢測結果仍為*1/*1型，證實交叉反應驗證合格。

2.4抗干擾能力 2例突變型(*2/*3型和*1/*2型)臨床樣本靜脈血，在3種干擾物質(血紅素/膽紅素/甘油三酯)作用下的基因分型檢測結果均與對照一致，故試劑盒抗干擾能力合格。

3 討 論

2019年2月15日CNAS發布并實施了2019版指南[5]，并以此作為分子診斷實驗室性能驗證的參考文件。此版指南中明確了分子診斷定性檢測項目性能驗證的指標宜包括“方法符合率、檢出限、交叉反應和抗干擾能力”。這對2018版指南中“準確度、測定下限、特異性和抗干擾能力”[8]4個方面性能驗證指標進行了明確定義和指導。

關于性能驗證樣本容量，一直是實驗室工作人員最難把握的問題。樣本容量又稱“樣本數”。樣本容量是指一個總體的必要抽樣的數目[9]。在進行抽樣調查時，抽樣誤差的大小直接影響抽取樣本對觀察總體的代表性和研究結果的可靠性，而足夠的樣本單位數目是保證抽樣誤差不會超過某一指定范圍的一個重要因素[10]。2019版指南對定性項目性能驗證明確了樣本容量的具體要求，為臨床提供了參考標準。例如：方法符合率要求，選取陰性樣本至少5例、陽性樣本(宜包含弱陽性的樣本)一般不少于10例。在基因突變檢測過程中，通常將野生型樣本作為陰性樣本，突變型樣本作為陽性樣本[11]，本研究共選取15例樣本，滿足2019版指南要求。檢出限要求，使用定值標準物質的樣本梯度稀釋至廠家聲明的檢出限水平，可重復測定5次或在不同批次內對該水平樣本進行20次重復測定(如測定5 d，每天測定4例樣本)。本研究選取單日重復測定5次的方案，成功驗證廠家聲明的檢出限水平(10 ng/μL)。交叉反應和抗干擾能力均要求至少重復檢測3次以上。

2019版指南明確了應驗證與檢測對象可能存在交叉反應的核酸物質對檢測結果的影響[12]。對于報告具體基因型的方法，應在待測核酸水平驗證其他基因型對待測核酸測定的影響。本次性能驗證試驗選取5例CYP2C19*1/*1型臨床樣本，分別加入CYP2C19*17等位基因(c.-806C>T)和 CYP2C9(c.1075A>C)兩種突變型質粒。CYP2C19*17代表c.-806位點，其突變型質粒對本試劑盒檢測的c.636和c.681位點結果無影響；而CYP2C9為CYP2C19的同源基因，其c.1075位點突變型質粒對本試劑盒檢測結果亦無影響。

在驗證試劑盒“檢出限”的過程中，本研究將原水平為80 ng/μL基因組DNA梯度稀釋為5個水平范圍，以求尋找試劑盒最低檢測下限[13]。當梯度稀釋至10 ng/μL(試劑廠家聲稱的最低測定下限)時，5次檢測結果均與未稀釋的樣品一致，說明本研究已成功復現了生產廠家所宣稱的最低測定下限。當梯度稀釋至5 ng/μL時，其中只有4次結果與未稀釋的樣品一致，且內參擴增曲線的Ct(ROX)值明顯增加，接近臨界Ct值(20)。第5次結果內參Ct(ROX)值>20，不符合標準操作流程要求，無法判定結果。可能是由于稀釋樣本中基因組DNA模板水平過低，無法與試劑中引物有效結合[14]。本試劑盒無法保證在5 ng/μL水平100%檢出靶核酸，因此判定試劑盒檢出限為10 ng/μL。

在驗證試劑盒“抗干擾能力”的過程中，本研究選取血紅素20.0 g/L，甘油三酯11.0 mmol/L，總膽紅素60.0 μmol/L作為3種干擾物質，分別驗證溶血、脂血和黃疸3種靜脈血樣本狀態對試劑盒檢測結果的影響，相應水平為試劑廠商聲稱的最高抗干擾水平。結果證實3種干擾物質對檢測結果無影響。但在實際臨床應用過程中，因大多數患者來自心血管內科，相關藥物是否會對檢測結果產生影響，值得進一步探討。

本次性能驗證過程嚴格按照2019版指南對分子診斷基因分型檢測的具體要求，實驗方案簡單明了，可供相關實驗室參考。