89株蠟樣芽孢桿菌食品分離株攜帶毒力基因情況及PFGE分型研究*

盧曉蕓，施怡茹，吳麗珠，高紅梅，郁 晞，莊 源，張紅芝，徐秋芳△

1.上海市青浦區疾病預防控制中心，上海 201799；2.上海市疾病預防控制中心，上海 200336

蠟樣芽孢桿菌為兼性厭氧的革蘭陽性芽孢桿菌，是重要的食源性條件致病菌[1-3]，能引起腹瀉、嘔吐、眼部疾病、敗血癥等疾病，甚至導致患者死亡[4-5]。其常污染米面制品、肉制品、蔬菜等，尤其是富含蛋白質、碳水化合物的食物。國家食源性疾病監測數據顯示，該菌引起的相關食源性疾病仍存在未被報告或被誤診的情況(蠟樣芽孢桿菌嘔吐型和腹瀉型的癥狀類似于金黃色葡萄球菌或產氣莢膜梭菌引起的食物中毒)[6]，導致其相關食源性疾病事件統計數低于實際事件數。毒力基因和脈沖場凝膠電泳(PFGE)技術能在食源性疾病暴發調查中對致病菌進行分子分型和毒力基因鑒定。

本研究建立上海市青浦區蠟樣芽孢桿菌毒力基因檢測方法和PFGE分型檢測方法，并對2016-2020年729份樣品進行檢測，了解青浦區蠟樣芽孢桿菌毒力基因和PFGE分型，結合污染情況對蠟樣芽孢桿菌引起的食物中毒風險進行評估，減少因蠟樣芽孢桿菌引起的食品安全問題。

1 材料與方法

1.1菌株和樣品來源 對2016-2020年729份樣品(包含熟制米面制品208份、學生午餐260份、熟肉制品84份、醬料78份、蔬菜99份)進行蠟樣芽孢桿菌檢測，分離得到89株蠟樣芽孢桿菌。樣品采樣分別涉及餐飲服務環節(70份)、學生餐配送公司環節(260份)、流通環節(399份)3個環節。本研究使用蠟樣芽孢桿菌標準菌株CICC23828作為陽性對照菌株和PFGE實驗條件優化的質控菌株。

1.2儀器與試劑 主要儀器包括PCR擴增儀(ABI,美國)，以及普通電泳儀、PFGE儀、凝膠成像系統等(Bio-Rad，美國)。主要試劑包括甘露醇卵黃多黏菌素(MYP)瓊脂、血平板等(上海科瑪嘉生物科技有限公司，中國)。PCR反應體系2×Taq PCR Master mix(BBI，美國)、PCR引物及DNA相對分子質量標準(50～1 200 kb，上海生工生物，中國)。限制性內切酶XbaⅠ和NotⅠ、蛋白酶K(Takara，日本)、Seakem Gold瓊脂糖(Lonza，瑞士)。

1.3方法

1.3.1檢定 按照國家食品安全標準(GB4789.14-2014現行有效標準)，使用MYP瓊脂分離樣品中的可疑菌落，使用血平板劃線分離單個純菌落，進行常規生化試驗和確證試驗，同時使用全自動微生物生化系統進行鑒定。對菌株進行生化分型試驗[過氧化氫酶試驗、動力試驗、硝酸鹽還原試驗、酪蛋白分解試驗、溶菌酶耐性試驗、V-P試驗、葡萄糖利用(厭氧)試驗、根狀生長試驗、溶血試驗、蛋白質毒素結晶試驗]。

1.3.2毒力基因檢測 普通PCR電泳法檢測蠟樣芽孢桿菌腹瀉毒素毒力基因片段、嘔吐毒素毒力基因片段(溶血性基因hblA、hblC、hblD，非溶血性基因nheA、nheB、nheC，腸毒素基因entFM、bceT，細胞毒素基因cytK，嘔吐毒素基因ces)[3]。PCR條件：預變性94 ℃ 4 min，變性94 ℃ 30 s，退火54 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 1 min，40個循環；最后延伸72 ℃ 10 min[7]。PCR擴增產物電泳：產物5 μL，120 V電泳30 min。同時設蠟樣芽孢桿菌標準菌株CICC23828作為陽性對照菌株。所用引物序列及PCR產物大小[1，8-9]見表1。

表1 蠟樣芽孢桿菌毒力基因引物序列和產物大小

1.3.3PFGE分型試驗 參考黃銘珊[1]及張慧娟等[10]的研究，PFGE方案如下：(1)小膠塊。取新鮮菌落用TE制備5.0麥氏濁度的菌懸液。取400 μL菌懸液加入8 μL溶菌酶(100 μg/μL，下文水平相同)，37 ℃水浴20 min。加入20 μL蛋白酶K(20 μg/μL)和400 μL 1% Seakem Gold瓊脂糖(TE和SeaKem Gold agarose制備，54 ℃水浴30 min以上)輕柔混勻后，加入模具，4 ℃凝固5 min。(2)裂解細胞。使用TE和溶菌酶處理小膠塊(每管5 mL TE和25 μL 溶菌酶，37 ℃水浴，170 r/min振蕩搖晃4～6 h)。(3)消化蛋白。取出充分裂解的小膠塊，使用細胞裂解液CLB和蛋白酶K處理小膠塊(每管5 mL CLB和25 μL蛋白酶K，54 ℃水浴,170 r/min振蕩搖晃18 h)。(4)洗膠塊。使用純水和TE分別54 ℃水浴后170 r/min振蕩搖晃洗滌15 min(先純水洗2次，后TE洗4次)。(5)酶切。選擇NotⅠ酶切實驗菌株小膠條，20 U NotⅠ在37 ℃酶切4 h。沙門菌H9812小膠塊用50 U XbaⅠ在37 ℃酶切2 h。(6)電泳。0.5×TBE電泳液2 000 mL，初始轉換時間5 s，最終轉換時間80 s，電壓為6.0 V/cm，脈沖夾角為120°，電泳時間為18 h。(7)圖像獲取。電泳完成后將凝膠用GelRed溶液染色30 min，純水脫色20 min，使用Bio-Rad成像系統成像。圖譜使用BioNumerics5.10軟件處理。聚類圖結果根據非加權配對算術平均法(UPGMA)構建，條帶的位置差異容許度設置為1.0%，電泳條帶相似性系數以Dice系數表示。

2 結 果

2.1蠟樣芽孢桿菌的來源分析 89株蠟樣芽孢桿菌檢出情況：熟制米面制品中檢出35株，學生午餐中檢出29株，熟肉制品中檢出13株，醬料中檢出5株，蔬菜中檢出7株，檢出率分別為16.83%(35/208)、11.15%(29/260)、15.48%(13/84)、6.41%(5/78)、7.07%(7/99)。各類型食品檢出率差異有統計學意義(χ2=10.13，P=0.038)。樣品采樣涉及餐飲服務環節、學生餐配送公司環節、流通環節，各環節檢出率分別為35.71%(25/70)、11.15%(29/260)、8.77%(35/399)，差異有統計學意義(χ2=40.75，P<0.01)。

2.2蠟樣芽孢桿菌的鑒定結果 89株菌株確證試驗均符合蠟樣芽孢桿菌生化特征，定量結果均小于105CFU/g，后續進行生化分型試驗(以2型為主)，結果見表2。確證試驗和生化分型試驗全部完成所需時長為6 d。

表2 89株蠟樣芽孢桿菌的生化分型結果(n)

2.3蠟樣芽孢桿菌的毒力基因檢測結果 89株蠟樣芽孢桿菌中，hblA、hblC、hblD基因都攜帶的蠟樣芽孢桿菌有38株(42.70%)，均不攜帶27株(30.34%)，剩余24株菌株(26.96%)均攜帶hblA、hblC、hblD中的1～2種，攜帶hblC基因的菌株最多(60.67%)。nheA、nheB、nheC基因都攜帶的菌株有50株(56.18%)，39株均攜帶nheA、nheB、nheC基因中至少一種(43.82%)，攜帶nheB基因的菌株最多(88.76%)。entFM、bceT、cytK、ces這4種基因攜帶情況分別為71.91%、38.20%、41.57%、15.73%。各類型毒力基因(hblA、hblC、hblD、nheA、nheB、nheC、entFM、bceT、cytK、ces)攜帶情況不同。有9株菌株為腹瀉強毒株(僅不攜帶ces基因)，15株同時攜帶腸毒素基因entFM、bceT和細胞毒素基因cytK，有14株攜帶嘔吐毒素基因ces，該38株菌株均來自熟制米面制品、學生午餐、熟肉制品。

2.4蠟樣芽孢桿菌的PFGE分型結果 對89株蠟樣芽孢桿菌進行PFGE和聚類分析，可分為85個帶型，見圖1。NotⅠ酶切可得5～12條DNA片段。編號為QPBC16005和QPBC16006的菌株、QPBC17028和QPBC17029的菌株,圖譜相似度為100%，QPBC18002、QPBC18003和QPBC18004 3株菌株圖譜相似度為100%，為3種帶型，且均分別源自同時間同一采樣地點的不同樣本，其余82株帶型之間均存在不同程度差異。

注：A為QPBC17028和QPBC17029的PFGE圖譜；B為QPBC16005和QPBC16006的PFGE圖譜；C為QPBC18002、QPBC18003和QPBC18004的PFGE圖譜。

3 討 論

本研究對上海市青浦區2016-2020年5類729份食品進行檢測，共檢出蠟樣芽孢桿菌89株，檢出率為12.21%，且菌含量低于國家致病菌限量(105CFU/g),低于我國39個城市的蠟樣芽孢桿菌的總檢出率(35.00%[11])，以及吉林市的32.90%[12]、寶雞市的17.65%[13]，提示本地區蠟樣芽孢桿菌污染具有地區和食品種類特色。受污染樣品來源以餐飲服務環節為主，提示應加強餐飲服務環節的菌株污染監測。本地區食品檢出蠟樣芽孢桿菌以熟制米面制品、學生午餐、熟肉制品為主，與王煒等[14]、HUSSEIN等[15]研究蠟樣芽孢桿菌主要污染對象的結論一致，這些食品類別作為即食性食品引起食源性疾病風險較高，提示青浦區需要關注即食性食品在餐飲服務環節被污染。

本研究確證試驗和生化分型試驗結果證明，青浦區流行生化株為蠟樣芽孢桿菌2型，提示應對該流行生化分型多加關注。本研究發現生化分型數據有助于菌株來源分析，但操作復雜、試劑繁多、所需時間長，且存在不能分型的菌株，后續通過毒力基因PCR(小于24 h)和PFGE(小于60 h)對此加以補充，探討快速確定菌株型別、加快事件分析速度的試驗選擇，提升檢測效率。

本地區毒力基因攜帶情況呈多樣化：89株蠟樣芽孢桿菌中nheA、nheB、nheC任意一種基因攜帶率高達100.00%，與KONG等[16]、YU等[17]研究中nhe基因的攜帶情況高度一致；腹瀉相關基因hblA、hblC、hblD 3種基因均攜帶率和nheA、nheB、nheC 3種基因均攜帶率分別為42.70%、56.18%，其產生的溶血素和非溶血素會導致強烈腹瀉；張紅芝等[4]的研究提示攜帶ces嘔吐毒素基因簇的菌株是引起嘔吐型食源性疾病的潛在因子，而本研究中蠟樣芽孢桿菌攜帶嘔吐毒素基因ces高達14株且均污染即食性食品(熟制米面制品、學生午餐、熟肉制品)，增加了發生食源性疾病的風險。以上提示本區域應加強食品風險監測和食品安全管理，并應對區域內腹瀉和嘔吐事件多加關注。

PFGE結果顯示，青浦區蠟樣芽孢桿菌分子分型呈現多態性。同時，蠟樣芽孢桿菌菌株編號為QPBC16005和QPBC16006兩株、QPBC17028和QPBC17029兩株、QPBC18002、QPBC18003和QPBC18004 3株的PFGE圖譜相似度為100%，分別為3種帶型，均分別源自同時間同一采樣地點不同樣本，均污染即食性食品，是食品操作環節不當導致的交叉污染(受到相同菌株污染)，提示PFGE分型可以實現食品污染的有效溯源，且本區域需提高食品操作環節衛生要求。剩余82株蠟樣芽孢桿菌的條帶類型分布表明菌株之間無明顯聚集性，說明青浦區蠟樣芽孢桿菌在遺傳特征上目前仍呈高度多樣性。

綜上所述，本研究分析了蠟樣芽孢桿菌在青浦區的污染情況、生化分型、嘔吐和腹瀉相關的毒力基因攜帶情況、PFGE分型結果，分析污染食品的潛在風險，探討快速確定菌株型別檢測方法的選擇，為評估青浦區食品中蠟樣芽孢桿菌污染危害提供重要數據支持。