ADAM33基因T2位點多態性與支氣管哮喘易感性的關聯研究*

常永莉,張莉媛,王惠琴,王 冰,陳方園,李天浩

陜西中醫藥大學第二附屬醫院，陜西咸陽 712000

支氣管哮喘是臨床常見呼吸系統疾病，呈家族聚集性，多種細胞及細胞組分參與發病，與多基因遺傳有關。有資料顯示，全球約有3億人患有支氣管哮喘，在我國有超過3 000萬人患有支氣管哮喘，該病發病率較高，嚴重影響患者生命質量[1-2]。支氣管哮喘的病因尚不明確，多認為環境暴露、遺傳易感性相互作用決定著該病的發生和發展：環境因素是導致支氣管哮喘發生及發展的重要因素，患者健康狀況、精神心理狀態、免疫狀態、遺傳因素等是影響易感性的重要因素，也是支氣管哮喘發生、發展的主觀條件[3-4]。許多研究者致力于支氣管哮喘的遺傳病因學研究，并試圖證明支氣管哮喘的易感基因，由此幫助人們了解支氣管哮喘的病理過程。解整合素-金屬蛋白酶33(ADAM33)是膜錨定蛋白，參與細胞-基質、細胞-細胞相互作用的各種生物過程，ADAM33基因單核苷酸多態性是近年研究熱點。有研究探討了支氣管哮喘易感性、病情嚴重程度等與ADAM33基因單核苷酸多態性的關系，然而所得結果不盡相同，存在一定差異[5-6]，故本研究旨在探討ADAM33基因T2位點多態性與支氣管哮喘易感性的關聯性，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年12月至2020年12月在本院就診并接受治療的支氣管哮喘患者120例作為研究對象，納入研究組。患者年齡20～60歲、平均(38.62±5.51)歲，男61例、女59例。納入標準：(1)支氣管哮喘診斷符合《支氣管哮喘防治指南》(2016版)[7]標準，處于急性發作期；(2)年齡>18歲；(3)臨床病歷資料及隨訪資料完整。排除標準：(1)合并肝、心、腎等臟器病變及血液系統等疾病者；(2)合并惡性腫瘤、自身免疫性疾病、呼吸系統疾病者；(3)有血液系統疾病既往史者；(4)精神障礙無法正常溝通者。對納入的患者進行病情分級后分組：輕度為步行、上樓時氣短，可平臥，講話可連續成句，呼吸頻率輕度增加，呼吸末期有哮鳴音；中度為稍活動后出現氣短，喜坐位，講話以單詞為主，時有焦慮或煩躁情緒，出汗，呼吸頻率增加，可有輔助呼吸肌活動及三凹征，哮鳴音響亮、彌漫；重度為休息時出現氣短，端坐呼吸，講話以單字為主，常有焦慮、煩躁情緒，大汗淋漓，呼吸頻率超過30次/分，常有輔助呼吸肌活動及三凹征，哮鳴音響亮、彌漫；危重為不能講話，意識模糊或嗜睡，胸腹矛盾運動，哮鳴音減弱乃至無。以上判斷標準只需符合某一程度的某項指標即可分級，無須滿足全部指標。將研究組分為輕度組(33例)，中度組(22例)，重度組(34例)，危重組(31)例。選取同期在本院體檢的健康人群120例為對照組，年齡20～59歲、平均(38.53±5.41)歲，男62例、女58例。對照組研究對象無長期慢性咳嗽、呼吸困難、氣喘等哮喘類癥狀及病史，無個人過敏疾病史及過敏反應家族史。兩組性別、年齡等一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經本院醫學倫理委員會批準，所有研究對象均同意本研究并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1標本采集 抽取兩組研究對象肘靜脈血5 mL，加入乙二胺四乙酸二鈉進行抗凝，將標本放于-80 ℃冰箱保存。

1.2.2基因組DNA提取 將標本取出，常溫下放置1～2 h融解，取標本300 μL，加入細胞裂解液450 μL，封閉后用力震蕩，充分混合后采用離心機(濟南好來寶醫療器材有限公司，TGL-16M)以8 000 r/min離心3 min，取細胞核沉淀物，加入緩解液GS 200 μL，震蕩至完全結合。樣品中加入蛋白酶K溶液15 μL，采用渦旋機(廣州思碩機電設備有限公司，OX-0.66/8)渦旋6 s，加入緩沖液GB 15 μL，搖晃充分后，放入65 ℃水浴鍋(北京京創泰寧偉業科技發展有限公司，DZKW-A)恒溫5 min，充分搖晃至溶液變清亮。加入70%乙醇溶液200 μL，充分搖晃至出現沉淀物，將沉淀物放置于離心管，8 000 r/min離心1 min，倒棄溶液，加入緩沖液GD 500 μL，8 000 r/min離心1 min，倒棄溶液，加入漂洗液PW 650 μL，8 000 r/min離心1 min，倒棄溶液，再加入漂洗液PW 500 μL，8 000 r/min離心1 min，倒棄溶液，再8 000 r/min離心3 min，倒棄溶液。于室溫倒置離心管于濾紙上，晾干沉淀物，加入洗脫緩解液300 μL，輕微震蕩，放置于37 ℃恒溫水浴鍋12 h，收集溶液，采用基因組DNA提取試劑盒(北京索萊寶生物科技有限公司)提取基因組DNA。

1.2.3等位基因特異性聚合酶鏈反應(PCR) PCR反應體系20.0 μL：提取基因組DNA 1.0 μL，上、下游引物共0.32 μL，2.5 mmol/L dNTP 1.6 μL，TaqDNA聚合酶(TaKaRa公司)0.1 μL，10×Buffer 2.0 μL，二甲基亞砜1.0 μL，熒光染料Rox 0.2 μL，熒光染料SYBR 0.2 μL，超純凈水13.18 μL，氯化鎂(MgCl2) 0.4 μL。反應條件：變性，溫度95 ℃，時間3 s；退火，溫度95 ℃，時間15 s；延伸，溫度60 ℃，時間45 s，35個循環；終末延伸，溫度72 ℃，時間10 min。PCR產物擴增選擇德國Eppendorf公司的實時熒光定量PCR系統，PCR產物長度為211 bp。上游引物：5′-CCCCAAGAAACTCAGTAAACG-3′；下游引物：5′-GAGAAATGGTGGAGGGTAAAT-3′。采用限制性內切酶NaR1進行T2位點檢測，總體系為20.0 μL，其中10×Buffer 2.0 μL，去離子水7.0 μL，限制性內切酶1.0 μL，成功擴增的PCR產物10.0 μL。放置于37 ℃恒溫箱過夜，逐一滴入2.5%瓊脂糖凝膠梳孔，于電壓槽80 W電壓下進行電泳30 min，于凝膠成像儀保存后進行圖片分析。

1.2.4DNA序列測定 采用遺傳分析儀(北京中盾安民分析技術有限公司，GA118-16A)對擴增好的PCR產物進行測序，并采用NCBI的BLAST軟件與數據庫進行同源性分析，驗證正確性。

1.3統計學處理 采用SPSS13.0統計軟件進行數據處理和分析。計數資料以例數或率表示，Hardy-Weinberg平衡定律檢驗、等位基因頻率和組間基因型頻率的比較采用χ2檢驗，ADAM33基因T2位點等位基因分布與支氣管哮喘患病之間的關聯、哮喘患者嚴重程度與其T2位點多態性的關系采用Logistic回歸進行分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1兩組ADAM33基因T2位點Hardy-Weinberg平衡定律檢驗 采用Hardy-Weinberg平衡定律檢驗公式χ2=(O-C)2/C計算ADAM33基因T2位點3種基因型(AA、AG、GG)χ2值，發現研究組和對照組ADAM33基因T2位點均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)。見表1。

表1 兩組ADAM33基因T2位點Hardy-Weinberg平衡定律的檢驗

2.2兩組ADAM33基因T2位點基因型頻率比較 研究組與對照組ADAM33基因T2位點基因型(AA、AG、GG)頻率比較，差異均有統計學意義(χ2=7.001，P<0.05)。見表2。

表2 兩組ADAM33基因T2位點基因型頻率比較[n(%)]

2.3兩組ADAM33基因T2位點等位基因頻率分布比較 ADAM33基因T2位點等位基因頻率分布比較中，研究組A等位基因頻率(15.42%)低于對照組(23.75%)，差異有統計學意義(P<0.05)；Logistic回歸分析結果提示，ADAM33基因T2位點A等位基因頻率降低可提升支氣管哮喘患病風險(OR=0.875；95%CI：0.758～0.920，范圍包括1，P>0.05)。見表3。

表3 兩組ADAM33基因T2位點等位基因頻率分布[n(%)]

2.4支氣管哮喘患者嚴重程度與ADAM33基因T2位點多態性的關系 輕度組患者ADAM33基因T2位點AG基因型頻率(9.09%)低于中度組患者(36.36%)、重度組患者(32.35%)、危重組患者(41.94%)，差異有統計學意義(χ2=6.136、5.482、9.197，P<0.05)；中度組患者ADAM33基因T2位點AG基因型頻率與重度組患者、危重組患者比較，差異無統計學意義(P>0.05)。Logistic回歸分析結果顯示，ADAM33基因T2位點AG基因型頻率增加是影響支氣管哮喘嚴重程度的高危因素(OR=1.581；95%CI：1.118～1.453；P<0.05)。見表4、5。

表4 支氣管哮喘患者嚴重程度與ADAM33基因T2位點多態性的關系(n)

表5 影響支氣管哮喘嚴重程度的多因素Logistic回歸分析

3 討 論

支氣管哮喘是由環境因素及遺傳因素共同作用引起的氣道慢性炎癥。近年來，我國支氣管哮喘發病率逐年增加，給患者、家屬及社會帶來沉重負擔。大多數支氣管哮喘患者經過吸入激素、支氣管擴張劑等藥物進行規范、足療程的治療可完全控制病情，但仍然有部分支氣管哮喘患者病情難以控制，且病情遷延難愈，易復發。因此，研究支氣管哮喘發病機制對該病的臨床診斷及治療具有重要意義[8-10]。當環境因素損傷正常氣道時，氣道會啟動組織修復及炎性反應，然而，對支氣管哮喘而言，患者對氣道損傷的敏感度降低，支氣管組織修復的效率較低，修復進程較慢，這加重了支氣管哮喘患者氣道炎性反應，以及促進了氣道重構[11]。氣道、血管和上皮平滑肌纖維增生，上皮下基底膜纖維化，氣道氣流受限是支氣管哮喘患者常見的病理學改變，由此產生氣道重塑和不可逆性狹窄[12-13]。支氣管哮喘還受多基因遺傳的影響，研究發現支氣管哮喘的發生及發展與多種易感基因密切相關[14]。

近年發現的支氣管哮喘易感基因為ADAM33基因，ADAM33豐富地表達于間質細胞及平滑肌細胞，較少表達于上皮細胞。ADAM33基因位于20號染色體短臂(20p13)，包含21個內含子和22個外顯子，跨度為14 kb，ADAM33中包含813個氨基酸，通過內肽酶切割為成熟蛋白。ADAM33前體蛋白含有細胞內糖蛋白結構域、跨膜結構域、解整合素結構域、金屬蛋白酶結構域等保守的結構域，通過這些結構域在信號傳導、細胞融合、金屬蛋白酶活性調控等方面起重要作用。研究表明，支氣管哮喘患者肺功能下降及氣道高反應性與ADAM33蛋白水解酶活性提升相關，ADAM33蛋白水解酶參與氣道重塑和不可逆性狹窄等病理過程[15-17]。支氣管哮喘主要是由于氣道氣流受阻、氣道平滑肌纖維增生等，導致氣道重塑和不可逆性狹窄，而ADAM33 mRNA在支氣管平滑肌細胞、肌纖維母細胞、成纖維細胞中呈高表達狀態，提示支氣管哮喘患者氣道重塑和不可逆性狹窄很可能與ADAM33基因有關[18]。PUXEDDU等[19]發現，ADAM33基因可促進血管生成，ADAM33基因是組織重塑基因，與氣道重塑有關。

研究顯示，ADAM33基因的單核苷酸多態性與支氣管哮喘的遺傳易感性有關，T2位點位于第20個外顯子，第744個氨基酸由脯氨酸變為絲氨酸，堿基改變是由A替代G，單核苷酸多態性存在連鎖不平衡，ADAM33基因中的哪個單核苷酸多態性在支氣管哮喘中起主導作用難以確定[20-22]。本研究對研究組和對照組ADAM33基因T2位點3種基因型進行Hardy-Weinberg平衡定律檢驗，結果均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)，說明兩組試驗對象有很好的均衡性。研究組與對照組ADAM33基因T2位點基因型(AA、AG、GG)頻率比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，說明ADAM33基因T2位點與支氣管哮喘易感性有關。

JONGEPIER等[23]隨訪支氣管哮喘患者20年，分析ADAM33基因的9種單核苷酸多態性對患者肺功能的影響，發現ADAM33基因不僅與支氣管哮喘易感性有關，還與支氣管哮喘患者疾病嚴重程度密切相關。本研究對危重、重度、中度、輕度支氣管哮喘患者進行ADAM33基因T2位點基因型頻率分析，結果顯示，中度、重度、危重支氣管哮喘患者ADAM33基因T2位點AG基因型頻率高于輕度支氣管哮喘患者，差異均有統計學意義(P<0.05)，提示ADAM33基因T2位點AG基因型頻率增加是影響支氣管哮喘嚴重程度的高危因素(P<0.05)。ADAM33基因T2位點等位基因中，研究組A等位基因頻率(15.42%)低于對照組(23.75%)，差異有統計學意義(P<0.05)，提示ADAM33基因T2位點A等位基因頻率增加可降低支氣管哮喘患病風險(OR=0.875，P<0.05)。李曉等[24]對重度、中度、輕度支氣管哮喘患者進行ADAM33基因T2位點基因型頻率及基因分布分析，發現T2位點等位基因中，支氣管哮喘患者A等位基因頻率高于健康人群，重度和中度支氣管哮喘患者AG基因型頻率均高于輕度支氣管哮喘患者，得出罹患支氣管哮喘的高危因素是A等位基因頻率增加，影響支氣管哮喘嚴重程度的高危因素是AG基因型增加，與本研究結果有所不同。

綜上所述，支氣管哮喘與ADAM33基因位點多態性存在關聯：ADAM33基因T2位點與支氣管哮喘易感性有關，ADAM33基因T2位點A等位基因頻率增加可降低支氣管哮喘的患病風險，ADAM33基因T2位點AG基因型是影響支氣管哮喘嚴重程度的高危因素。今后研究可選擇更多位點探討ADAM33基因單核苷酸多態性與支氣管哮喘的關聯，探討其在支氣管哮喘中的發病機制。