異型淋巴細胞、EB病毒及TLR7聯合檢測在兒童傳染性單核細胞增多癥中的診斷價值

林 珊,郭三平,江心怡,莫紅梅

深圳市羅湖醫院集團醫學檢驗中心，廣東深圳 518000

傳染性單核細胞增多癥(IM)是常見急性傳染病，主要是由于EB病毒(EBV)感染造成的，兒童為高發人群，導致發熱、咽峽炎、淋巴結腫大等[1]。該病病程具有自限性，一般預后良好，但是其臨床表現變化多樣，且涉及多個系統，早期易誤診或漏診，若治療不及時易導致繼發其他惡性疾病或嚴重并發癥[2]。近年的免疫學研究顯示，EBV能逃避免疫系統識別，成功侵入B淋巴細胞，造成外周血淋巴細胞計數及形態的改變，因此血細胞形態學檢測對臨床診治IM具有重要意義[3]。隨著生物學技術發展，EBV-DNA檢測也被用于IM的診斷，其負荷量能夠反映EBV復制水平，具有較高的特異性[4]。Toll樣受體(TLR)是一種模式識別受體，在EBV感染早期能夠識別病毒蛋白，在機體免疫應答中發揮一定作用，TLR7還可識別單鏈RNA病毒，誘導抗病毒反應或炎性反應[5]。基于此，本研究對IM患兒外周血細胞形態學檢測結果、TLR7 mRNA及EBV-DNA水平進行分析，探討3項指標聯合檢測在IM中的診斷價值，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2020年1月至2021年10月來本院就診的IM患兒119例作為IM組，納入標準：(1)符合IM診斷標準[6]；(2)均為初診病例；(3)能配合研究。排除標準：(1)伴有惡性腫瘤患兒；(2)患有嚴重血液疾病患兒；(3)伴有嚴重心、肺、肝功能障礙患兒；(4)存在精神疾病患兒；(5)存在免疫缺陷患兒；(6)發育遲緩或先天畸形患兒。選擇同期來本院體檢的健康兒童50例作為對照組。兩組患兒的一般資料比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。本研究經本院醫學倫理委員會同意，所有研究對象家屬均知情同意。

表1 兩組患兒一般資料比較(n/n或

1.2方法

1.2.1外周血細胞形態學檢測 所有受試者入院時采集外周靜脈血2 mL，采用EDTA-K2抗凝，進行血涂片，瑞氏-姬薩姆染液(珠海貝索公司)染色，待血片自然干燥后，油鏡鏡檢。由具備血液細胞學檢測資質的檢驗師進行閱片，觀察血細胞形態，進行淋巴細胞計數，并在顯微鏡下計數100個白細胞，得到異型淋巴細胞比值。陽性標準：異型淋巴細胞比值>10%。

1.2.2外周血EBV-DNA載量檢測 所有受試者入院時采集外周靜脈血2 mL，置于EDTA-K2抗凝管中，采用實時熒光定量PCR(RT-qPCR)儀檢測EBV-DNA載量。PCR擴增條件：50 ℃靜止2 min，1個循環(進行UNG酶反應)；94 ℃預變性5 min，1個循環(進行Tap酶活化)；再94 ℃變性15 s，57 ℃變性31 s，共10個循環，最后94 ℃變性30 s；55 ℃變性45 s，共30個循環。按照試劑盒說明書，以≥1×103copy/mL為陽性。

1.2.3TLR7 mRNA檢測 所有受試者入院時采集外周靜脈全血2 mL，常規抗凝后，將外周血單個核細胞(PBMC)進行分離備用。采用RT-qPCR進行TLR7 mRNA檢測。采用Trizol試劑盒提取總RNA，并反轉錄為cDNA。RT-qPCR引物序列：正向，5′-ATTGTGAAGTCCAGACTCTTTGTC-3′；反向，5′-CCTGCTGCCAGTGGCTGACCAGT-3′。體系為20.0 μL：10.0 μL TaqⅡ qPCR，0.4 μL 10 μmol/L PCR上游引物，0.4 μL 10 μmol/L PCR下游引物，2.0 μL cDNA模板和7.2 μL去酶水。RT-qPCR反應條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性20 s，52 ℃退火10 s，72 ℃延伸2 min，共36個循環。TLR7 mRNA表達水平以2-ΔΔCt方法計算。

1.3觀察指標 (1)收集所有受試者的一般資料；(2)比較IM組與對照組的外周血細胞形態學檢測結果、TLR7 mRNA表達水平及EBV-DNA載量；(3)比較IM組中不同EBV-DNA載量患兒的外周血細胞形態學檢測結果及TLR7 mRNA表達水平；(4)分析外周血細胞形態學檢測結果、TLR7 mRNA表達水平與EBV-DNA載量的相關性；(5)分析異型淋巴細胞比值、TLR7 mRNA表達水平及EBV-DNA載量對IM的診斷價值。

2 結 果

2.1兩組外周血細胞形態學檢測結果、EBV-DNA載量及TLR7 mRNA表達水平比較 IM組的淋巴細胞計數、異型淋巴細胞比值、EBV-DNA載量及TLR7 mRNA表達水平均高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 兩組外周血細胞形態學檢測結果、EBV-DNA載量及TLR7 mRNA表達水平比較

2.2IM組中不同EBV-DNA載量患兒的外周血細胞形態學檢測結果及TLR7 mRNA表達水平比較 以IM組患兒的EBV-DNA中位水平7.18×103copy/mL為界值，將≥7.18×103copy/mL的患兒納入高載量組(60例)，<7.18×103copy/mL的患兒納入低載量組(59例)。兩組淋巴細胞計數比較，差異無統計學意義(P>0.05)，高載量組的異型淋巴細胞比值及TLR7 mRNA表達水平高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 IM組中不同EBV-DNA載量患兒的外周血細胞形態學檢測結果及TLR7 mRNA表達水平比較

2.3外周血細胞形態學檢測結果、TLR7 mRNA表達水平與EBV-DNA載量的相關性 淋巴細胞計數與EBV-DNA載量無明顯相關性(P>0.05)，異型淋巴細胞比值及TLR7 mRNA表達水平與EBV-DNA載量呈正相關(P<0.05)，見表4。

表4 外周血細胞形態學檢測結果、TLR7 mRNA表達水平與EBV-DNA載量的相關性

2.4異型淋巴細胞比值、EBV-DNA載量及TLR7 mRNA對IM的診斷價值 ROC曲線分析發現，3項指標聯合診斷IM的曲線下面積(AUC)為0.952，高于單一的異型淋巴細胞比值、EBV-DNA載量及TLR7 mRNA的AUC(0.863、0.878、0.792)，見圖1、表5。

圖1 異型淋巴細胞比值、EBV-DNA載量及TLR7 mRNA診斷IM的ROC曲線

表5 異型淋巴細胞比值、EBV-DNA載量及TLR7 mRNA診斷IM的效能分析

3 討 論

IM是由EBV感染引起的急性增生性傳染病，傳播途徑為唾液及血液。EBV感染可引起全身性免疫異常，累及多個器官，同時還能逃避機體的免疫反應，在人體淋巴組織中潛伏，使患者長期攜帶病毒[7-8]。研究表明我國IM多見于兒童，小于12歲兒童的發病率可達60%，多數患兒起病時癥狀輕微，無特異性臨床表現，在臨床診斷中極易出現漏診或誤診情況，而治療不及時可能引起其他嚴重并發癥，進而威脅患兒生命，因此早期的準確診斷十分關鍵[9]。而目前的診斷方式仍是以實驗室檢查為主，但每種檢查方法都有方法學的限制，聯合檢查是如今臨床對疾病進行診斷的發展趨勢。

研究表明當EBV入侵人體時，B淋巴細胞受體會與其結合，隨后病毒增殖、復制，進一步激活抑制性T淋巴細胞的增殖、自身轉化，由于細胞毒性效應，使異常增殖的T淋巴細胞發生形態學的改變，形成異型淋巴細胞，該類細胞一般分為幼稚型、不規則型、空泡型3種形態[10-11]。外周血細胞形態學檢測具有臨床實用性，有報道指出EBV感染患兒外周血異型淋巴細胞計數明顯升高[12]。本研究中，IM組的淋巴細胞計數、異型淋巴細胞比值均高于對照組，這與前人研究具有一致性[12]。研究表明，異型淋巴細胞普遍出現在IM發病后3 d，于第1周漸漸加多，其比值能夠達10%，在第2～3周最多可達40%，因此外周血細胞形態學檢測有利于IM早期診斷[13]。還有研究認為異型淋巴細胞在其他疾病，如腺病毒、肝炎病毒、巨細胞病毒等導致的感染性疾病中也存在增多現象，因此還需聯合其他手段輔助IM的診斷[14]。

近年來RT-qPCR檢測EBV-DNA成為檢測EBV感染的重要手段，該方式能夠有效擴增，并對每個循環中的PCR產物進行實時監測，可以將病毒的拷貝數準確檢測出來，并能反映EBV感染，具有較高的特異性及準確性，且重復性好、操作簡便[15]。黃璐[16]研究表明EBV-DNA載量在診斷IM中具有較高臨床應用價值。本研究中，IM組的EBV-DNA載量高于對照組，提示IM患兒感染后，EBV-DNA水平顯著升高。研究表明，對于臨床癥狀不典型、血清學不能診斷的疑似IM患兒進行EBV-DNA檢測，能夠對發熱初期的IM患兒早期診斷，避免抗菌藥物的濫用及并發癥的發生[17]。同時本研究發現，高載量組的異型淋巴細胞比值高于低載量組，異型淋巴細胞比值與EBV-DNA載量呈正相關，這提示患兒體內EBV-DNA載量與異型淋巴細胞比值有關。研究表明，EBV-DNA載量與IM患兒病情嚴重程度有關，其水平能夠反映病毒復制能力及患兒免疫清除能力，病毒載量越高，患兒病情越嚴重，機體免疫功能越差，異型淋巴細胞比值也顯著升高[18]。

研究表明EBV感染與患兒免疫功能有很大關系，而TLR7在固有免疫和適應性免疫中起著重要的橋梁作用[19]。IM組TLR7 mRNA表達水平高于對照組，高載量組的TLR7 mRNA表達水平高于低載量組，提示EBV感染能升高TLR7 mRNA表達水平。研究表明髓樣樹突狀細胞可通過TLR7識別EBV衍生的單鏈RNA，然后募集下游信號、分子，刺激初始T淋巴細胞分化成特異性的細胞毒性T淋巴細胞、調節性T淋巴細胞等，從而發揮抗病毒作用[20]。本研究ROC曲線分析發現，異型淋巴細胞比值、EBV-DNA載量及TLRI mRNA聯合診斷IM時的AUC為0.952，高于單一的異型淋巴細胞比值、EBV-DNA載量及TLR7 mRNA的0.863、0.878、0.792，提示3項指標聯合診斷IM的效能更佳。吳菲等[21]研究表明EBV衣殼蛋白(EBV-CA)IgM抗體、EBV-DNA及外周血異型淋巴細胞比值聯合檢測診斷兒童IM能顯著提高特異度，有助于降低誤診率，這與本研究結果類似。當然本研究也存在一些不足，本研究為回顧性研究，研究對象的選擇容易產生誤差和偏倚，且本研究樣本量較少，今后將聯合多中心，擴大樣本量，進行前瞻性研究。

綜上所述，IM患兒的淋巴細胞計數、異型淋巴細胞比值、EBV-DNA載量及TLR7 mRNA表達水平均高于健康兒童，異型淋巴細胞比值、TLR7 mRNA表達水平均與EBV-DNA載量有一定關系，3項指標聯合檢測能提高診斷IM的效能。