血清Sema 5A、RVE1水平與橋本甲狀腺炎患者Th17相關因子、甲狀腺功能及相關抗體的相關性研究

向慧敏，鄭春梅，李 筱，王思繁，饒琴琴

陜西省漢中市中心醫院精準醫學診斷中心，陜西漢中 723000

橋本甲狀腺炎(HT)是獲得性甲狀腺功能減退(簡稱甲減)的最常見原因，典型表現為甲狀腺腫大和甲減相關癥狀，少數患者會出現呼吸困難、吞咽困難、聲帶麻痹或面部水腫等[1]。HT的特征是特異性自身抗體抗甲狀腺球蛋白抗體(TgAb)和甲狀腺過氧化物酶抗體(TPOAb)水平升高，甲狀腺激素產生減少和彌漫性甲狀腺腫，部分患者伴甲狀腺激素產生減少[2]。HT被認為是一種自身免疫性疾病，HT患者甲狀腺組織中可觀察到大量淋巴細胞，而淋巴細胞浸潤引起的組織纖維化是導致甲狀腺彌漫性腫大的主要原因[3]。輔助性T細胞(Th)17是CD4+T細胞亞群，參與適應性免疫反應，與自身免疫性疾病發病密切相關[4]。自身免疫性甲狀腺疾病患者甲狀腺濾泡細胞中Th17標志性細胞因子白細胞介素(IL)-17水平明顯升高[5]。血清神經軸突導向分子5A(Sema 5A)屬于信號蛋白家族成員之一，具有免疫調節作用，在免疫細胞激活、增殖，促炎細胞因子的產生過程中起重要作用[6]。溶解素E1(RVE1)是一種內源性脂質介質，在微生物感染誘導的膿毒癥炎癥模型中可增加巨噬細胞吞噬活性，清除細菌，促進炎癥消退[7]。RVE1還可抑制效應性T細胞分化，促使調節性T細胞增殖，在適應性免疫中發揮調節作用[8]。本研究擬探討血清Sema 5A、RVE1水平與HT患者甲狀腺功能、Th17相關因子以及TgAb、TPOAb的相關性，以期為病情評估和治療提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2019年2月至2021年8月本院收治的109例HT患者(HT組)。其中男28例，女81例；年齡32～55歲，平均(45.02±7.82)歲；體質量指數21～25 kg/m2，平均(23.02±1.11)kg/m2；家族病史23例。納入標準：(1)典型甲減癥狀和體征，頸部超聲提示甲狀腺彌漫性病變，TgAb、TPOAb水平升高；(2)首次經臨床診斷為HT，符合《中國甲狀腺疾病診治指南：甲狀腺炎》診斷標準[9]。排除標準：(1)急慢性感染；(2)類風濕關節炎、系統性紅斑狼瘡、多發性硬化癥等其他自身免疫性疾病；(3)Graves病、單純性甲狀腺腫、甲狀腺癌[10]。根據甲狀腺功能將HT患者分為甲狀腺功能正常組[促甲狀腺激素(TSH)、游離三碘甲狀腺原氨酸(FT3)、游離甲狀腺素(FT4)水平正常]39例、亞臨床甲減組(TSH水平升高，FT3、FT4水平正常)47例，臨床甲減組(TSH水平升高，FT3、FT4水平降低)23例。另選擇58例體檢健康者為對照組，均排除甲狀腺疾病、自身免疫性疾病、惡性腫瘤、感染性疾病等。其中男13例，女45例；年齡30～52歲，平均(44.89±6.73)歲；體質量指數20～25 kg/m2，平均(22.97±1.23)kg/m2。HT組和對照組一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究獲得本院倫理委員會批準，所有研究對象均知情同意并且簽署同意書。

1.2方法 所有HT患者入組后24 h內采集靜脈血完善實驗室檢查，對照組于體檢當日清晨采血。血標本處理：采集血標本(3 mL)注入干燥試管，室溫下靜置30～60 min，待血液凝固后取上層液體離心(2 000 r/min，半徑10 cm，時間5 min)獲取血清后上機檢測。取肝素抗凝試管中保存的標本(2 mL)，采用血細胞分離機(Ficoll密度離心法)分離外周血中單個核細胞(PBMC)，調節細胞密度在1×106/mL左右，5% CO2，37 ℃培養24 h，加入CD4、CD3、CD25單克隆抗體(購自美國BD公司)混勻后避光靜置30 min。

采用Cobas E411電化學發光全自動免疫分析系統(瑞士羅氏公司)，運用電化學發光免疫法測定血清TSH、FT3、FT4、TPOAb和TgAb水平，試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司。正常參考范圍：TSH為0.27～4.20 IU/L，FT3為3.1～6.8 pmol/L，FT4為12～22 pmol/L，TPOAb為0～34 IU/mL，TgAb為0～115 IU/mL。采用Multiskan FC全自動酶標儀(美國賽默飛公司)運用酶聯免疫吸附試驗檢測血清Sema 5A、RVE1、IL-17、IL-23水平，試劑盒購自美國賽默飛公司。采用EPICS-XL流式細胞儀檢測Th17占比。

2 結 果

2.1HT組、對照組實驗室指標比較 HT組血清Sema 5A、IL-23、IL-17、TSH、TgAb、TPOAb水平，以及外周血Th17占比高于對照組(P<0.05)，血清RVE1、FT3、FT4水平低于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 HT組、對照組實驗室指標比較

組別nTSH(IU/L)FT3(pmol/L)FT4(pmol/L)TgAb(IU/mL)TPOAb(IU/mL)HT組1094.64±1.034.24±1.0414.84±2.96293.26±35.26215.44±18.24對照組582.02±0.564.65±1.2516.02±3.2612.02±2.355.62±1.32t12.8202.3132.36760.58887.362P<0.0010.0220.019<0.001<0.001

2.2HT各亞組間實驗室指標比較 臨床甲減組血清Sema 5A、IL-23、IL-17、TSH、TgAb、TPOAb水平，外周血Th17占比高于亞臨床甲減組、甲狀腺功能正常組(P<0.05)，血清RVE1、FT3、FT4水平低于亞臨床甲減組、甲狀腺功能正常組(P<0.05)。亞臨床甲減組血清Sema 5A、IL-23、IL-17、TSH、TgAb、TPOAb水平，外周血Th17占比高于甲狀腺功能正常組(P<0.05)，血清RVE1水平低于甲狀腺功能正常組(P<0.05)，FT3、FT4水平與甲狀腺功能正常組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 HT各亞組間實驗室指標比較

組別nTSH(IU/L)FT3(pmol/L)FT4(pmol/L)TgAb(IU/mL)TPOAb(IU/mL)甲狀腺功能正常組393.51±0.304.82±0.7716.23±2.58270.62±12.77205.12±5.65亞臨床甲減組474.93±0.49*4.75±0.6915.94±3.42302.49±18.02*218.39±16.05*臨床甲減組235.94±0.20*#2.21±0.10*#10.25±0.28*#312.79±10.57*#226.91±5.73*#F319.90553.33641.23873.61229.176P<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

2.3HT患者血清Sema 5A、RVE1水平與其他實驗室指標的相關性 HT患者血清Sema 5A水平與外周血Th17占比及IL-23、IL-17、TSH、TgAb、TPOAb呈正相關(P<0.05)，RVE1水平與外周血Th17占比及IL-23、IL-17、TSH、TgAb、TPOAb呈負相關(P<0.05)，Sema 5A、RVE1水平與FT3、FT4無明顯相關性(P>0.05)。見表3。

表3 HT患者血清Sema 5A、RVE1水平與其他實驗室指標的相關性

續表3 HT患者血清Sema 5A、RVE1水平與其他實驗室指標的相關性

3 討 論

HT是引起自身免疫性甲狀腺疾病和甲減的最常見原因，與環境、藥物、妊娠、營養和傳染病等多種因素有關，目前HT的治療方式以甲狀腺激素治療為主，但接受甲狀腺激素替代治療后患者仍會出現相關臨床癥狀，嚴重影響生活質量[11]。TgAb、TPOAb常見于自身免疫性甲狀腺疾病患者血清中，TgAb、TPOAb的存在不僅影響甲狀腺組織，導致甲狀腺功能異常，還影響糖脂代謝，導致機體其他組織或器官損害[12]。Th17在HT發病中起著至關重要的作用，甲狀腺內Th17浸潤與甲減以及局部纖維化密切相關[13]。IL-17和IL-23是Th17關鍵的細胞因子，其中IL-17是Th17的效應細胞因子，而IL-23參與幼稚CD4+T細胞誘導Th17發育過程，還可擴大Th17群并維持其存活，IL-23/IL-17軸已被研究證實參與HT發病和進展過程[14]。

Sema 5A屬于Semaphorins信號蛋白家族中第5類信號素，可通過促進內皮細胞增殖和抑制其凋亡，促進血管生成，還可促使上皮間充質轉化，參與腫瘤細胞增殖、遷移過程[15]。Sema 5A還可調節神經元興奮傳導和突觸形成，與強迫癥的嚴重程度有關[16]。在自身免疫性疾病中Sema 5A也具有重要作用，現有報道顯示類風濕關節炎患者血清Sema 5A水平明顯升高，Sema 5A通過誘導巨噬細胞向破骨細胞分化，促使類風濕關節炎疾病活動度增加以及關節破壞[17]。原發性免疫性血小板減少癥患者血漿Sema 5A水平升高，Sema 5A通過下調其受體plexin-B3表達促使Th1分化和疾病活動度增加[18]。本研究發現HT患者血清Sema 5A水平也出現異常，明顯高于對照者，且臨床甲減組血清Sema 5A水平高于亞臨床甲減組、甲狀腺功能正常組，Sema 5A水平與TgAb、TPOAb、TSH呈正相關，說明Sema 5A參與HT發病過程，Sema 5A水平越高，HT患者特異性自身抗體水平越高，甲狀腺功能越差。Sema 5A參與HT發病的機制尚不清楚，本研究相關性分析結果顯示，Sema 5A與IL-17、IL-23呈正相關，表明Sema 5A可能在HT免疫反應中起到重要作用，推測Sema 5A通過激活T細胞，促使Th17分化和細胞因子IL-17、IL-23產生，活化IL-17/IL-23軸，IL-23進一步誘導Th17增殖分化，擴大Th17群，加劇免疫反應和炎性反應，促使HT發病和進展[19]。

RVE1是促使炎癥消退的內源性介質，炎癥應激下二十碳五烯酸轉化為18R-氫-二十碳五烯酸的過程中可產生特異性促炎癥消退介質(SPM)，SPM被白細胞活化產生RVE1，RVE1通過降低中性粒細胞趨化性，抑制炎癥部位淋巴細胞聚集，增強巨噬細胞吞噬功能等促使炎癥消退[20]。RVE1與多種炎癥性疾病有關，RVE1可減少炎癥性骨吸收，抑制破骨細胞增殖，促使成骨細胞生成，參與骨重塑過程[21]。RVE1還可促使抗炎細胞因子IL-10產生，抑制促炎介質IL-6、干擾素-γ、IL-17等表達，控制單純皰疹病毒引起的間質角膜炎病情[22]。在牙周炎小鼠模型中，早期給予RVE1可抑制牙齦組織中T細胞浸潤，降低Th17細胞占比和牙齦組織中IL-6、IL-17 mRNA表達[8]。RVE1在HT發病機制的研究十分少見，其間關系尚不清楚，本研究發現HT患者血清RVE1水平明顯低于對照者，且RVE1水平與TgAb、TPOAb、TSH呈負相關，提示RVE1缺失可能與HT自身抗體產生以及甲減有關。進一步分析顯示，RVE1水平與IL-17、IL-23呈負相關，表明RVE1可能調控Th17分化以及相關細胞因子IL-17、IL-23表達，參與HT免疫反應過程。ONER等[23]報道，RVE1可通過抑制IL-6、轉化生長因子-β阻止CD4+T細胞活化，減少IL-17的合成，抑制免疫反應，促使炎性反應消退。SAWADA等[24]的研究結果表明，RVE1可抑制樹突狀細胞和γδ T細胞分化，抑制IL-17和IL-23的合成，減少炎癥細胞浸潤。RVE1缺失可能導致Th17過度分化，使IL-17、IL-23生成增加，加劇免疫失調和炎性反應，導致HT發生。

綜上所述，HT患者血清Sema 5A水平升高，RVE1水平降低。Sema 5A過度合成，RVE1缺乏與HT特異性自身抗體TgAb、TPOAb產生及甲減有關。Sema 5A、RVE1可能通過調控Th17分化以及IL-17、IL-23表達參與HT發病過程。