豬鏈球菌2型HNB-LAMP檢測方法的建立

席小燕，陳家享，梁嘉雯，林 蝶，伍嘉慧，段昌平，陳家苑， 彭 凌

（1.韶關學院 醫學院，廣東 韶關 512026；2.韶關學院 英東生物與農業學院，廣東 韶關 512005）

豬鏈球菌（Streptococcus suis）是一種重要的人畜共患病病原體，可引起豬和人的腦膜炎、敗血癥、肺炎等嚴重的臨床疾病［1-2］. 豬鏈球菌病成了養豬業及豬肉行業中的一種職業病，在東南亞國家，普通人群面臨的風險主要是由于與動物的密切接觸或食用生豬肉產品［3-5］. 到目前為止，已鑒定出33個豬鏈球菌血清型（1~31、1/2和33）［6-8］，最常見的是從全世界豬和人的臨床病例中分離出來血清型2型［9-11］.

快速準確檢測豬鏈球菌2型對于這種感染的早期診斷和治療非常重要，但常用的細菌培養方法分離和鑒定耗時；基于PCR的檢測方法表現出對豬鏈球菌的高度敏感和特異，但需要昂貴的儀器、復雜的技術和煩瑣的操作，不適合現場檢測和基層推廣［12-14］. 因此，迫切需要建立一種簡便、快速、經濟的檢測豬鏈球菌2型的方法. 環介導等溫擴增（LAMP）法是Notomi等人開發的一種新型的恒溫核酸擴增方法［15］，不需要進行煩瑣的變性、延伸、退火等溫度變化的過程，只需恒溫操作，無需借助PCR儀，擴增產物可以經過直接觀察沉淀量或者加入染料觀察顏色改變等進行檢測，很適合基層使用.

筆者選擇2型豬鏈球菌cps2J基因序列設計篩選LAMP引物組，通過體系優化建立檢測方法，同時考慮到LAMP擴增產物的檢測方法多樣且檢測的結果可能受到各種因素的影響［16］，在豬鏈球菌2型LAMP方法建立中比較了肉眼觀察沉淀、瓊脂糖凝膠電泳、SYBR Green Ⅰ以及羥基萘酚藍（HNB）等檢測方法的敏感性，建立了豬鏈球菌2型“量身定制”的快速LAMP檢測方法.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用菌株均為實驗室保存. 12株經標準血清和血清型特異PCR鑒定的豬鏈球菌血清型1、2、7和9型（2型9株，其它血清型各1株）. 另有5株陰性對照菌株：豬丹毒絲菌、副豬嗜血桿菌、豬鼻支原體、胸膜肺炎放線桿菌、肺炎鏈球菌. Taq PCR Master Mix、dNTPs、細菌基因組DNA快速抽提試劑盒（B518225）、8 U Bst DNA聚合酶等均購自生工生物工程（上海）股份有限公司.

1.2 引物的設計和合成

根據GenBank公布的豬鏈球菌2型的cps2J基因的保守序列，采用在線引物設計 軟 件（https：//LAMP.neb.com）設 計LAMP引 物，另外，根據cps2J基因的保守序列設計特異的PCR檢測引物，序列見表1，引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成.

表1 引物序列設計

1.3 DNA提取

過夜培養的菌液取1 mL，離心收集菌體按照“1.1”試劑盒的說明書提取各樣品基因組DNA.

1.4 LAMP 反應體系條件的優化

25 μL初 始 反 應 體 系：10×Thermo-Pol buffer 2.5 μL，100 mmol·L-1的MgSO41.5 μL，10 mmol·L-1dNTPs 3.5 μL，40 μmol·L-1內引物（FIP/ BIP）各1 μL，5 μmol·L-1外引物（F3/B3）各1 μL（引物濃度比8∶1），20 μmol·L-1環引物（LF/LB）1 μL，8 U Bst DNA 聚合酶1 μL，3 mmol·L-1的HNB 1 μL，剩余用水補足，混勻. 65 ℃恒溫反應1 h，80 ℃滅活10 min. 同時以無核酸水作為陰性對照. 在此反應體系的基礎上優化LAMP反應條件，使用從豬鏈球菌2型菌株提取的DNA作為模板，對孵育溫度（60~65 ℃）、反應時間（20~80 min）、鎂離子濃度（2~10 mmol·L-1）、dNTPs 濃度（1~5 mmol·L-1）和引物濃度比（FIP/BIP∶F3/B3）等條件進行優化.

1.5 LAMP產物分析

（1）肉眼觀察沉淀. LAMP反應結束后，5 000 r·min-1離心數秒后，若出現白色沉淀則被認為是陽性.

（2）瓊脂糖凝膠電泳. LAMP反應結束后，產物進行2%瓊脂凝膠電泳，用凝膠成像系統觀察條帶，如果樣本顯示出典型的階梯狀帶型，則被認為是陽性.

（3）SYBR Green Ⅰ檢測. LAMP反應后，加入1 μL SYBR Green Ⅰ，如果溶液變成綠色，則為陽性；如果溶液變成橙色，則為陰性［16］.

（4）HNB檢測. HNB被預先加入LAMP系統（終濃度120 μmol·L-1），觀測顏色，天藍色為陽性，紫色為陰性［16］.

1.6 LAMP敏感性

豬鏈球菌2型菌株的培養菌液經計數后進行10倍梯度稀釋至10-7（原始濃度為8×106CFU·μL-1），稀釋菌液煮沸10 min后各取1 μL上清作為模板按優化體系和條件進行LAMP擴增，分別采用肉眼觀察沉淀、瓊脂糖凝膠電泳、SYBR Green Ⅰ 和HNB等對LAMP擴增產物進行檢測，比較它們的檢測敏感性，同時以無核酸水作為陰性對照. 為評估LAMP的敏感性，同時采用普通PCR檢測上述梯度的模板（即用普通PCR檢測法來進行比較），PCR反應體系25 μL：Taq PCR Master Mix 12.5 μL，10 μmol·L-1的引物各1 μL；擴增程序：94 ℃，5 min；94 ℃，45 s；54 ℃，30 s；72 ℃，60 s，循環30次；最后72 ℃延伸10 min，產物用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測.

1.7 LAMP特異性

采用優化好的LAMP體系，對12株豬鏈球菌和5株陰性對照菌株的基因組DNA，進行LAMP擴增，驗證該方法鑒定出豬鏈球2型菌株的特異性.

1.8 臨床樣本檢測

采集豬的組織作為檢測樣品. 樣品預處理：剪成小塊后加入少量PBS緩沖液經研缽研碎，加PBS稀釋，煮沸 10 min，靜置或離心后，上清液可以作為檢測模板.

2 結果

2.1 LAMP最優反應體系條件

在不同 條件下 進行了 實 驗，最 終確 定 最優 反 應體 系 條件為：100 mmol·L-1的MgSO42.5 μL， 10 mmol·L-1dNTPs 4.0 μL，10×Thermo-Pol buffer 2.5 μL，30 μmol·L-1內引物（FIP/BIP）各1 μL， 5 μmol·L-1外引物（F3/B3）各1 μL（引物濃度比6∶1），20 μmol·L-1環引物（LF/LB）1 μL，8 U Bst DNA 聚合酶 1 μL，3 mmol·L-1的HNB 1 μL，剩余用水補足，混勻. 61 ℃恒溫反應50 min，80 ℃滅活10 min.

2.2 4種LAMP擴增產物檢測方法的敏感性

各稀釋度模板經LAMP擴增后，各管經離心，在100~10-5稀釋度可見明顯沉淀，在10-6~10-7稀釋度未見肉眼可以沉淀. 各稀釋度LAMP擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳結果顯示在100~10-6稀釋度均可以看到典型的梯度條帶，在10-7稀釋度未見條帶. LAMP擴增完成后加入SYBR Green Ⅰ顯色，在100~10-6稀釋度顯出綠色，在10-7稀釋度顯橙色. 在HNB檢測中，預先在各稀釋度檢測管加入3 mmol·L-1HNB 1 μL，反應結束后在100~10-6稀釋度顯天藍色，在10-7稀釋度顯紫色（圖1 A~D）. 由此可見采用瓊脂糖凝膠電泳、SYBR Green Ⅰ、HNB對產物進行檢測的敏感性相當，均為8 copies/反應，而肉眼觀察沉淀的敏感性為80 copies/反應. 圖1 E為普通PCR檢測的敏感性，僅100~10-4稀釋度可見目的條帶，而10-5~10-7稀釋度未擴增，可見其敏感性為800 copies/反應.

圖1 LAMP不同檢測方法及普通PCR檢測的敏感性比較

2.3 LAMP特異性

為評估LAMP的特異性，用優化的HNB-LAMP檢測系統來擴增菌株提取的DNA. 所有9株豬鏈球菌2型菌株均呈天藍色，而其他豬鏈球菌血清型菌株和陰性對照菌均呈紫色，見圖2，表明實驗建立的cps2J-HNB-LAMP對豬鏈球菌2型具有高度特異性.

圖2 LAMP特異性檢測

2.4 臨床樣品檢測

對10份臨床樣品進行檢測， 結果表明其中5份樣品LAMP檢測為陽性，而普通PCR檢測全為陰性.

3 討論

近年來，基于PCR技術的分子檢測可用于檢測豬鏈球菌2型，但不適合基層推廣使用. 而LAMP檢測有優勢，已被廣泛用于病原檢測，筆者建立了豬鏈球菌2型HNB-LAMP檢測方法，并比較了4種方法對LAMP擴增產物的檢測敏感性.結果發現，4種方法檢測敏感性均高于普通PCR檢測，其中肉眼觀察沉淀法敏感性最低，其它3種方法敏感性相當，但瓊脂糖凝膠電泳法需借助昂貴的電泳及成像系統，不利于基層推廣，同時電泳檢測需開蓋進行，產物會在空氣中產生氣溶膠，在之后的檢測中產生假陽性［16］. SYBR GreenⅠ法不需要任何設備，但同樣要開蓋進行，容易導致檢測假陽性. HNB法反應不需開蓋，不會有氣溶膠溢出，可以減少假陽性，且反應顏色穩定，所以最終選擇HNB法對產物進行檢測. 采用HNBLAMP檢測敏感性可達8 copies/反應，與先前熒光定量PCR檢測豬鏈球菌2型方法相當［14］，比普通PCR檢測的敏感性高了100倍，表明該法特異性好.

把建立的HNB-LAMP檢測方法應用于臨床樣品檢測，結果表明10份臨床樣品，采用LAMP檢測出5份陽性，而采用普通PCR檢測全為陰性，說明LAMP比普通PCR檢測更適合于豬鏈球菌感染的檢測，究其原因是因為LAMP檢測敏感性遠高于普通PCR檢測.同時考慮到臨床樣品檢測如需使用試劑盒提取DNA后進行檢測將會提高費用，并延長檢測時間，實驗中樣品未經試劑盒提取DNA來獲取較純DNA模板，而是僅經過簡單預處理后煮沸10 min取上清液作為檢測模板，表明此方案可行. 該法50 min完成檢測，檢測結果可肉眼觀察，在檢測豬鏈球菌2型方面具有良好的臨床潛力，適合基層單位使用.