五味子醇甲通過Aβ25-35 誘導PC12 細胞損傷對氧化應激及炎癥因子的影響

劉艷麗 周妍妍

阿爾茨海默病（alzheimer’s disease，AD），是一種常見的神經退行性疾病，以漸進性認知障礙為主，伴有明顯的社會生活能力減退，給家庭和社會帶來嚴重負擔。五味子是木蘭科植物五味子的干燥成熟果實，具有補益心腎、寧心安神的作用。五味子的化學成分主要有木脂素、揮發油、有機酸等多種化學成分。五味子醇甲（SCH A）是五味子的主要活性單體成分。研究表明，SCH A 預處理可激活神經元自噬，減輕炎癥反應和氧化應激，增強神經營養活性，發揮神經細胞保護作用[1]。本課題組前期研究顯示，SCH A 對神經細胞萎縮現象改善，腦組織突觸素表達明顯增多，α-突觸核蛋白表達明顯減少，具有神經細胞保護作用[2]。本實驗通過研究SCH A 干預Aβ25-35誘導PC12 細胞損傷，觀察其對AD 模型細胞氧化應激及炎癥因子的影響，探討SCH A 對Aβ25-35誘導PC12 細胞損傷的神經保護作用。

1 實驗材料

1.1 藥 物 五味子醇甲（規格：20 mg，批號SS8180），購于中國索萊寶公司。Aβ25-35（規格：5 mg，批號S41991），購于中國源葉生物公司。

1.2 細 胞 PC12 細胞購自普諾賽。細胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養基于37 ℃、5%CO2的培養箱內培養。

1.3 試 劑 胎牛血清（批號11011-8611），購于中國天杭生物公司。MTT（批號18B120）、細胞凋亡檢測試劑盒（批號17B110）、丙二醛（MDA）試劑盒（批號19A100）、谷胱甘肽（GSH）測定試劑盒（批號06A110）、超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒（批號02A070）、白介素-1β（IL-1β）antibody（批號L1202 0891）、白介素-6（IL-6）antibody（批號L12292841）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）antibody（批號M0111158 1）、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（批號02A120）、全蛋白提取試劑盒（批號17A120）、羊抗兔IgG-HRP（批號23A100），均購于沈陽萬類生物科技有限公司。

1.4 儀 器 CO2培養箱（HF-90，上海力申公司）；酶標儀（800Ts，美國BIOTEK 公司）；流式細胞儀（NovoCyte，美國Aceabio 公司）；電泳儀（DYY-7C，北京六一公司）；凝膠成像系統（WD-9413B，北京六一公司）。

2 實驗方法

2.1 Sch A 干預Aβ25-35誘導PC12 建立細胞損傷及細胞保護模型 Aβ25-35設立空白對照組及1、10、20、30、40 μmol/L 濃度值，作用于PC12 細胞24 h，CCK8檢測細胞增殖情況，流式細胞術檢測細胞凋亡率，根據上述檢測結果確定細胞損傷模型。SCH A 設置1、5、10、15 μg/mL 濃度作用于細胞損傷模型，MTT 和流式細胞術確立SCH A 對損傷細胞的保護濃度。

2.2 分 組 待細胞生長至對數生長期后，將細胞接種于96 孔板。分為空白組、模型組（20 μM Aβ25-35）和SCH A 組（10 μg/mL SCH A+20 μM Aβ25-35）。

2.3 CCK8 檢測細胞活力 細胞培養24h 后加藥處理，用不同終濃度的Aβ25-35（1、10、20、30、40 μM）處理細胞。24 h 后進行CCK-8 檢測。每孔加入10 μL CCK-8，37 ℃，5%CO2的培養箱內培養2 h。在酶標儀上測定其在450 nm 處OD 值，進行數據分析。

2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡率 將細胞培養于6孔板中，用不同終濃度的Aβ25-35（1、10、20、30、40 μM）處理細胞。24 h 后，各組細胞離心后收集，小心吸除上清，用PBS 洗滌細胞2 次，離心后小心吸除上清，重懸細胞。加入AnnexinV-FITC 混勻后，加入10 μL PropidiumIodide，混勻。室溫避光孵育15 min，隨即進行流式檢測。

2.5 MTT 及流式細胞術檢測確立SCH A 實驗濃度

2.5.1 MTT 檢測 細胞接種于96 孔板，每孔細胞量為4×103個，每組設計5 個復孔。細胞培養24 h 后，進行加藥處理，用分別用不同終濃度SCH A 處理24 h 后，再用終濃度為20 μM 的Aβ25-35處理。各組細胞棄去培養基，加入MTT 混合液，置于37 ℃、5%CO2培養箱中孵育4 h。然后吸去上清，加入DMSO，避光靜置10 min 后在酶標儀上測定其在570 nm 處OD值，進行數據分析。

2.5.2 流式細胞術 調整細胞密度，分別用不同終濃度SCH A 處理24 h 后，再用終濃度為20 μM 的Aβ25-35處理。（其余步驟同前2.4）。

2.6 試劑盒檢測氧化相關因子 MDA 采用TBA法，SOD 采用羥胺法，GSH 采用微板法進行檢測。將細胞用PBS 重懸，冰浴條件下超聲破碎，1500 g 離心10 min，取上清檢測。蛋白濃度檢測需先進行標準曲線制備，將0.5 μg/μL 的BSA 蛋白標準液按照不同體積分裝于酶標板各孔，剩余體積用PBS 緩沖液補齊至20 μL。再進行蛋白質待測液制備，待測樣品1 μL 與19 μL PBS 緩沖液混勻。進行BCA 反應，按照A 液∶B 液體積比50∶1 配制BCA 工作液，每孔加200 μL 工作液，于37 ℃反應20 min。570 nm 波長測OD 值。根據標準曲線計算各樣本蛋白濃度，并將細胞統一蛋白濃度。

2.7 Western blot 檢測細胞相關蛋白表達 細胞處理后，用預冷的PBS 輕洗3 次，吸棄PBS；加入RIPA裂解液；按1∶50 比例加入蛋白酶抑制劑；冰上搖晃20 s，用細胞刮子將細胞刮下，將液體和細胞轉移至EP 管中；冰上使用超聲破碎儀，超聲粉碎、離心，將上清移至新EP 管。用BCA 試劑盒測定蛋白濃度。配制丙烯酰胺膠，每孔加30 μg 樣品；電泳；用0.22 μm PVDF 膜；用5%脫脂牛奶（TBST 配制）室溫封閉1 h；按1∶1000 稀釋IL-1β、IL-6、TNF-α，按1∶5000 稀釋β-actin，4 ℃搖床孵育過夜；一抗、二抗作用后，TBST洗3 次，每次10 min，按1∶1 配制顯影液，用凝膠成像儀成像分析。

2.8 統計學方法 應用SPSS 22.0 對實驗數據進行統計分析。符合正態分布的數據以均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析（oneway ANOVA），兩組之間比較采用LSD 檢驗，P＜0.05認為差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 Aβ25-35對PC12 細胞活力的影響 通過CCK8、流式細胞儀聯合檢測，1、10 μmol/L 的Aβ25-35作用于PC12 細胞后，細胞存活率過高，不能誘導出細胞損傷模型。而30、40 μmol/L 的Aβ25-35過度抑制細胞的存活，無法進行后續研究。流式細胞術檢測細胞凋亡率，各濃度組結果與CCK8 近似，最后篩選出20 μmol/L Aβ25-35作用于PC12 細胞后，細胞活力和細胞凋亡率建立細胞損傷模型的效果最佳。與空白組比較，除1 μM Aβ25-35濃度組以外，其余各濃度組的OD 值隨著Aβ25-35濃度的升高而逐漸降低，差異有統計學意義（P<0.05，P<0.01）；比較各濃度組的OD 值，各組間差異有統計學意義（P<0.01）。見表1。

表1 Aβ25-35 誘導下各組PC12 細胞活力比較（）

表1 Aβ25-35 誘導下各組PC12 細胞活力比較（）

注：空白組為正常培養的PC12 細胞；1、10、20、30、40 μM Aβ25-35 各組分別為加入不同濃度Aβ25-35 處理的PC12 細胞；與空白組比較，aP<0.05，bP<0.01；與10 μM Aβ25-35 比較，cP<0.01

3.2 Aβ25-35對PC12 細胞凋亡率的影響 與空白組比較，除1 μM Aβ25-35濃度組以外，其余各濃度組的細胞凋亡率隨著Aβ25-35濃度的升高而逐漸升高，差異有統計學意義（P<0.01）；比較各濃度組的凋亡率，各組間差異有統計學意義（P<0.01）。見表2，圖1。

圖1 Aβ25-35 對PC12 細胞凋亡率的影響

表2 Aβ25-35 誘導下各組PC12 細胞凋亡率比較（%，）

表2 Aβ25-35 誘導下各組PC12 細胞凋亡率比較（%，）

注：空白組為正常培養的PC12 細胞，1、10、20、30、40 μM Aβ25-35 各組為加入不同濃度Aβ25-35 處理的PC12 細胞；與空白組比較，aP<0.01；與10 μM Aβ25-35 比較，bP<0.01

3.3 SCH A 對Aβ25-35誘導的PC12 細胞活力的影響MTT 結果表明，除1 μg/mL SCH A 組外，其他組均可以提高細胞活力，隨著濃度的增加，細胞保護作用逐漸加強。流式細胞術結果表明，1、5 μg/mL SCH A組的細胞凋亡率過高，細胞保護作用較弱，而10、15 μg/mL 濃度組的SCH A 能發揮較好的細胞保護作用，明顯降低細胞凋亡率。結合兩種檢測方法，選擇10 μg/mL 做為本次實驗的藥物濃度。與空白組比較，模型組和各濃度SCH A 組的OD 值均明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，除1 μg/mL SCH A 組外，其余各濃度組的OD 值均明顯升高（P＜0.05，P＜0.01），各組間差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 SCH A 對Aβ25-35 誘導的PC12 細胞活力的影響（）

表3 SCH A 對Aβ25-35 誘導的PC12 細胞活力的影響（）

注：空白組為正常培養的PC12 細胞；模型組為加入20 μmol/L Aβ25-35處理后的PC12 細胞；1、5、10、15 μg/mL SCH A 各組為加入不同濃度SCH A 處理的模型組；SCH A 為五味子醇甲；與空白組比較，aP＜0.01；與模型對照組比較，bP＜0.01

3.4 SCH A 對Aβ25-35誘導PC12 細胞凋亡率的影響與空白組比較，模型組和各濃度的SCH A 組的細胞凋亡率均明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，除1、5 μg/mL 的SCH A 組外，10 和15 μg/mL SCH A 組的細胞凋亡率均明顯降低（P＜0.01）；比較10 和15 μg/mL 兩組，15 μg/mL 的細胞凋亡率更低，差異有統計學意義（P＜0.01）。見表4，圖2。

圖2 SCH A 對Aβ25-35 誘導的PC12 各組細胞凋亡率的影響

表4 SCH A 對Aβ25-35 誘導的PC12 細胞凋亡率的影響（%，）

表4 SCH A 對Aβ25-35 誘導的PC12 細胞凋亡率的影響（%，）

注：空白組為正常培養的PC12 細胞；模型組為加入20 μmol/L Aβ25-35處理后的PC12 細胞；1、5、10、15 μg/mLSCHA 各組為加入不同濃度SCH A 處理的模型組；SCH A 為五味子醇甲；與空白組比較，aP＜0.01；與模型對照組比較，bP＜0.01；與10 μg/mL SCH A 比較，cP＜0.01

3.5 SCH A 對Aβ25-35誘導PC12 細胞SOD、MDA、GSH 的影響 與空白組比較，模型組SOD、GSH 水平下降，MDA 水平升高，差異有統計學意義（P 均＜0.01）；與模型組比較，10 μg/mL SCH A 組SOD、GSH 水平升高，MDA 水平下降，差異有統計學意義（P 均＜0.01）。見表5。

表5 SCH A 對Aβ25-35 誘導的PC12 細胞SOD、MDA、GSH 的影響（）

表5 SCH A 對Aβ25-35 誘導的PC12 細胞SOD、MDA、GSH 的影響（）

注：空白組為正常培養的PC12 細胞；模型組為加入20 μmol/L Aβ25-35處理后的PC12 細胞；10 μg/mL SCH A 組為濃度10 μg/mL SCH A處理的模型組；SOD 為超氧化物歧化酶；MDA 為丙二醛；GSH 為谷胱甘肽；與空白組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01

3.6 SCH A 對Aβ25-35誘導PC12 細胞IL-1β、IL-6、TNF-α 蛋白表達的影響 與空白組比較，模型組IL-1β、IL-6、TNF-α 表達水平明顯升高（P 均＜0.01）；與模型組比較，SCH A 組IL-1β、IL-6、TNF-α 表達水平明顯下降（P 均＜0.01）。見表6，圖3。

圖3 SCH A 對Aβ25-35 誘導的PC12 炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α 的蛋白表達

表6 SCH A 對Aβ25-35 誘導的PC12 炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α 蛋白表達的影響（μg/μL，）

表6 SCH A 對Aβ25-35 誘導的PC12 炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α 蛋白表達的影響（μg/μL，）

注：空白組為正常培養的PC12 細胞；模型組為加入20 μmol/L Aβ25-35處理后的PC12 細胞；10 μg/mL SCH A 組為濃度10 μg/mL SCH A處理的模型組；IL-1β 為白介素-1β；IL-6 為白介素-6；TNF-α 為腫瘤壞死因子；與空白組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01

4 討論

氧化應激是AD 病理過程的重要組成部分。正常情況下，抗氧化劑可能有助于AD 的治療[3]。這些包括SOD、谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）、谷胱甘肽氧還蛋白等。

炎癥反應在AD 的發生發展過程中起到重要作用。在AD 病理發展過程中，小膠質細胞過度活化會釋放大量的TNF-α、IL-1β、IL-6 等炎癥因子，促炎與抗炎穩態平衡被打破，引發慢性持續性炎癥反應，導致神經元損傷和大腦功能障礙[4]。TNF-α 在AD 的炎性反應過程中具有誘發AD 起始及調節細胞因子級聯反應的重要作用，可增強炎癥反應，最終導致神經元損傷。TNF-α 可協同腦內IL-1 和IL-6 促使神經元表達APP 明顯增加，使Aβ 發生沉積，參與腦內炎癥反應[5]。

SCH A 是五味子的主要活性單體成分，有多種藥理作用，其在中樞神經系統的作用最為顯著，對神經退行性疾病（AD、帕金森病）具有潛在的防治作用，如調節改善睡眠作用、抗抑郁作用以及對腦缺血的保護作用等[6]。本研究結果顯示，與模型組比較，SCH A 能提高SOD、GSH 水平，降低MDA 水平；能降低細胞炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α 蛋白表達水平。SCH A 各組的炎癥因子、氧化應激水平均得到明顯改善。

本實驗通過MTT、流式細胞儀檢測確立20 μmol/L Aβ25-35誘導PC12 建立細胞損傷模型，10 μg/mL SCH A 為本次實驗藥物劑量。觀察SCH A 對Aβ25-35誘導PC12 細胞氧化應激及炎癥因子的影響。結果顯示，SCH A 能減輕細胞氧化損傷，提高SOD、GSH 水平，降低MDA 水平；降低細胞炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α 蛋白表達水平，表明SCH A 可通過抗炎、抗氧化，從而發揮神經細胞的保護作用。