活血生肌方外用對大鼠壓力性損傷組織金屬蛋白酶-9及其抑制因子-1 表達的影響

蘇玉娟 潘孫峰 熊 烈 胡衍澤 單云崗 于恩光

壓力性損傷，俗稱壓瘡，是由于皮下組織受長時間的壓力作用導致組織缺血缺氧的結果，若創面累及深部皮下組織、肌肉及骨骼，可導致嚴重感染甚至死亡[1]。壓瘡是常見的難愈性潰瘍之一，屬中醫“瘡瘍”范疇，歷代醫家多主張“祛腐”“活血”“生肌”等法來進行治療。本研究旨在通過檢測壓力性損傷組織中金屬蛋白酶-9（MMP-9）及組織抑制因子-1（TIMP-1）表達水平及Ⅰ型膠原表達量的變化，了解MMP-9 及TIMP-1 與壓力性損傷創面病理變化的關系，進而探討活血生肌方對壓力性損傷的治療機制。

1 實驗材料

1.1 動 物 60 只SPF 級成年雄性SD 大鼠，體質量180～200 g，購買于浙江維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK（浙）2019-0001，委托飼養于本院附屬某醫學院動物實驗中心。通風環境，室溫（25±2）℃，濕度（55±5）%。實驗人員均持有動物實驗許可證，動物福利完全按照國際相關實驗動物法規實施。本研究通過浙江省嘉興市中醫醫院倫理委員會審核，倫理批件號：2019KY0454。

1.2 藥 物 黃凡士林（性狀：膏劑，規格：500 g/罐，由南昌白云藥企有限公司生產，生產批號20211002）。活血生肌方（由當歸、丹參、紅花、黃芪、乳香、沒藥、白芨、白芷、重樓、甘草組成）（配置比例為2∶2∶1∶1.5∶1∶1∶1∶1∶1∶1），粉碎過40 目。藥粉與黃凡士林1∶3 配比，加熱混合制成膏劑，均勻涂抹于紗條上制成膏劑厚度為2 mm 活血生肌紗條，同時制作厚度為2 mm 凡士林紗條。以上均由浙江省嘉興市中醫醫院藥劑科提供并制備。

1.3 試劑與儀器 MMP-9、TIMP-1 二抗DAB 免疫組化試劑盒（批號PV8000D，北京中杉有限公司），一抗ABD-0030 稀釋液（批號211216S963c，福州邁新生物科技開發有限公司）。熒光正置顯微鏡（Zeiss，Axio Scope A1），凝膠成像儀（Tanon 5200 Multi）、蛋白質電泳系統（Bio.Rad），組織均質器（寧波新芝，Scientz-48）。

2 實驗方法

2.1 造 模 大鼠實驗前適應性喂養1 周，應用缺血-再灌注磁片循環壓迫的方式，在大鼠背部建立上下兩個壓瘡模型，通過皮層切口分離肌層，將無菌鐵片植入皮下。大鼠如無感染現象，進行磁鐵施壓。施壓24 h 后，使用無菌刀片劃破受壓皮膚至真皮層，繼續施壓24 h。見圖1。

圖1 大鼠背部建立壓瘡模型示意圖

2.2 分組與給藥 將造模成功的60 只壓瘡模型大鼠背部創面編號，按隨機數表法分為治療組和對照組，每組30 只，治療組大鼠創面常規處理，予活血生肌紗條外敷后用無菌紗布覆蓋，1 次/d，直至實驗結束。對照組大鼠創面常規處理，予凡士林紗條外敷后用滅菌紗布覆蓋，1 次/d，直至實驗結束。

2.3 觀察指標

2.3.1 壓瘡組織MMP-9 及其TIMP-1 表達 分別在換藥第1、3、5、7、9 天各組隨機抽取6 只壓瘡模型大鼠（12 個創面）用腹腔注射100 g/L 水合氯醛（300 mg/kg）的方法麻醉后切取背部創面中心部位處大小為0.3 cm×0.3 cm 的全層皮膚組織。取材后，予大鼠腹腔注射10%水合氯醛0.3 mL/100 g 處死。根據所購試劑盒步驟，采用免疫組化法及Image J 圖像軟件分析測定創面組織中MMP-9 及其TIMP-1 蛋白表達量。

2.3.2 壓瘡組織Ⅰ型膠原蛋白及膠原纖維表達 取各組大鼠創面組織切片，常規脫蠟脫水，Masson 染色，組織膠原纖維呈藍色。顯微鏡下觀察膠原纖維表達情況。采用Image J 圖像分析軟件分析每平方毫米組織中的Ⅰ型膠原及膠原纖維表達量。

2.4 統計學方法 應用SPSS 17.0 統計軟件，正態分布計量資料以均數±標準差（）表示，組間比較采用單因素方差分析；非正態分布計量資料以中位數（P25-P75）表示，組間比較采用Wilcoxon 秩和檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 兩組大鼠瘡面組織MMP-9 表達量比較 換藥第1 天，兩組大鼠創面組織MMP-9 表達差異無統計學意義（P＞0.05）；換藥第3 天開始，治療組大鼠創面組織MMP-9 表達量較對照組降低（P 均＜0.01），見表1、圖2。

圖2 免疫組化法檢測不同方法處理大鼠背部壓力性損傷組織MMP-9（棕黃色）表達（二氨基聯苯胺-蘇木素染色，×100）注：a、b、c、d 分別為凡士林紗布換藥第3、5、7、9 天創面組織MMP-9 鏡下表達情況；A、B、C、D 分別為活血生肌方紗條換藥第3、5、7、9 天創面組織MMP-9 鏡下表達情況；MMP-9 為金屬蛋白酶-9

表1 兩組大鼠創面組織各時間點MMP-9 表達量比較（）

表1 兩組大鼠創面組織各時間點MMP-9 表達量比較（）

注：治療組常規創面處理基礎上給予活血生肌紗條換藥；對照組常規創面處理基礎上給予凡士林紗條外敷；MMP-9 為金屬蛋白酶-9；與對照組比較，aP＜0.01

3.2 兩組大鼠瘡面組織TIMP-1 表達量比較 換藥第1 天，兩組大鼠創面組織TIMP-1 表達差異無統計學意義（P＞0.05）；換藥第3 天開始，治療組大鼠創面組織TIMP-1 含量較對照組升高明顯（P 均＜0.05），見表2、圖3。

圖3 免疫組化法檢測不同方法處理大鼠背部壓力性損傷組織TIMP-1（棕黃色）表達（二氨基聯苯胺-蘇木素染色，×100）注：a、b、c、d 分別為凡士林紗布換藥第3、5、7、9 天創面組織TIMP-1 鏡下表達情況；A、B、C、D 分別為活血生肌方紗條換藥第3、5、7、9 天創面組織TIMP-1 鏡下表達情況；TIMP-1 為組織抑制因子-1

表2 兩組大鼠創面各時間點TIMP-1 含量比較（）

表2 兩組大鼠創面各時間點TIMP-1 含量比較（）

注：治療組常規創面處理基礎上給予活血生肌紗條換藥；對照組常規創面處理基礎上給予凡士林紗條外敷；TIMP-1 為組織抑制因子-1；與對照組比較，aP＜0.05

3.3 兩組大鼠瘡面組織Ⅰ型膠原蛋白表達量比較換藥第1 天，兩組大鼠創面組織Ⅰ型膠原蛋白表達差異無統計學意義（P＞0.05）；換藥第3 天，兩組大鼠創面組織均可見Ⅰ型膠原蛋白的形成，治療組高于對照組，但差異無統計學意義（P＞0.05）；換藥第5、7、9 天，治療組Ⅰ型膠原蛋白表達較對照組明顯增多（P 均＜0.05），膠原蛋白結構致密，成熟度較高。見表3、圖4。

表3 兩組大鼠創面組織各時間點Ⅰ型膠原蛋白表達量比較（）

注：治療組常規創面處理基礎上給予活血生肌紗條換藥；對照組常規創面處理基礎上給予凡士林紗條外敷；與對照組比較，aP＜0.05

圖4 不同方法處理大鼠背部壓力性損傷組織中Ⅰ型膠原（藍色）表達（Masson 染色，×100）

3.4 兩組大鼠瘡面組織膠原纖維表達量比較 兩組大鼠在換藥前壓瘡皮膚組織膠原纖維排列紊亂，表達量少，差異無統計學意義（P＞0.05）；與對照組比較，治療組膠原纖維表達量從第3 天開始增多，但差異無統計學意義（P＞0.05）；第5、7、9 天，治療組膠原纖維表達量較對照組明顯增多（P 均＜0.05），含量豐富，排列有序。見表4、圖5。

圖5 不同方法處理大鼠背部壓力性損傷組織中膠原纖維（藍色）表達（Masson 染色，×100）

表4 兩組大鼠創面組織各時間點膠原纖維表達量比較（）

表4 兩組大鼠創面組織各時間點膠原纖維表達量比較（）

注：治療組常規創面處理基礎上給予活血生肌紗條換藥；對照組常規創面處理基礎上給予凡士林紗條外敷；與對照組比較，aP＜0.05

4 討論

在壓瘡愈合進程中，以膠原纖維為主要成分的細胞外基質（ECM）的過度降解是創面難愈的重要因素。而MMP-9 是參與ECM 降解的蛋白酶，其過度表達可影響膠原沉積過程，導致組織液化，其活性受金屬蛋白酶抑制劑（TIMP-1）的影響。研究表明，MMP-9 參與壓瘡[2-3]病理過程，其在創面組織表達增高是潰瘍愈合不良的預測因素；慢性創面TIMP-1 缺如或顯著低于正常愈合傷口，且MMP/TIMP 比例的失衡可能與傷口愈合延遲有關[4]。以上均提示MMP-9 不利于創面愈合，而TIMP-1 上調可能中和過強MMP-9的活性，因此MMP-9、TIMP-1 的表達失調與創面不愈合密切相關。

壓瘡為臨床典型的慢性皮膚潰瘍。課題組根據壓瘡的病因病機，采用活血生肌方治療12 年，應用活血生肌中藥灌洗聯合封閉式負壓引流治療壓瘡等難治性創面[5-6]，療效顯著。其中黃芪具有益氣升陽、托毒生肌之效，方中重用為君藥；當歸、丹參化瘀通絡，白芷辛溫通竅、潰膿止痛，白及活血生肌，共為臣藥；輔以紅花、乳香、沒藥為佐藥，增活血化瘀之功；甘草調和諸藥，滋潤肌膚，諸藥合用，共奏活血行氣、化瘀生肌之效。研究表明，活血生肌方的方藥組份黃芪、當歸、丹參等具有調節MMP-9、TIMP-1 表達，促進血管新生作用[7-8]。本實驗結果顯示，治療組在使用活血生肌方外用3 d 后，壓瘡組織中MMP-9 含量明顯降低，同時TIMP-1 的含量提高；使用活血生肌方外用5 d 后，膠原蛋白及膠原纖維的表達也均高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。

綜上所述，活血生肌方對壓力性損傷的良性影響，可能是通過調節創面MMP-9 及TIMP-1 表達水平，以減少膠原蛋白的降解，進而促進壓瘡組織的愈合。但肉芽組織由細胞及細胞外基質組成，此實驗只表明其能阻止ECM 過度降解，但活血生肌方能否促進組織中細胞生長還有待于進一步深入研究。