黑色素瘤細(xì)胞PRDM1對(duì)增殖、凋亡和遷移的影響

陳 婷 蘇文楊 朱希聰

·論 著·

黑色素瘤細(xì)胞PRDM1對(duì)增殖、凋亡和遷移的影響

陳 婷1蘇文楊2朱希聰1

1.浙江省臺(tái)州醫(yī)院皮膚科，浙江臺(tái)州 317000；2.浙江省臺(tái)州醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，浙江臺(tái)州 317000

探討含PR/SET域蛋白1（PR/SET domain 1，PRDM1）表達(dá)水平與黑色素瘤患者預(yù)后的關(guān)系，及對(duì)黑色素瘤細(xì)胞增殖、凋亡、遷移的影響。分別通過(guò)基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)動(dòng)態(tài)分析（gene expression profiling interactive analysis，GEPIA）數(shù)據(jù)庫(kù)和基因集變異分析（gene seb camcer analysis，GSCA）數(shù)據(jù)庫(kù)分析PRDM1在皮膚黑色素瘤和正常組織中的表達(dá)差異及其與預(yù)后的關(guān)系。在細(xì)胞水平上將黑色素瘤A375分為兩組，分別為轉(zhuǎn)染siRNA-PRDM1和空載對(duì)照siRNA-NC，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組黑色素瘤A375細(xì)胞的增殖能力、抗凋亡能力，Transwell小室檢測(cè)各組黑色素瘤A375細(xì)胞的遷移能力，Western blot法檢測(cè)各組黑色素瘤A375細(xì)胞中MYC的表達(dá)水平。與正常組織比較，PRDM1在黑色素瘤中低表達(dá)，且黑色素瘤患者中PRDM1高表達(dá)者預(yù)后較低表達(dá)者好。在黑色素瘤A375細(xì)胞中PRDM1低表達(dá)后細(xì)胞的增殖、遷移能力增強(qiáng)，而抗凋亡能力下降，且細(xì)胞中MYC蛋白表達(dá)水平上調(diào)（<0.05）。PRDM1在黑色素瘤組織中低表達(dá)，且與患者不良預(yù)后相關(guān)。PRDM1可能通過(guò)MYC抑制黑色素瘤細(xì)胞的增殖、遷移，促進(jìn)凋亡，進(jìn)而抑制黑色素瘤的生長(zhǎng)發(fā)展。

黑色素瘤；PRDM1；MYC；增殖；生物信息學(xué)分析

黑色素瘤是一種易發(fā)生轉(zhuǎn)移且具有致死性高的常見皮膚惡性腫瘤，目前主流治療方案為早期手術(shù)、晚期放療和化療，以及近年來(lái)迅速發(fā)展的免疫抑制治療。大部分黑色素瘤均能得到控制，但若發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、耐藥及免疫逃避，其療效則會(huì)顯著降低[1-5]。探討黑色素瘤的生長(zhǎng)機(jī)制，尋找新的分子靶目標(biāo)提供更多的選擇方案具有重要意義。含PR域蛋白1（PR domain containing protein 1，PRDM1）作為近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種潛在抑癌基因[6-8]，被發(fā)現(xiàn)在黑色素瘤中呈低表達(dá)，且在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移瘤中多呈低表達(dá)，同時(shí)證實(shí)在斑馬魚黑色素瘤模型中，缺失PRDM1的表達(dá)易促進(jìn)黑色素瘤的發(fā)生、發(fā)展[9]。本研究應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)檢測(cè)了PRDM1在黑色素瘤中的表達(dá)情況和預(yù)后相關(guān)性，并在人黑色素瘤細(xì)胞上了驗(yàn)證PRDM1生物學(xué)功能，為尋求黑色素瘤新的治療方案提供思路。

1 材料與方法

1.1 基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)動(dòng)態(tài)分析（gene expression profiling interactive analysis，GEPIA）

將TCGA與GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)中腫瘤和正常組織樣本數(shù)據(jù)整合后進(jìn)行基因分析表達(dá)的可視化數(shù)據(jù)庫(kù)，涵蓋了9736個(gè)腫瘤組織和8587個(gè)正常組織的RNA數(shù)據(jù)[10]。利用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析PRDM1基因在皮膚黑色素瘤中的表達(dá)情況。

1.2 細(xì)胞和主要試劑

人黑色素瘤細(xì)胞株A375（美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)ATCC），DMEM培養(yǎng)基、Transwell小室（美國(guó)Corning公司），胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素（美國(guó)Thermo Fisher公司），Lipofectamine 2000（美國(guó)Invitrogen公司），Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green（日本TaKaRa公司），EdU試劑盒、siRNA-PRDM1及siRNA-NC（廣州銳博生物技術(shù)有限公司），RNase A、凋亡試劑盒購(gòu)（南京凱基生物有限公司），PRDM1、MYC、GAPDH單克隆抗體（中國(guó)愛博泰克生物公司，引物購(gòu)自上海生工生物公司）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

黑色素瘤細(xì)胞A375 10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素高糖培養(yǎng)基置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于6孔、24孔、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，細(xì)胞融合度達(dá)到70%時(shí)將培養(yǎng)基換成不含胎牛血清的DMEM饑餓6h，按照Lipofectamine 2000說(shuō)明書轉(zhuǎn)染siRNA-PRDM1、siRNA-NC，結(jié)束后繼續(xù)培養(yǎng)48h。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

采用Trizol提取細(xì)胞總RNA后按照反轉(zhuǎn)錄說(shuō)明書操作獲得cDNA。以β-actin作為內(nèi)參利用SYBR Green進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡實(shí)驗(yàn)

收集成功轉(zhuǎn)染siRNA-PRDM1及siRNA-NC的A375細(xì)胞，冷凍過(guò)的100%乙醇固定過(guò)夜。重懸細(xì)胞后RNase A室溫孵育5min，碘化丙啶避光室溫染色15min，篩網(wǎng)過(guò)濾后流式細(xì)胞儀檢測(cè)，F(xiàn)lowJo軟件分析細(xì)胞周期。成功轉(zhuǎn)染siRNA-PRDM1和siRNA- NC的A375細(xì)胞培養(yǎng)24h后，重懸細(xì)胞進(jìn)行Annexin V-FITC和碘化丙啶染色，應(yīng)用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡。

1.6 EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)

應(yīng)用EdU測(cè)定細(xì)胞增殖，將A375細(xì)胞以2×105/ml的密度接種于96孔板上，在成功轉(zhuǎn)染siRNA-PRDM1和空載對(duì)照48h結(jié)束前2h加入EdU，后4%多聚甲醛4℃固定過(guò)夜。甘氨酸中和殘留的固定液并洗滌干凈后0.5% Triton X室溫孵育30min。利用EdU檢測(cè)試劑盒根據(jù)操作說(shuō)明書染色、避光孵育。熒光顯微鏡EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)。

1.7 細(xì)胞遷移檢測(cè)

轉(zhuǎn)染siRNA-PRDM1及siRNA-NC，24h后A375細(xì)胞以2×105/ml的密度重懸于無(wú)FBS的DMEM中。吸取200μl細(xì)胞懸浮液至Transwell小室的上室，下室加入600μl含有10%FBS的DMEM，繼續(xù)孵育37℃孵育48h。結(jié)束后棄上室液用4%多聚甲醛固定，風(fēng)干后0.1%結(jié)晶紫染色，漂洗干凈后倒置顯微鏡拍攝。

1.8 免疫蛋白印跡檢測(cè)

從細(xì)胞中提取總蛋白后將等量的蛋白質(zhì)樣本分別進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入抗PRDM1、MYC、GAPDH單克隆抗體（1:1000）4℃孵育過(guò)夜，再次二抗室溫孵育2h，洗膜，電化學(xué)發(fā)光可視化系統(tǒng)顯影。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，兩組間數(shù)據(jù)比較采用Unpaired t檢驗(yàn)，另外PRDM1在腫瘤與正常組織中的表達(dá)差異分析采用Wilcoxon檢驗(yàn)，生存分析采用Kaplan-Meier法和Log-rank檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PRDM1在黑色素瘤和正常組織中的表達(dá)差異及與患者預(yù)后的相關(guān)性

利用GEPIA平臺(tái)對(duì)最新TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)皮膚黑色素瘤和GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)正常皮膚組織進(jìn)行差異表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)PRDM1在黑色素瘤中呈低表達(dá)。GSCA數(shù)據(jù)庫(kù)可視化分析顯示，PRDM1高表達(dá)組總體生存期（overall survival，OS）延長(zhǎng)。

2.2 敲低PRDM1的表達(dá)對(duì)黑色素瘤細(xì)胞增殖的影響

在黑色素瘤A375細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)中，siRNA-PRDM1轉(zhuǎn)染組G0/G1期細(xì)胞數(shù)（57.9±2.1）%相比siRNA-NC空載對(duì)照組（65.4±1.5）%顯著減少（=4.697，<0.05），且siRNA-PRDM1轉(zhuǎn)染組S期（30.6±2.3）%相比siRNA-NC空載對(duì)照組（22.5±2.5）%則明顯增多（=5.055，<0.05），G2/M期比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（=0.446，>0.05），見圖1A。同樣的EdU實(shí)驗(yàn)100倍顯微鏡下siRNA- PRDM1轉(zhuǎn)染組每個(gè)視野的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（36.5±4.0）%平均要高于空載對(duì)照組（29.3±3.2）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（=13.030，<0.05），見圖1B。

2.3 敲低PRDM1的表達(dá)對(duì)黑色素瘤細(xì)胞凋亡的影響

黑色素瘤A375細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)中，siRNA-PRDM1轉(zhuǎn)染組凋亡細(xì)胞百分比（13.4±2.9）%低于siRNA-NC空載對(duì)照組（20.7±2.0）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（=3.966，<0.05），而siRNA-PRDM1轉(zhuǎn)染組存活細(xì)胞百分比（84.4±3.3）%則要高于siRNA-NC空載對(duì)照組（76.9±2.3）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（=4.078，<0.05），見圖2。

2.4 下調(diào)PRDM1的表達(dá)對(duì)黑色素瘤細(xì)胞遷移能力的影響

黑色素瘤A375細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中，siRNA-PRDM1轉(zhuǎn)染組100倍顯微鏡下每個(gè)視野的結(jié)晶紫染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（230±17）明顯高于siRNA-NC空載對(duì)照組（97±13）（=23.800，<0.05），見圖3。

2.5 PRDM1影響黑色素細(xì)胞瘤的生長(zhǎng)發(fā)展

利用GEPIA平臺(tái)分析發(fā)現(xiàn)黑色素瘤中PRDM1與MYC存在相關(guān)性，見圖6A。免疫蛋白印記實(shí)驗(yàn)證實(shí)當(dāng)黑色素瘤A375細(xì)胞中PRDM1的表達(dá)下調(diào)，MYC蛋白表達(dá)水平上調(diào)，見圖4。

圖1 敲低PRDM1的表達(dá)對(duì)黑色素瘤細(xì)胞增殖影響

A.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)黑色素瘤細(xì)胞周期；B.EdU檢測(cè)黑色素瘤細(xì)胞增殖

注：與對(duì)照組比較，*<0.05

圖2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞中PRDM1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平

注：與對(duì)照組比較，*<0.05

圖3 敲低PRDM1的表達(dá)對(duì)黑色素瘤細(xì)胞遷移的影響（結(jié)晶紫染色，×100）

注：與對(duì)照組比較，*<0.05

圖4 黑色素瘤細(xì)胞中PRDM1和MYC的關(guān)系

A.GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)黑色素瘤中PRDM1與MYC的相關(guān)性；B.蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)PRDM1對(duì)MYC的影響

注：與對(duì)照組比較，*<0.05

3 討論

PRDM1作為一種支架蛋白能通過(guò)甲基化或者去乙酰化抑制基因轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮沉默靶基因的效應(yīng)[11]。已知PRDM1在部分腫瘤類型中具有腫瘤抑制因子的作用，特別是B、T和自然殺傷細(xì)胞淋巴瘤和肺癌[6,12]。而在黑色素瘤中，有文獻(xiàn)報(bào)道PRDM1是神經(jīng)嵴細(xì)胞分化為黑素細(xì)胞的重要調(diào)節(jié)因子，斑馬魚模型中缺失prdm1后早期黑色素干細(xì)胞標(biāo)志物sox10表達(dá)上調(diào)，且促進(jìn)了黑色素瘤的發(fā)生、發(fā)展[9]，但PRDM1在黑色素瘤中是否具有抑癌基因的效果尚無(wú)未明確結(jié)論。

首先通過(guò)分析可視化公共數(shù)據(jù)庫(kù)可知，與正常組織相比，PRDM1在黑色素瘤中低表達(dá)，同時(shí)黑色素瘤患者中PRDM1高表達(dá)水平者預(yù)后較低表達(dá)水平者高，生存時(shí)間延長(zhǎng)，表明PRDM1表達(dá)水平的高低與黑色素瘤患者預(yù)后相關(guān)，且PRDM1具有作為黑色素瘤患者預(yù)后生物標(biāo)記物的可能。既往有報(bào)道證實(shí)黑色素瘤免疫抑制治療中，PRDM1缺失更容易發(fā)生免疫相關(guān)不良事件[13]，可能是導(dǎo)致預(yù)后不良的因素之一，同時(shí)PRDM1的表達(dá)水平也可作為黑色素瘤患者開展免疫抑制治療方案的篩選指標(biāo)之一。此外，已知PRDM1在生發(fā)中心B細(xì)胞和漿細(xì)胞中高表達(dá)，與B淋巴細(xì)胞分化成熟密切相關(guān)，在維持T淋巴細(xì)胞穩(wěn)態(tài)及分化中也發(fā)揮著重要作用[11,14]。在腫瘤微環(huán)境中，PRDM1可能通過(guò)促進(jìn)B、T淋巴細(xì)胞分化成熟增強(qiáng)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)，進(jìn)而延長(zhǎng)PRDM1高表達(dá)黑色素瘤患者的生存時(shí)間，這也是下一步的研究方向。

為了進(jìn)一步證實(shí)PRDM1是黑色素瘤腫瘤抑制基因的一員。首先在A375細(xì)胞中成功轉(zhuǎn)染PRDM1- siRNA，抑制細(xì)胞內(nèi)PRDM1基因的表達(dá)。流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)S期細(xì)胞顯著增加，表明PRDM1阻礙黑色素瘤細(xì)胞細(xì)胞周期G1/S的轉(zhuǎn)化，說(shuō)明PRDM1抑制黑色素瘤細(xì)胞增殖，同樣EdU實(shí)驗(yàn)也證實(shí)這一點(diǎn)；另外流式細(xì)胞術(shù)證明PRDM1表達(dá)下調(diào)后促進(jìn)細(xì)胞凋亡；而遷移實(shí)驗(yàn)則表明PRDM1低表達(dá)后遷移能力增強(qiáng)。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了PRDM1抑制黑色素瘤細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)展。

MYC是已被普遍證實(shí)的一種原癌基因，參與多種生長(zhǎng)促進(jìn)相關(guān)信號(hào)通路的傳導(dǎo)，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[15,16]。MYC在多種類型腫瘤中處于高度擴(kuò)增狀態(tài)，短暫抑制MYC的表達(dá)可逆轉(zhuǎn)體內(nèi)腫瘤的發(fā)生[17]。此外有研究表明在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤中PRDM1基因失活誘導(dǎo)MYC基因表達(dá)上調(diào)[18]。為探索黑色素瘤細(xì)胞中PRDM1是否通過(guò)MYC發(fā)揮腫瘤抑制基因的作用，進(jìn)一步的在黑色素瘤細(xì)胞中成功轉(zhuǎn)染siRNA-PRDM1后，蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PRDM1表達(dá)下調(diào)，而MYC的蛋白表達(dá)水平則升高，可見PRDM1負(fù)向調(diào)控MYC，說(shuō)明PRDM1可能是通過(guò)MYC調(diào)控黑色素瘤細(xì)胞的增殖、凋亡和遷移。

綜上所述，在黑色素瘤患者中PRDM1高表達(dá)水平者相對(duì)生存期更長(zhǎng)，且初步證明PRDM1可能是通過(guò)下調(diào)MYC抑制黑色素瘤細(xì)胞的增殖、凋亡和遷移。

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Effect of PRDM1 on melanoma cell proliferation, apoptosis and migration and its underlying mechanism

CHEN Ting SU Wenyang ZHU Xicong

1.Department of Dermatology, Taizhou Hospital of Zhejiang Province, Taizhou 317000, Zhejiang, China; 2.Department of Neurology, Taizhou Hospital of Zhejiang Province, Taizhou 317000, Zhejiang, China

To explore the relationship between the expression level of PR/SET domain (PRDM1) and the prognosis of melanoma patients, as well as the effect on proliferation, apoptosis and migration of melanoma cells.The expression level of PRDM1 in melanoma and normal tissues was analyzed by GEPIA database and GSCA database. The melanoma A375 cells were divided into two groups, then transfected with small interfering RNA PRDM1 (siRNA-PRDM1) and empty vector small interfering RNA negative control (siRNA-NC). The proliferation, anti-apoptosis and migration of A375 cells were detected by flow cytometer, transwell assay, respectively, at last use Western blot to detect the protein expression level of MYC.The expression level of PRDM1 in melanoma was significantly lower than that of normal tissue, and the highly expressed PRDM1 was related with the poor prognosis of melanoma patients. Compared with empty vector group, the proliferation and migration of the cells was increased, while the anti-apoptosis was decreased, and the protein expression level of MYC in the cells was significantly decreased after transfection of siRNA-PRDM1 (<0.05).The PRDM1 was under-expressed in melanoma tissues and correlated with poor prognosis of the melanoma patients. PRDM1 may inhibit the development of melanoma by increasing MYC to prevent the proliferation, migration and promote anti-apoptosis of melanoma cells.

Melanoma; PRDM1; MYC; Proliferation; Bioinformatics analysis

R739.5

A

1673-9701(2022)36-0018-05

臺(tái)州恩澤醫(yī)療中心（集團(tuán)）科研基金項(xiàng)目（19EZA2）

朱希聰，電子郵箱：zhuxc@enzemed.com

（2022–07–11）

（2022–09–12）