碘伏對金屬鈦合金板表面金黃色葡萄球菌的抗菌實驗研究

耿瑋崢,李子豪,張 昊,馬壯壯,陳 偉

(吉林大學中日聯誼醫院 骨科,吉林 長春130033)

人工關節作為金屬內植物材料廣泛應用于關節外科領域，取得了良好的臨床效果，但同時人工關節置換后易出現感染，據文獻報道[1]，假體周圍感染的發生均是由細菌感染引發的，而術中細菌直接種植是感染的最直接因素，約占全部感染的57.9%，處理頗為棘手，治療上需要進行反復的清創，移除假體，其主要原因就是由于細菌生物膜(BBF)的形成。由于抗生素對于BBF的滲透非常困難，傳統的抗生素治療無論是單獨還是聯合使用都不能有效清除細菌，甚至還會導致耐藥性的產生。因此在目前情況下，預防感染就顯得尤為重要。碘伏(聚維酮碘)溶液作為一種常見的抗菌劑，已經廣泛應用于關節手術中的局部沖洗、浸泡，盡管臨床實踐中在預防關節周圍感染效果顯著，但缺乏相關的基礎研究，臨床指南及使用標準。由于人工關節材料中廣泛存在鈦合金，金黃色葡萄球菌(SA)是關節感染最常見的致病細菌，本研究通過觀察聚維酮碘溶液在鈦板表面未完全形成BBF時，沖洗浸泡后的滅菌效果，為臨床在術后關閉切口前，對碘伏清除細菌的效果提供依據和參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

鈦合金板，由中國天津IRENE正天醫療器械廠家加工并提供;金黃色葡萄球菌(SA)，中日聯誼醫院檢驗科提供，聚維酮碘皮膚消毒液(上海利康高科技有限公司)；37℃恒溫培養箱(北京醫療設備廠);胰蛋白胨的稀釋液(TPS)，磷酸鹽緩沖液等。

1.2 實驗分組與方法

1.2.1建立3組實驗樣本 (1)無菌清潔鈦合金板組：經過高溫高壓消毒的鈦合金板。(2)碘伏浸泡鈦合金板組：沾染上微量金黃色葡萄球菌，但經碘伏沖洗浸泡后的鈦合金板。(3)無菌鹽水沖洗鈦合金板組：沾染上微量金黃色葡萄球菌，但經無菌生理鹽水反復沖洗后的鈦合金板。

1.2.2實驗方法 (1)細菌懸液的制備:試驗菌選擇金黃色葡萄球菌(ATCC6538),放入 37℃培養箱中，新鮮斜面培養24 h后取出,經顯微鏡下確認清楚后，用含胰蛋白胨的稀釋液(TPS)沖洗下菌苔，并制備成菌懸液。再用含 30 g/L牛血清白蛋白溶液作為稀釋配制試劑，配置成極低濃度的菌懸液(含1-2個細菌/0.25 ml)備用。(2)鈦合金表面細菌沾染樣本制備:將鈦合金盤進行清潔、干燥、包裝、滅菌等預處理后備用，在百級手術室內取3組無菌清潔鈦合金板，放入無菌24 孔板中。第一組設為無菌清潔鈦合金板，在百級手術間內將無菌包裝打開，置于無菌24孔板中，滴入無菌鹽水1 ml放置；第二組設為碘伏浸泡鈦合金板組，將無菌包裝打開，置于無菌24 孔板中，外露在百級手術間內，同時用制備好的菌懸液1 ml滴入表面，分別在無菌條件下，用碘伏分別在15 min，30 min，60 min，90 min時浸泡沖洗1 min；第3組設為無菌鹽水沖洗鈦合金板組，將無菌包裝打開，置于無菌24 孔板中充分暴露，同時用制備好的菌懸液1 ml滴入表面，在無菌條件下，用無菌生理鹽水分別在15 min，30 min，60 min，90 min時反復沖洗1 min。(3)懸液細菌定量測定：用 PBS將每枚鈦板沖洗3次，使表面未粘附的細菌脫落，并用超聲裂解、振蕩等方法使鈦合金板表面細菌基本脫落，再次收集。稀釋加入裝有 4.5 ml沖洗液的無菌試管中,混勻。中和 10 min,取樣液進行活菌計數，試驗重復3次。

1.3 統計學分析

2 實驗結果

通過實驗發現，金黃色葡萄球菌能夠附著在金屬鈦板上存活，繁殖，經統計：無菌鹽水沖洗鈦板組活菌率約85%，碘伏浸泡鈦板組活菌率約1%，無菌清潔鈦板組活菌率95%以上，統計學意義顯著(P<0.05)，見表1。

表1 細菌活菌率統計表

無菌清潔鈦板組隨著時間的延長，有細菌在其表面沾染，碘伏浸泡鈦板組經過碘伏的沖洗浸泡幾乎無細菌存活，而無菌鹽水沖洗鈦板組隨著時間的延長，細菌開始出現指數生長情況，見表2。

表2 細菌計數(高倍顯微鏡下，每視野)統計表

3 討論

3.1 碘伏對附著在金屬表面細菌作用的影響

關于文獻選取，通過檢索維普網、中國知網、萬方數據庫、PubMed、CNKI全文數據庫等國內外數據庫，收集關于碘伏對于鈦合金材料的相關性研究。檢索詞包括：碘伏術后抗菌應用、金黃色葡萄球菌感染、骨關節術后感染、鈦合金材料抗菌應用、iodophor、Bone OR等。再通過關鍵詞及文獻摘要排除明顯不符合的文章后，根據篩選標準包括：①金黃色葡萄球菌對鈦合金表面影響的研究②碘伏對鈦合金表面看抗菌效果的研究③骨關節術后感染的并發癥的探討等。排除標準包括：①與鈦合金材料抗菌無關的文獻②內容陳舊，觀點仍存在廣泛爭議的文獻等。我們不難發現，細菌一般初始以浮游狀態沾染被污染區域，數小時致數日完成在假體，骨界面，組織等區域的定植。隨著浮游細菌吸附于假體表面，通過相互粘連、包裹形成生物膜，有研究報道[2]生物膜內細菌與浮游分散狀態相比，耐藥性提高了10-1 000 倍。因此，污染持續時間越長，越不利于徹底清除細菌。碘伏對浮游菌有很強的殺滅作用，可以用來預防手術感染。但是對于已經形成的BBF，碘伏很難殺滅其中的細菌。Nakagawa[3]和Hoang[4]報道單純應用碘伏溶液不能清除 BBF，這是因為BBF是細菌分泌的多糖、纖維蛋白和脂蛋白等物質粘附于生物材料形成的并能將細菌自身包裹于其中的膜樣復合物，如關節假體表面發熱膜狀物質，BBF能增強細菌對外界刺激的耐受力及抗菌藥物的耐藥性。近年來，BBF對抗菌藥物機槍的抵抗力也成為臨床上難治性感染的重要原因之一。研究表明[5-6]在處理細菌污染創面時，特別是細菌沾染在關節假體上面，必須要及時處理才能控制細菌的污染，防止感染的發生。因此，在目前的階段下，提前預防，積極預防，主動預防應該是防止人工關節周圍感染發生的最佳方式，手術中關閉創口的時候，再次清理滅菌就顯得格外重要[7]。此次研究表明，90 min內沾染在金屬表面的細菌，應用碘伏進行浸泡和沖洗，能夠將浮游和沾染在金屬表面的細菌完全消滅。

3.2 沖洗液對附著金屬表面細菌的作用

手術沖洗對預防術后感染非常重要，研究表明[8]沖洗可以大大減少創口受到可能存在污染區域的細菌數量，還可以清除手術創口內失去血供容易成為細菌的良好培養基的組織碎屑，導致機體發熱凝血塊，同時沖洗可以增加手術部位的組織局部抵抗力，減少炎性反應，達到降低感染的目的。但對于人工關節置換手術的創口來講，存在人工金屬材料，細菌往往會沾染或黏附在表面，如不及時清理，將逐漸形成BBF，是人工關節置換手術后關節感染難以治愈的原因。如金黃色葡萄球菌是人工關節置換最主要的致病菌，生物膜將保護細菌面對抗生素，機體免疫及殺菌劑的攻擊。大量文獻表明[9-11]當細菌處于浮游狀態時，沖洗將起到積極作用。我們知道在手術過程中，盡管是無菌操作，但經過數小時開放性手術操作，很難避免空氣中的細菌沾染或術中不經意直接沾染都有可能造成術區的污染，而沖洗將是我們在關閉切口前的最后抗菌措施，能否有效避免傷口污染發展為感染,何種沖洗液預防感染的效果好一直是外科醫生需要深入研究的問題。李曉華等[12]研究表明，當細菌進入創口與假體接觸后，會在假體表面產生一種細胞外多黏質物質(extracellular slime substance，ESS)，當細菌處在游離狀態沾染在假體表面時，沖洗就顯得很重要，它可以破壞沾染在假體表面的 ESS，從而可以達到清除細菌的目的。目前常用術區沖洗液包括：生理鹽水，高滲鹽水，抗生素生理鹽水沖洗液，化學試劑(包括碘伏，過氧化氫)等，但能夠在最后關閉手術切口前確切徹底殺滅和清除細菌的沖洗液不多，研究發現[13]高滲鹽水，生理鹽水，抗生素鹽水，過氧化氫都可以清洗掉和殺滅大部分沾染的細菌，但很難能達到徹底滅菌的功能，存在污染的風險。研究表明[14]碘伏依靠其氧化和碘化菌體內巰基化合物、肽類和蛋白質可完全殺滅細菌，而對于碘伏能否徹底殺滅附著在內植入金屬材料細菌缺乏了解，我們此次進行的對比試驗表明，碘伏溶液通過浸泡具有殺滅附著在金屬表面的金黃色葡萄球菌的能力，即使細菌仍沾染在金屬表面，也能夠被殺滅，可以消除污染的隱患。我們可以通過統計結果發現，在污染的鈦合金表面，應用碘伏浸泡和沖洗后，即使90 min后仍然保持無污染或極低沾染狀態，而生理鹽水沖洗組已經發生污染，每個階段的沖洗能夠減少和控制細菌的數量，但不能控制殘留細菌的繁殖，金黃色葡萄球菌開始成指數生長，且無法徹底清除金屬表面殘留的細菌。而無菌鈦板組，在暴露的手術室環境中，長時間也出現細菌沾染情況。這些都表明，能否有效殺滅細菌沖洗和浸泡是防治感染的關鍵。

4 文章的局限性

①骨科術后感染的菌種非常豐富，本文僅對最為常見之一的金黃色葡萄球菌進行了研究，存在單一性；②我們未對現實中臨床病例中抗菌效果進行病例調查、研究，也未對患者進行隨訪。③臨床中我們碘伏濃度還有多種，其是否對金黃色葡萄球菌具有更好的影響還有待于進一步探究。不過隨著醫學科研的不斷進步以及醫療水平的提高，碘伏(聚維酮碘)的作用及應用一定會在相關領域被進一步驗證。