苗藥五藤膏外敷對膝骨關節炎兔軟骨SMAD1及血清Jagged1、Jagged2表達的影響

韓珊 周靜 馬武開 姚血明 申海艷 陳琳 王顏君

(1貴州中醫藥大學，貴州 貴陽 550002；2貴州省骨科醫院；3貴州中醫藥大學第二附屬醫院風濕免疫科)

膝骨關節炎(KOA)又稱膝退行性骨關節病，好發于中老年人群，尤以女性常見，以關節軟骨(變性、退化)、關節囊增厚、軟骨下骨發生病理改變(骨質增生、滑膜增生等)及關節周圍肌肉損傷等為主要特征，臨床主要表現為不同程度的關節疼痛、腫脹、畸形及活動受限等〔1〕。目前臨床治療KOA的方式有藥物治療、物理治療、手術治療等，主要以緩解癥狀為主。苗藥五藤膏作為KOA的外治經驗方，具有祛風通絡、活血止痛等作用。經前期臨床研究顯示，苗藥五藤膏貼敷療效確切，能夠有效緩解KOA患者關節疼痛、腫脹等臨床癥狀〔2～5〕。KOA發病機制較為復雜，有研究發現骨形態發生蛋白(BMP)、Notch信號通路在調控KOA關節軟骨細胞增殖、分化，維持軟骨細胞表型及軟骨基質代謝平衡等方面發揮著重要作用，其中，SMAD1作為BMP信號通路中BMP2受體的直接下游分子，在BMP2信號轉導中起中心作用；而Jagged1、Jagged2作為激活Notch信號的關鍵配體，可以加速早期軟骨細胞分化，在調控軟骨方面起著重要作用〔6～9〕。因此，我們在前期臨床和實驗研究的基礎上進一步驗證苗藥五藤膏治療KOA是否與其通過調節BMP、Notch信號通路中相關蛋白及基因的表達水平，從而減慢KOA關節軟骨退變。為驗證該假設，本研究通過建立兔KOA模型，從細胞及分子水平探討不同劑量苗藥五藤膏于相應時間內外敷干預對KOA模型兔關節軟骨SMAD1及血清Jagged1、 Jagged2表達水平的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 2019年3～6月選取同一批4～5月齡健康新西蘭大白兔72只，體重(2±0.5)kg，由貴州中醫藥大學動物實驗中心提供，合格證號：SCXK(黔)2018-00012。分籠飼養，實驗前均進行1 w的適應期喂養，在實驗過程中遵照實驗動物倫理要求。

1.2實驗藥物 氟比洛芬巴布膏，進口藥品注冊證號：H20140693；生產批號：602243-01；生產廠家：日本三笠制藥株式社會；規格：40 mg/貼。苗藥五藤膏(黑骨藤30 g、大血藤30 g、小花青風藤30 g、香血藤30 g和絡石藤30 g打成細粉與凡士林按1∶1的比例混合制成)，由貴州中醫藥大學第二附屬醫院藥劑科提供(黔藥制字Z20120072)，使用前將調制好的苗藥五藤膏均勻涂于紗布上做成貼膏。

1.3主要儀器和試劑 微量移液器(Eppendorf)、磁力攪拌器(T8-1，江蘇省金壇市中大儀器廠)、離心機(HI650，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司)、酶標儀(mμlISKANMK3，Thermo)、電熱恒溫培養箱(ICV-450，日本ASONE)、FlexStation 3多功能酶標儀(Flexstation3，Molecular Devices)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒(碧云天，貨號：P0010)、兔多抗SMAD1(52 kD,avivasysbio，貨號：ARP38692-T100)、Jagged1蛋白測定試劑盒(優爾生，貨號：SEB807Hu)、Jagged2蛋白測定試劑盒(優爾生，貨號：SEL636Hu)、磷酸酶抑制劑(碧云天，貨號：S1873)、辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗兔二抗(武漢博士德生物工程有限公司，貨號：BA1054)、Trise-Base(Biofroxx，貨號：1115GR500)、蛋白marker(10～250 kD,海利克思，貨號：P12103-2)。

1.4方法

1.4.1實驗分組與KOA兔模型的制備 采用隨機數字表法將72只家兔分為空白組、模型組、巴布膏組、苗藥五藤膏高劑量組、苗藥五藤膏中劑量組、苗藥五藤膏低劑量組各12只。除空白組外，其余五組采用經典的木瓜蛋白酶膝關節內注射方法建立KOA兔模型〔10〕：將4%的木瓜蛋白酶生理鹽水溶液0.3 ml分別于第1、4、7 天注入兔右膝關節，第7天注射完畢后，不再進行任何干預。正常飼養4 w后，通過X線片、組織切片觀察兔右膝關節，建立穩定的KOA兔模型。

1.4.2給藥方法 從造模后第5周開始給藥，具體方法：空白組、模型組正常飼養4 w，每日用無菌紗布包扎固定右膝關節4 h，不做任何藥物干預；巴布膏組給予氟比洛芬巴布膏外敷，將巴布膏(約2 g)剪至4 cm×3 cm大小直接貼敷于兔右膝關節，關節固定4 h，每日給藥1次，干預時間為4 w；苗藥五藤膏低、中、高劑量組分別給予低(約1 g)、中(約2 g)、高(約4 g)劑量的苗藥五藤膏外敷，將苗藥五藤膏(貴州中醫藥大學第二附屬醫院制劑室研制)均勻涂抹于紗布上制成貼膏直接貼敷于兔右膝關節前方，關節固定4 h，每日給藥1次，干預時間為4 w，其中，高劑量組貼膏面積大小為8 cm×3 cm、中劑量組膏貼面積大小為4 cm×3 cm、低劑量組膏貼面積大小為2 cm×3 cm，各治療組家兔藥物使用劑量均為人體等效劑量〔11〕。為了防止藥物掙脫，各治療組均用繃帶包扎固定。給藥4 w后采用空氣栓塞法將其全部處死，剝除右側膝關節皮膚，取右側股骨內髁頂點鈣化層以上軟骨進行各項指標檢測。

1.4.3Western印跡檢測蛋白表達 按照說明書要求，首先完成蛋白樣品的制備，即：在EP管中加入剪碎的軟骨組織、鋼珠及裂解液〔含2 μl苯甲基磺酰氟(PMSF)、2 μl磷酸酶抑制劑〕進行勻漿、裂解、離心，將蛋白樣品〔經磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋20倍〕、標準品〔經牛血清白蛋白(BSA)標準品稀釋〕及BCA試劑盒中的混合液(A液和B液按50∶1比例混合)依次加入96孔板內，37℃避光孵育后，用酶標儀(DG-3022A)測定OD值(OD568)，根據OD值和標準蛋白濃度計算直線回歸方程及蛋白樣品濃度，最后用BandScan分析膠片灰度值。

1.4.4酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測 根據說明書要求，首先完成血清樣本的加樣處理，即：設置空白孔、標準孔、待測樣品孔，依次向各孔中加入樣品稀釋液、標準品、待測樣品(均100 μl)，37℃酶標板覆膜孵育1 h，用酶標儀測量各孔OD值。根據標準品的濃度和OD值計算標準曲線的直線回歸方程及樣品濃度。

1.4.5關節軟骨病理學觀察 取各組兔右側股骨內髁頂點鈣化層以上軟骨制作標本，經中性甲醛固定，硝酸脫鈣，常規石蠟包埋，切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，觀察各組病理標本形態變化。軟骨病理改變情況參考Mankin評分〔12〕進行評分。

1.5統計學方法 采用SPSS22.0軟件進行LSD-t檢驗、方差分析。

2 結 果

2.1病理結果

2.1.1關節軟骨病理圖片觀察 光鏡下可見空白組關節面光滑，未見明顯腫脹、增生及滑膜充血，軟骨無退行性改變，軟骨細胞未變性、萎縮，分布均勻；模型組關節面粗糙不平整，明顯腫脹、增生及滑膜充血，軟骨重度退行性改變，軟骨細胞重度變性、萎縮，分布紊亂；巴布膏組關節面不平整，伴有關節腫脹和滑膜充血，軟骨輕度退行性改變，軟骨細胞輕度變性、萎縮，分布輕度紊亂；苗藥五藤膏低、中、高劑量組關節表面較光滑，輕度關節腫脹和滑膜充血，軟骨退變程度與劑量呈反比，即劑量越低越接近模型組，劑量越高越接近空白組，見圖1。

圖1 各組病理結果(HE染色，×200)

2.1.2Mankin評分結果 與空白組相比，模型組及各治療組Mankin評分明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，各治療組Mankin評分均明顯降低(P<0.05)；治療組組內比較，Mankin評分從高到低依次分別為苗藥五藤膏低、中劑量組、巴布膏組及苗藥五藤膏高劑量組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

2.2各組SMAD1蛋白表達水平的比較 與空白組相比，模型組及各治療組SMAD1蛋白表達水平均明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，苗藥五藤膏中、高劑量組及巴布膏組SMAD1蛋白表達水平均明顯升高(P<0.05)；巴布膏組SMAD1蛋白表達水平均明顯高于苗藥五藤膏低、中劑量組(P<0.05)，見表1、圖2。

2.3各組血清中Jagged1、Jagged2表達水平比較 與空白組相比，模型組及苗藥五藤膏各劑量組Jagged1、Jagged2表達水平均明顯升高(均P<0.05)；與模型組相比，苗藥五藤膏各劑量組、巴布膏組Jagged1、Jagged2表達水平均明顯降低(P<0.05)；與巴布膏組相比，苗藥五藤膏各劑量組Jagged1、Jagged2表達均明顯升高(P<0.05)；與苗藥五藤膏低劑量組比較，苗藥五藤膏中、高劑量組Jagged1、Jagged2表達水平明顯降低(均P<0.05)，見表1。

表1 各組Mankin評分、兔軟骨SMAD1蛋白及血清Jagged1、Jagged2表達水平比較

1～6：空白組、模型組、苗藥五藤膏低劑量組、苗藥五藤膏中劑量組、苗藥五藤膏高劑量組、巴布膏組圖2 干預4 w后各組關節軟骨組織中SMAD1蛋白表達

3 討 論

膝關節軟骨降解、骨贅形成及軟骨損傷等是形成KOA的主要原因，其中軟骨降解主要是由于蛋白裂解酶(基質金屬蛋白酶、蛋白聚糖酶等)活性的提高，從而導致Ⅱ型膠原蛋白被降解〔13〕；骨贅則是由肥大的軟骨細胞引起軟骨局部鈣化所導致〔14〕。BMP、Notch信號通路與KOA的發生發展有密切的關系〔15,16〕。BMP作為轉化生長因子(TGF)-β超家族中的一員，是一種多功能生長因子，參與了軟骨細胞的形成、增殖，正常穩態的維持，骨化階段的終末分化、凋亡及退行性改變等，在軟骨細胞信號網絡調控中發揮著重要作用，BMP在軟骨損傷后可通過促進軟骨細胞的增殖和Ⅱ型膠原表達來促進軟骨修復與軟骨細胞表型穩態的維持〔17～19〕。SMAD1在BMP信號通路中起著轉導中心的作用〔20〕，即當BMP配體與BMPⅠ型受體集合后，BMPⅡ型受體也集合上去，使BMPⅠ型受體磷酸化，進而磷酸化下游與BMP特異作用的受體性蛋白SMAD1，從而激活細胞內的信號傳導，調節軟骨細胞的增殖、分化等〔21〕。研究表明，上調SMAD1蛋白表達，可促進軟骨下骨再生修復；下調SMAD1蛋白表達，則會加速軟骨細胞的降解、肥大，從而導致骨關節炎發生〔22〕。

Notch信號通路是一條高度保守的信號通路，廣泛存在于無脊椎動物和哺乳動物中，由Notch受體(Notch1、2、 3、4)、配體(Delta-like1、3、4和Jagged1、2)及CSL蛋白等組成；可參與調控細胞的增殖、分化及凋亡進程，在調節軟骨細胞的增殖與分化、維持軟骨細胞的表型及平衡軟骨的基質代謝方面發揮著重要的作用〔23,24〕。Notch信號通路對關節炎具有保護和破壞雙重作用，即持續激活Notch信號通路會引起早期關節炎進一步發展，短暫的激活則能促進軟骨基質的合成及抑制軟骨的退變〔25〕；然而對于Notch信號通路的激活，研究表明只有當Notch受體與配體相結合時，Notch信號才能在細胞的增殖、分化、凋亡中發揮調控作用〔26〕。Jagged1、Jagged2作為激活Notch信號通路的關鍵配體，在啟動Notch信號通路中扮演著不可或缺的角色，同時，有研究表明在骨關節炎軟骨中Jagged1、Jagged2呈高表達狀態〔27〕。

本研究說明，SMAD1蛋白的表達水平與KOA有很大的相關性。苗藥五藤膏可通過促進軟骨組織中SMAD1蛋白的表達來抑制KOA的病程進展，從而治療KOA；同時，本研究結果也進一步說明Notch信號通路的下游基因Jagged1、Jagged2的表達水平與KOA的發生發展也有著密切的聯系。苗藥五藤膏可通過抑制軟骨組織中Jagged1、Jagged2的表達來抑制KOA的病程進展，從而治療KOA且其表達水平與KOA病程進展及軟骨退變程度呈正相關。