畢赤酵母多基因組裝系統的構建及其在2-苯乙醇合成中的應用

陳曉瑞，戰春君，白仲虎，楊艷坤*

1(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)2(江南大學,糧食發酵與食品生物制造國家工程研究中心，江蘇 無錫，214122)

巴斯德畢赤酵母(Komagataellaphaffii)是一種甲基營養酵母，具有高密度發酵、副產物少、甲醇利用等特點，被廣泛應用于外源蛋白的生產[1]。隨著基因操作工具的不斷發展，畢赤酵母也開始被用于代謝產物的合成[2]，如脂肪醇的生產[2-3]。構建細胞工廠常需要同時過表達多個不同基因，Gibson組裝[4]、golden gate克隆[5]、Gateway等克隆技術是構建多基因表達載體的有效方法。其中golden gate克隆技術主要利用二型內切酶切割位點在識別位點之外的特點，只需在片段兩側引入很短的序列即可實現無痕連接[6]。基于這種方法，PRIELHOFER等[7]建立了GoldenPics克隆方法，實現了8個表達盒的組裝。通過設計不同的接頭序列，這種方法可以實現多元件的順序組裝。GoldenPics是專用于畢赤酵母基因改造的試劑盒，相比于另一種酵母多元件質粒構建試劑盒Yeast Toolkit(YTK)[8]，其連接各元件的接頭序列被直接設計在骨架質粒上，而不是作為一個獨立元件，避免了YTK中易產生錯誤連接的問題。但GoldenPics所構建的質粒需要經過菌落PCR驗證，不如YTK中替換熒光蛋白的篩選方式直觀。另外GoldenPics無法回收篩選標記，構建產生的菌株具有抗性，不夠安全，不適合發酵工業生產需要,且無法實現游離表達，目的基因只能整合到基因組中。

針對以上問題，本研究設計了用于抗性回收及游離表達的元件，構建了一種高效的畢赤酵母多基因組裝系統(multigene assembly system，MGAS)，可靈活替換目的基因的啟動子、終止子、整合位點及表達方式。2-苯乙醇(2-phenylethanol，2-PE)是一種具有玫瑰香氣的高級芳香醇，具有很高的商業價值[9]。其生物合成途徑較長(圖1)，調控機制復雜[10-12]。本研究利用MGAS，游離表達篩選了不同來源的關鍵酶并整合表達5個基因，最終重組菌株PE-3的2-PE產量達到了408.4 mg/L，相比出發菌株提高了10倍以上。該研究為畢赤酵母代謝改造提供了一種高效的分子工具，也為畢赤酵母合成高價值化學品提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株與質粒

實驗所用菌株及質粒見附表1(https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1802.ts.20220512.1050.004.html，下同)。

1.2 培養基及試劑

1.2.1 培養基

LB培養基(g/L)：酵母提取物5，胰蛋白胨10，NaCl 10，配制固體培養基時加入瓊脂粉20。YPD培養基(g/L)：酵母提取物10，胰蛋白胨20，葡萄糖20，配制固體培養基時加入瓊脂粉20。YPM(yeast extract peptone methanol medium)培養基：0.5%(體積分數)甲醇，酵母提取物10 g/L，胰蛋白胨20 g/L。MD(minimal dextrose medium)培養基(g/L)：葡萄糖20，YNB 13.4，配制固體培養基時加入瓊脂粉20。BMGY(buffered glycerol-complex medium)培養基：酵母提取物10 g/L，胰蛋白胨20 g/L，甘油2.5 g/L，YNB 13.4 g/L，100 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH=6.0)。BMM(buffered methanol medium)培養基：0.5%(體積分數)甲醇，YNB 13.4 g/L，100 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH=6.0)。

圖1 畢赤酵母從頭合成2-PE途徑示意圖Fig.1 De novo synthesis of 2-PE in Komagataella phaffii

1.2.2 試劑

所有內切酶均購自Thermo Fisher Scientific；MultiF Seamless Assembly Mix購自ABclonal；Ligation mix購自Takara；PCR Mix及回收膠、純化、質粒提取所用試劑盒均購自康為世紀；2-PE標準品購自Sigma；其余試劑均購自國藥集團化學試劑有限公司。本文所用引物如附表2所示均合成自蘇州金唯智生物科技有限公司。

1.3 搖瓶培養條件及抗性消除方法

1.3.1 搖瓶培養

將50 μL 菌液接種5 mL YPD培養基，30 ℃，200 r/min下過夜培養。之后按終濃度OD600=0.1接種至50 mL BMGY培養基，待OD600值達到4～6后收集菌液，5 000 r/min離心5 min，棄上清液保留菌體，轉接至50 mL BMM培養基中進行發酵。每隔24 h補加終體積分數為0.5%的甲醇并取樣測定生物量和2-PE濃度。

1.3.2 抗性消除方法

將50 μL菌液接種5 mL YPM培養基，30 ℃，200 r/min下培養24 h，劃線至YPD平板。30 ℃培養48 h，挑取單菌落分別接種至YPD及含0.1 mg/L博來霉素的YPD(YPDZ)培養基中，30 ℃，200 r/min下培養36 h，只能在YPD中生長的菌落即為抗性消除菌。

1.4 測定方法

樣品處理方法：取發酵液1 mL，12 000 r/min離心5 min后取上清液，加入等量無水乙醇，混勻后12 000 r/min離心5 min，取上清液進行HPLC測定。

2-PE使用HPLC C18色譜柱(Shim-pack GIST，5 μm，150 mm×4.6 mm，日本島津)進行檢測，HPLC程序為：柱溫30 ℃，流速1 mL/ min，檢測波長214 nm，A相為含有1%(體積分數)乙腈的20 mmol/L KH2PO4溶液，B相為乙腈，0～6 min B相濃度由0%升至10%，6～25 min B相濃度由10%升至60%，25～26 min B相濃度由60%降至0%，保持至28 min。2-PE出峰時間為16.4 min。

2 結果與分析

2.1 畢赤酵母多基因表達系統的構建

為構建畢赤酵母多基因表達系統，首先構建了一系列帶有接頭序列的骨架質粒，之后在此基礎上插入了啟動子、終止子、整合位點、CEN/ARS序列、Cre-lox序列等一系列元件。

2.1.1 骨架質粒的構建

通過將pYTK001的BsmB I酶切位點替換為BsaI/BbsI酶切位點并引入GoldenPics中的接頭序列構建了Bb1系列的骨架質粒，接頭序列及質粒圖譜如圖2所示。以pYTK001為模板，利用引物對Bb1-12-Fs1-F、Bb1-12-Fs2-R和Bb1-12-Fs2-F、Bb1-12-Fs1-R進行PCR，得到片段Bb1-12-F1和Bb1-12-F2。通過同源重組連接兩片段，得到質粒Bb1-12。質粒Bb1-23、Bb1-34使用了相同的構建方法。Bb3系列的骨架質粒構建方法與Bb1相同，區別為構建Bb3-AD使用的引物對為Bb3-FsD-F、Bb3-AD-FsD-R和Bb3-FsA-R、Bb3-AD-FsD-R，Bb3-AH使用的引物對為Bb3-FsA-F、Bb3-AH-FsH-R和Bb3-FsA-R、Bb3-AH-FsH-R。

通過將pYTK095的BsaI酶切位點替換為BbsI/BsaI酶切位點并引入GoldenPics中的接頭序列構建了Bb2系列的骨架質粒。以pYTK095為模板，利用引物對Bb2-AB-FsA-F、Bb2-AB-FsB-R和Bb2-AB-FsB-F、Bb2-AB-FsA-R進行PCR，得到片段Bb2-AB-F1和Bb2-AB-F2，通過同源重組連接兩片段，得到質粒Bb2-AB。質粒Bb2-BC、Bb2-CD、Bb2-DE、Bb2-EF、Bb2-FG、Bb2-GH使用了相同的構建方法。

2.1.2 元件插入

以畢赤酵母GS115基因組為模板，利用引物對Fs1-pAOX1、pAOX1-Fs2進行PCR，得到兩端帶有BsaI酶切位點和接頭序列1、2的片段pAOX1。之后配制以下體系：片段100 ng，Bb1-12 40 ng，Ligation mix 5 μL，BsaI 1 μL，加水補齊至10 μL。按照以下程序進行反應：37 ℃，3 h；50 ℃，5 min；80 ℃，10 min。之后轉化大腸桿菌JM109，涂布氯霉素抗性平板篩選，挑取白色菌落并測序。之后用相同的方法構建了Bb1-pFLD1。Bb1-RPS25tt的構建方法相同，但使用的骨架質粒為Bb1-34。

代謝工程改造常需要篩選不同的外源基因。游離表達轉化效率高、操作簡單、對宿主影響小，先通過游離表達篩選出最適的外源基因再整合至基因組可以簡化基因操作。因此構建了質粒Bb2-AB-CEN/ARS-BleoR以實現外源基因的游離表達。以質粒pYTK081為模板，利用引物對Fs1-CENARS-BleoR-F、CENARS-BleoR-R進行PCR。以pMCO為模板，利用引物對CENARS-BleoR-F、CENARS-BleoR-Fs4進行PCR。將以上獲得的兩個PCR產物進行融合PCR，得到片段CEN/ARS-BleoR，兩端帶有BbsI酶切位點和1、4接頭序列。使用內切酶BbsI將其與Bb2-AB進行golden gate克隆，挑取白色菌落并測序。

畢赤酵母中抗性標記有限，對其進行多輪基因操作需要回收篩選標記。另一方面，出于安全性的考慮，生產所用的菌株不應帶有抗性。LI等[11]構建了質粒pMCO，用于畢赤酵母中抗性標記的回收。以質粒pMCO為模板，利用引物對Fs1-Cre-F、BleoR-Fs 4進行PCR，得到片段的Cre-BleoR兩端帶有BbsI酶切位點和1、4接頭序列,如圖3所示。使用內切酶BbsI將其與Bb2-AB進行golden gate克隆，挑取白色菌落并測序，得到質粒Bb2-AB-Cre-BleoR。甲醇誘導Cre重組酶的表達后，loxP位點間的Cre和BleoR表達框被切除，即可消除抗性。

為實現實現目的基因的穩定表達，在Bb2-BC中插入了用于整合的元件AOX1TT，構建質粒Bb2-BC-AOX1TT。以畢赤酵母GS115基因組為模板，利用引物對Fs1-AOX1TT、AOX1TT-Fs4進行PCR，得到699的片段兩端帶有BbsI酶切位點和1、4接頭序列。使用內切酶BbsI將其與Bb2-BC進行golden gate克隆，挑取白色菌落并測序。

圖3 片段Cre-BleoR示意圖Fig.3 Map of fragment Cre-BleoR

2.2 畢赤酵母多基因表達系統的應用

2.2.1 解除關鍵酶的負反饋抑制

芳香族氨基酸生物合成途徑存在嚴格的調控機制，其中磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvic acid，PEP)和4-磷酸赤蘚糖(erythritose 4-phosphate，E4P)縮合生成2-酮-3-脫氧-D-阿拉伯庚酮-7-磷酸(2-ketone-3-deoxy-D-arabheptanone-7-phosphate，DAHP)及分支酸轉變為預苯酸是2個關鍵的限速步驟，受到芳香族氨基酸的負反饋調節[13]，通過定點突變或刪除調節區域是解決這一問題的關鍵手段[14]。

2.2.1.1 游離型多基因表達載體的構建及驗證

選擇了大腸桿菌(Escherichiacoli)來源的DHAP合酶AroGD146Np(GenBank：WP_001109196.1)和分支酸變位酶PheAfbrp(GenBank：NP_311489.1)[15]及釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)來源的DHAP合酶Aro4K229Lp(Gene ID：852551)和分支酸變位酶Aro7G141Sp(Gene ID：856173)在畢赤酵母中進行游離表達。質粒構建流程如圖4所示，以質粒Bb3-CEN/ARS-Aro4K229L-Aro7G141S的構建為例，以釀酒酵母BY4741基因組為模板，利用3對引物：Fs2-Aro4和Aro4-BsaI-R；Aro4-BsaI-F和Aro4K229L-rv；Aro4K229L-fw和Aro4-Fs3得到3段PCR產物，之后利用引物對Fs2-Aro4和Aro4-Fs3進行融合PCR。將所得PCR產物連接到質粒Bb1-23得到質粒Bb1-Aro4K229L，將其與Bb1-pAOX1、Bb1-RPS25Att、Bb2-BC進行golden gate組裝，得到質粒Bb2-BC-Aro4K229L。用相同的方法得到質粒Bb2-CD-Aro7G141S，將其與Bb2-AB-CEN/ARS、Bb2-BC-Aro4K229L進行golden gate組裝，轉化大腸桿菌，挑取白色菌落，得到質粒Bb3-CEN/ARS-Aro4K229L-Aro7G141S，質粒圖譜如圖4所示。用相同的方法得到Bb3-CEN/ARS-AroGD146 N-PheAfbr。

圖4 游離型多基因表達載體的構建Fig.4 Construction of episomal multigene constructs

2.2.1.2 解除負反饋抑制對畢赤酵母合成2-PE的影響

分別將質粒Bb3-CEN/ARS-Aro4K229L-Aro7G141S和Bb3-CEN/ARS-AroGD146 N-PheAfbr電轉至畢赤酵母GS115，得到菌株PE-1和PE-2。經過搖瓶發酵和產物測定，結果如圖5所示，發現兩種來源的酶都能有效解除畢赤酵母中的負反饋抑制，重組菌株產量都在150 mg/L以上，且釀酒酵母來源的ARO4K229L和ARO7G141S兩基因效果更加顯著。而出發菌株的產量始終在40 mg/L以下，低于線性范圍(結果未展示)。以上結果證明過表達解除反饋抑制的關鍵酶可以有效解除終產物產生的反饋抑制。

2.2.2 過表達莽草酸途徑

為了實現穩定表達，將釀酒酵母來源的基因ARO4K229L和ARO7G141S整合到畢赤酵母基因組中。為進一步促進畢赤酵母合成2-PE，同時將莽草酸途徑中的DHAP合酶ARO3(Gene ID：8200288)、ARO5(Gene ID：8198396)和莽草酸途徑下游的預苯酸脫水酶PHA2(Gene ID：8200719)基因整合到基因組中進行了過表達。

圖5 菌株PE-1和PE-2的發酵結果Fig.5 Fermentation performance of strains PE-1 and PE-2

2.2.2.1 整合型多基因表達載體的構建及驗證

使用2.2.1.1中描述的方法構建了質粒Bb2-CD-Aro4K229L、Bb2-DE-Aro7G141S、Bb2-EF-Pha2、Bb2-FG-Aro3、Bb2-GH-Aro5。將以上質粒與Bb3-AH、Bb2-AB-Cre和Bb2-BC-AOX1TT進行golden gate組裝，將轉化大腸桿菌后統計平板上綠色和白色菌落的個數。結果如圖6-a所示，平板白色菌落占90%以上。菌落PCR驗證結果如圖，利用4對引物：(1)Fs2-Aro4、Aro7-Fs3；(2)Fs2-Aro7、Pha2-Fs3；(3)Fs2-Pha2、Aro3-Fs3；(4)Fs2-Aro3、Aro5-Fs3分別得到大小為2 756、2 543、2 876、3 374 bp的條帶，如圖6-b所示，證明質粒Bb3-Aro4K229L-Aro7G141S-Pha2-Aro3-Aro5構建成功，質粒圖譜如圖6-c所示，證明本研究所構建系統可完成多達7個元件的組裝。

a-平板白色與綠色菌落分布；b-質粒Bb3-Aro4K229L-Aro7G141S-Pha2-Aro3-Aro5驗證圖(M-DL 10000 Marker;1-基因ARO4與ARO7連接驗證; 2-基因ARO7與PHA2連接驗證;3-基因PHA2與ARO3連接驗證;4-基因ARO3與ARO5連接驗證)；c-質粒Bb3-Aro4K229L-Aro7G141S-Pha2-Aro3-Aro5圖譜圖6 游離型多基因表達載體的構建Fig.6 Construction of episomal multigene constructs

2.2.2.2 過表達莽草酸途徑對畢赤酵母合成2-PE的影響

用XhoI對質粒Bb3-Aro4K229L-Aro7G141S-Pha2-Aro3-Aro5進行線性化，之后電轉至畢赤酵母GS115，得到菌株PE-3。經過搖瓶發酵和產物測定，結果如圖7所示，PE-3合成了408.4 mg/L的2-PE，是出發菌株的10倍以上。以上結果證明，引入Aro4K229Lp和Aro7G141Sp并高表達Pha2p、Aro3p、Aro5p是提高畢赤酵母2-PE合成能力的有效策略。

3 結論與討論

基于golden gate組裝的基因操作工具已在多種酵母中得到應用[16-18]，本研究以此為基礎，建立了一種畢赤酵母多基因組裝系統，進行了7個原件的連接，轉化后平板白色菌落在90%以上，說明該系統可以實現多片段的高效組裝。使用該方法構建質粒可通過直觀的熒光變化篩選到陽性克隆，菌株抗性可消除，目的基因的表達方式、啟動子、終止子、整合位點均可靈活調整。利用MGAS，對畢赤酵母2-PE合成途徑進行了一系列改造：通過游離表達不同來源的關鍵酶，解除負反饋抑制；整合表達ARO4K229L、ARO7G141S、PHA2、ARO3、ARO5，增加了莽草酸途徑通量，最終構建的重組菌株2-PE產量達到了408.4 mg/L。本研究可為畢赤酵母代謝工程提供一種高效的多基因組裝方法，也為畢赤酵母合成高附加值代謝物提供了參考。

a-PE-3發酵液中2-PE濃度；b-PE-3生長曲線圖7 菌株PE-3的發酵結果Fig.7 Fermentation performance of strains PE-3