Caldisericum exile來源新嗜熱脂肪酶的發現及酶學特征的研究

劉捷婧，王敏婷，周于婷，陳萍，歐陽永長

(廣州醫科大學 生物技術系，廣東 廣州，511436)

脂肪酶(lipase, EC3.1.1.3)，是一類在親水親脂界面分解和合成甘油三酯的酶，底物一般為長碳鏈(C8以上)的酰基甘油。這些酶在結構上都有α/β水解酶的折疊形式和保守的GXSXG五肽模體，屬于絲氨酸水解酶類[1]。但在脂肪酶的應用中，尤其是工業生產中，對酶熱穩定性的要求比較高，而天然脂肪酶的熱穩定性常常難以滿足生產要求。因此，對嗜熱脂肪酶新酶的開發和研究一直是脂肪酶研究的重要方向之一。

嗜熱微生物能夠適應極端的生存環境是其不斷進化的結果，其體內有較大可能會存在與高溫環境相適應的各種酶類[2]。目前已從多種嗜熱環境微生物的發酵產物中獲得了不同的嗜熱脂肪酶如Amycolatopsismediterranei[3]、Aneurinibacillusthermoaerophilus[4]、Geobacillusthermoleovorans[5-6]、Bjerkanderaadusta[7]、Lactobacillusplantarum[8]、Staphylococcusaureus[9]、Streptomycesthermocarboxydus[10]、Thermoanaerobacterthermohydrosulfuricus[11]、Thermosyntrophalipolytica[12]。此外，利用宏基因組技術繞過微生物培養環節，直接將環境樣品中的DNA異源表達后再篩選產物的方法，同樣從熱泉環境中發現了多個嗜熱的新脂肪酶[13-14]。

隨著測序技術的發展，微生物基因組數據和各種環境的宏基因組測序數據獲得急速增長。這些海量數據的絕大部分只有簡單的注釋，其具體功能特征并不清楚。這意味著上述測序數據里，尤其是來源于新微生物或極端環境的數據中蘊含著大量的等待挖掘的新基因和新酶。周艷杰等[15]從嗜熱玫瑰紅球菌ThermomicrobiumroseumDSM 5159的基因組數據中發現了新嗜熱脂肪酶。有研究從基因數據庫中篩選到來源于超嗜熱菌AquiexaeolicusVF5的兩種嗜熱新酯酶Aaeo1和Aaeo2[16]。同時，ABDELMONAEM等[17]、YADAVA等[18]研究表明脂肪酶在進化過程中具有菌屬特征。因此，本文考慮從特殊的嗜熱菌群中通過生物信息學手段結合異源表達技術來發現新嗜熱脂肪酶。

CaldisericumexileAZM16c01是熱泉新菌[19]，為厭氧、嗜熱、革蘭氏陰性纖細熱絲菌。最適生長溫度為65 ℃，最適pH為6.5，對NaCl非常敏感。其基因組測序已完成，該文對其進行基因資源篩選分析，發現 BAL81435.1(GenBank ID)為酯酶，經試驗證實，該酯酶具有脂肪酶的特性。據我們所知，這是首次對來源于Caldiserica新門的嗜熱脂肪酶特征的描述。該研究為新酶的快速開發提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料

基因序列BAL81435.1由上海生物工程有限公司合成并克隆到pET28(a)載體上(在載體BamHI/XhoI之間插入該基因編碼框，使其表達的重組蛋白N末端帶有6×His 標簽)，獲得pET28a-lipase-BAL質粒。DH5α, Rosetta 感受態細胞，上海唯地生物有限公司。

1.2 主要試劑

Ni-NTA Sefinose Resin試劑盒、Tube-O-DIALYZER透析柱、BCA蛋白濃度測定試劑盒、His單克隆抗體和二抗，上海生物工程有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 蛋白質表達、純化和鑒定

將質粒pET28a-lipase-BAL轉化入Rosetta細胞中。向100 mL新鮮LB培養基中加入2 mL過夜培養的陽性克隆菌液，于37 ℃培養2～4 h至OD600值約為0.4～0.6，然后向培養基中加入終濃度為1 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG)，繼續在25 ℃下誘導培養12～16 h。離心回收菌體，棄上清液，加入8 mL破碎緩沖液(含有PBS、300 mmol/L NaCl、3% Triton X-100)重懸菌體，超聲破碎，4 ℃12 000 r/min離心15 min保留上清液。上清液經Ni-NTA Sefinose離子親和層析純化重組蛋白，操作步驟參照說明書進行。250 mmol/L咪唑洗脫得到的重組蛋白經Tube-O-DIALYZER透析柱除去咪唑后，用于鑒定和后續試驗。蛋白表達樣品和純化后蛋白樣品利用SDS-PAGE電泳和Western Blot(一抗為His單抗)進行鑒定。

1.3.2 脂肪酶活力測定

脂肪酶活性測定采用參考文獻[20]對硝基苯酚(para-nitrophenol，p-NP)比色法進行。其過程簡述如下：溶液A：稱取適量的底物對硝基苯磷酸酯(para-nitrophenyl phosphate，p-NPP)溶于30 mL異丙醇中；溶液B：配制適量濃度為100 mmol/L的Tris-HCl緩沖液(pH為8.8)。將A和B溶液混勻置于適當溫度下反應一定時間，通過測定OD405值，由p-NP標準曲線計算p-NP的量，換算成酶活性單位。1U表示在上述條件下，每分鐘催化p-NPP釋放1 μmol/Lp-NP所需的酶量。

1.3.3 溫度對酶活性的影響

將0.1 mL溶液A和3.7 mL溶液B充分混勻后，加入0.2 mL酶液，以等體積的滅活的酶液為對照，在不同溫度下(4、18、25、37、42、50、60、70、75 ℃)反應30 min后，測定OD405值，計算酶活性。

將0.1 mL溶液A和3.7 mL溶液B充分混勻后，加入0.2 mL酶液，在不同溫度下(37、42、60、70 ℃)反應90 min，并分別在不同時間段(15、30、45、60、90 min)取樣測定OD405值，計算酶活性，以檢測脂肪酶的溫度耐受性。

1.3.4 pH對酶活性的影響

取0.1 mL溶液A至3.7 mL pH不同(6.8、8.0、8.4、8.8、9.2、9.6、10.4、10.6)的溶液B中，加入0.2 mL酶液，在最適溫度下反應30 min后，測定OD405值，計算酶活性。

1.3.5 有機溶劑對酶活性的影響

將0.1 mL溶液A和3.7 mL溶液B充分混勻后，分別加入不同濃度(5%、10%)，不同種類(甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、乙氰、二甲基亞砜)的有機溶劑，充分混勻，加入0.2 mL酶液，在最適溫度下反應30 min測定其OD405值，計算酶活性。

1.3.6 表面活性劑、變性劑及金屬離子對酶活性的影響

將0.1 mL溶液A和3.7 mL溶液B混勻后，加入適量表面活性劑、變性劑或金屬離子，加入0.2 mL酶液，在最適溫度下反應30 min測定其OD405值，計算酶活性。

1.4 數據分析方法

參照JO等[5]、ABDELMONAEM等[17]、YADAVA等[18]的研究從NCBI數據庫中，提取代表性lipase脂肪酶序列。首先，利用clustal W程序對得到酶蛋白序列進行多序列比對[21]。然后，利用Mega X程序基于連接法(bootstrap 自檢1 000次)構建進化樹[21]。

2 結果與分析

2.1 BAL81435.1序列分析

CaldisericumexileAZM16c01是海洋熱泉來源的厭氧、嗜熱、革蘭氏陰性纖細熱絲菌，最適生長溫度為65 ℃，其基因組測序已經完成，目前未見與該菌有關的脂肪酶研究報道。對該菌的基因組數據(AP012051.1)篩選發現序列BAL81677和BAL81435.1的功能注釋為酯酶。對BAL81435.1的進一步分析發現，其預測蛋白分子質量大小為28 kDa，等電點為6.6，無信號肽(http://smart.embl.de/)。利用blast比對發現(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，與BAL81435.1序列相似性高的序列分布于多個種屬，大部分都來源于熱泉環境。進一步選擇與BAL81435.1編碼蛋白Identity>40%的代表性序列進行多序列比對，結果如圖1所示。這些酶存在多個保守區域，其中催化區域[Gly-X(1)-Ser-X(2)-Gly-]中絕大多數的X(1)為Lys，X(2)為Met，并且該模體后都緊鄰接Gly，催化區域呈現GLSMGG模式。在DEMIRJIAN等[1]、ATALAH等[2]的研究中，分子進化分析顯示脂肪酶可以分為六大類。為進一步分析BAL81435.1與其他脂肪酶的進化關系，該文選擇了脂肪酶各類代表性序列和酯酶序列，以鄰居連接(neighbor-joining, N-J)方法構建了進化樹，結果如圖2所示，BAL81435.1及其他Caldiserica來源的序列與其他脂肪酶和酯酶有著不同的進化分支。這可能表明BAL81435.1編碼新的嗜熱脂肪酶。為驗證這個猜想，該研究對該序列的表達產物進行了研究。

圖1 BAL81435.1編碼蛋白與其同源性較高的蛋白多序列比對結果Fig.1 BAL81435.1encoding protein and its high homology protein multiple sequencecomparison results

圖2 脂肪酶的系統進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of lipase 注：BAL81435.1及其相關蛋白的系統發育分析;系統進化樹 采用鄰居連接法(MEGAX.0軟件)生成;從GenBank中提取 原細菌脂解酶的蛋白序列;節點上的數字表示1 000個重復的 bootstrap百分比;■表示該研究選擇的研究對象

2.2 BAL81435.1基因的表達純化

將含有BAL81435.1基因序列的pET28a-lipase-BAL質粒，轉入Rosetta感受態細胞中并利用IPTG誘導其蛋白表達。在37 ℃誘導表達下，重組蛋白絕大部分以包涵體形式存在(結果未展示)，但降低宿主表達溫度，在25 ℃誘導下，重組蛋白能以可溶形式存在，結果如圖3所示。通過菌體破碎，低溫離心，上清液組分經過Ni-NTA 柱純化，獲得脂肪酶。由SDS-PAGE結果可見，純化后的蛋白在25～35 kDa有唯一條帶(圖3)，符合預期大小。利用His單抗(上海生物工程有限公司)的Western Blot檢測結果表明該重組蛋白帶有His標簽(結果未展示)。以上結果顯示成功得到了純化的重組蛋白。

2.3 BAL81435.1基因編碼脂肪酶的特征

2.3.1 脂肪酶的催化活性

利用p-NP比色法檢測pET28a-lipase-BAL表達并純化的重組蛋白的酯酶活性。該重組蛋白催化p-NPP長鏈底物的活性較高，尤其是C12以上的底物，而對短鏈底物的催化活性較弱，最適底物為C16的p-NPP，結果如圖4-a所示。結果表明該重組脂肪酶為“真正”脂肪酶，而非數據庫中注釋的酯酶。

1-pET28a-lipase-BAL經IPTG誘導(1 mmol/L IPTG，25 ℃ 誘導12～16 h)后的總蛋白；2-破碎離心后得到的沉淀；3-破碎 離心后得到的上清液可溶蛋白；4-Ni-NTA 純化后的蛋白圖3 pET28a-lipase-BAL在Rosetta中的表達純化Fig.3 Expression and purification of pET28a-lipase-BAL in Rosetta

2.3.2 溫度對酶活性的影響

不同溫度下(4、18、25、37、42、50、60、70、75 ℃)檢測重組蛋白脂肪酶的活性，結果如圖4-b所示，結果表明該酶的最適溫度為60 ℃。

該脂肪酶的耐溫試驗表明，該重組蛋白在60 ℃及以下時，可在90 min內保持穩定，但在70 ℃蛋白的穩定性較差，酶活性明顯下降(圖4-c)。進一步試驗表明該脂肪酶在4 ℃保存5 d，酶活性影響較少(結果未展示)。

2.3.3 pH對酶活性的影響

在不同pH值下(6.8、8.0、8.4、8.8、9.2、9.6、10.4、10.6)測定酶的活性，結果表明該脂肪酶最適pH為8.8，且pH的變化對酶的活性影響較為明顯(圖4-d)。

2.3.4 金屬離子對酶活性的影響

金屬離子常常作為酶的輔基或激活劑，通過自身化合價的變化來傳遞電子，完成生物體內的氧化還原反應。常見的金屬離子中，一價或者二價的金屬離子對酶活性影響較大[22]。該研究挑選了幾種較為常見的金屬離子，檢測它們對該重組脂肪酶活性的影響。通過在酶反應體系中加入終濃度為10 mmol/L的不同金屬離子如Ni2+、Cu2+、Ca2+、Mg2+、K+、Na+，結果表明除Ni2+、Ca2+和Na+外，其他離子都能促進酶的反應(圖4-e、表1)，且Na+離子濃度超過0.2 mol/L時，其抑制作用趨于穩定(圖4-e)。

2.3.5 不同有機溶劑對酶活性的影響

極性有機溶劑會通過改變脂肪酶分子的構象，促進酶與底物的結合，從而提高酶的催化性能[23]。為研究有機溶劑對重組脂肪酶活性的影響，該研究選擇了幾種極性不同的有機溶劑：甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、乙氰、二甲基亞砜，分別加至酶反應體系的5%或10%后測定酶活性。結果表明重組脂肪酶對低濃度有機溶劑比較耐受，甚至5%二甲基亞砜濃度對重組脂肪酶活性還有10%作用的增強作用。但是高濃度(10%)的氯仿和乙氰則明顯抑制重組脂肪酶的活性，使酶活性分別降低65%和45%(表2)。

a-脂肪酶催化不同長度p-NPP底物(C2、C4、C6、C8、C12、C14、C16、C18)的活性；b-不同溫度下(4、18、25、37、42、50、60、70、75 ℃)脂肪酶 的活性；c-脂肪酶對不同溫度(37、42、60、70 ℃)的耐受試驗；d-不同pH值下(6.8、8.0、8.4、8.8、9.2、9.6、10.4、10.6)脂肪酶的活性； e-脂肪酶對不同濃度Na+(0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L)的耐受試驗圖4 BAL81435.1基因編碼脂肪酶的特征Fig.4 Characteristics of lipase encoded by BAL81435.1 gene

表1 金屬離子對酶活性的影響Table 1 Effects of metal ions on enzyme activity

表2 有機溶劑對酶活性的影響 單位：%

2.3.6 表面活性劑對酶活性的影響

表面活性劑Triton X-100、Tween 80、Tween 20等都對重組脂肪酶的活性影響較大，上述試劑的1% 可使重組酶喪失絕大部分活性或完全失去活性(表3)。十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)、EDTA和Urea同樣對酶活性影響較大，5 mmol/L的濃度可使酶活性降低近一半或喪失大部分活性(表3)。

表3 表面活性劑、變性劑對酶活性的影響Table 3 Effects of surfactants and denaturing agents on enzyme activity

3 結論

CaldisericumexileAZM16c01是來源于日本熱泉的嗜熱性微生物，是Caldiserica新門的代表性菌株。該文以CaldisericumexileAZM16c01為研究對象，對其基因組信息進行篩選和分析，發現BAL81435.1預測為酯酶，但脂肪酶的進化樹顯示BAL81435.1不同于脂肪酶已有的6個進化分支，也不同于酯酶。對其重組表達產物進行功能研究，確定BAL81435.1的功能，試驗結果表明BAL81435.1編碼的嗜熱脂肪酶，其底物為長碳鏈(C12以上)的p-NPP，目前最適底物為C16的長碳鏈，最適pH值為8.8，最適溫度在60 ℃，在4～60 ℃具有較好的溫度耐受性。該脂肪酶對大部分有機溶劑、金屬離子、變性劑及高濃度的NaCl有較好的耐受性，但對表面活性劑敏感。

近年來微生物資源，尤其是生存環境比較特殊的極端微生物和海洋微生物，成為潛在的特性基因資源挖掘的主要對象。傳統的培養方法、定向進化和功能驅動的宏基因組方法盡管可以有目的的篩選出特性基因資源，但受培養條件、篩選模式、操作繁瑣等影響導致開發效率較低。該文基于已有序列的進化分析，結合異源表達等證實BAL81435.1為新嗜熱脂肪酶，過程相對簡潔，為快速發現特異的基因資源提供可選途徑。