嗜鹽白蟻菌褐藻膠裂解酶的重組表達(dá)與改造優(yōu)化

吳雯，朱風(fēng)帥，俞嘉樂，李恒*，龔勁松，許正宏，史勁松

1(糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點實驗室，江南大學(xué) 生命科學(xué)與健康工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)2(糧食發(fā)酵與食品生物制造 國家工程研究中心，江南大學(xué)，江蘇 無錫，214122)3(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

褐藻膠是海洋多糖資源中含量最為豐富的一類多糖，由β-D-甘露糖醛酸(β-D-mannuronic，M)和α-L-古羅糖醛酸(α-L-guluronic，G)通過β-1,4糖苷鍵連接而成[1]。褐藻膠分子質(zhì)量大、黏度高，對其充分利用開發(fā)的基礎(chǔ)是高效降解為較低分子質(zhì)量的低聚糖。褐藻膠寡糖不僅改善了多糖物化性質(zhì)的局限性，同時具有抗炎、抑菌、抗腫瘤、免疫與腸道菌群調(diào)節(jié)等多種生理活性[2-3]。我國首個獲批的通過靶向腦-腸軸治療阿爾茨海默癥的新藥——甘露特鈉膠囊(代號GV-971，商品名“九期一”)，即是以褐藻提取物為原料衍生制備得到的低分子酸性寡糖化合物，這也進(jìn)一步推動了海洋功能糖資源開發(fā)方向的研究。

褐藻膠裂解酶是高效、特異性降解褐藻膠的一種重要工具酶[4-5]，所得寡糖產(chǎn)物在非還原端糖醛酸殘基C4與C5間形成的不飽和雙鍵有利于進(jìn)一步結(jié)構(gòu)改造和衍生開發(fā)。褐藻膠裂解酶可以廣泛地從海洋動物、海洋藻類及微生物等多種來源中分離得到，其中，微生物來源的酶最為豐富，已達(dá)上百種，如IsoptericolahalotoleransWX[6]、Sphingomonassp.MJ-3[7]和Flavobacteriumsp.S20[8]等。然而，野生菌產(chǎn)酶普遍存在酶活力低、穩(wěn)定性差、難分離等問題，這些可借助基因工程技術(shù)對酶的高效表達(dá)而有效改善。褐藻膠裂解酶的重組表達(dá)體系以大腸桿菌(Escherichiacoli)為主。比較來看，枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)作為另一種表達(dá)外源蛋白的成熟工具菌株，具有更為突出的蛋白分泌能力[9-10]，且已被美國食品和藥物管理局和歐洲食品安全局批準(zhǔn)為可食用的安全菌株[10]。目前，利用芽孢桿菌表達(dá)褐藻膠裂解酶的工作還較少，表達(dá)后的酶活力也普遍偏低，如來源于Flavobacteriumsp.strain A1的褐藻膠裂解酶A1-Ⅲ，在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)量為0.3 g/L[11]；本課題組前期構(gòu)建的一株產(chǎn)褐藻膠裂解酶的BacillussubtilisWB600/pMA5-aly-cob酶活力也僅21.71 U/mL，表明利用枯草芽孢桿菌體系重組表達(dá)褐藻膠裂解酶的研究還有待深入。

實驗室前期從腐爛海帶中分離得到一株I.halotoleransWX，野生菌產(chǎn)酶活力達(dá)到432 U/mL[12]，具有良好的降解褐藻膠的能力。本研究通過基因克隆的方法獲得了褐藻膠裂解酶產(chǎn)酶基因aly-ih，構(gòu)建了枯草芽胞桿菌工程菌，并聯(lián)合通過啟動子改造、培養(yǎng)基優(yōu)化的方法提高褐藻膠裂解酶的活力，為進(jìn)一步推動該酶及其降解產(chǎn)物的應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

I.halotoleransWX、E.coliJM109、B.subtilisWB600和質(zhì)粒pMA5保存在本實驗室；Taq、PrimerSTAR HS、DpnI、DNA聚合酶，TaKaRa公司；ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit，諾維贊生物科技股份有限公司；聚β-D-甘露糖醛酸(pM，>97%)和聚α-L-古羅糖酸(pG，>97%)，青島博智匯力生物技術(shù)有限公司；其余試劑均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2100紫外分光光度計，美國尤尼柯儀器有限公司；T100熱循環(huán)PCR儀，美國Bio-Rad公司；NanoDrop One/OneC微量核酸蛋白濃度測定儀，美國Thermo Fisher科技公司；SW-CJ-2FD/2F超凈工作臺、SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱，上海博迅實業(yè)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 褐藻膠裂解酶的異源表達(dá)

以菌株I.halotoleransWX基因組為模板，設(shè)計特異性引物為aly-ih-F:aaatcagggggatccATGAGACTCCACCGCA；aly-ih-R:acctctagaacgcgtTCAGGAGTGCTTGA(小寫字母為同源臂)，將擴(kuò)增出的目的片段與酶切后的pMA5線性質(zhì)粒進(jìn)行同源重組連接，通過熱擊法將連接產(chǎn)物導(dǎo)入克隆宿主E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞，挑取轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR及測序驗證。對測序驗證正確提取質(zhì)粒，導(dǎo)入表達(dá)宿主B.subtilisWB600中，挑取轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR驗證并測序驗證。將構(gòu)建好的重組表達(dá)質(zhì)粒命名為pMA5-aly-ih，工程菌命名為B.subtilis-pMA5-aly-ih。

1.3.2 工程菌發(fā)酵條件及酶活力測定

工程菌在含0.1%(體積分?jǐn)?shù))卡那霉素的LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，之后按照1%(體積分?jǐn)?shù))的接種量接種于TB培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min發(fā)酵36 h。離心分別收集上清液和菌體用于測定胞外與胞內(nèi)酶活力。采用改良3，5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid，DNS)法[12]測量還原糖濃度。將0.1 mL酶液加入0.9 mL 10 g/L 海藻酸鈉溶液中，混勻后于45 ℃反應(yīng)20 min，然后向體系中加入1 mL DNS，沸水浴3 min終止反應(yīng)，迅速定容至10 mL，吸取200 μL 加入96孔板，于520 nm 處測定吸光值。對照組為去離子水。1個酶活力單位(U)定義：上述條件下，1 mL 的酶液每分鐘產(chǎn)生1 μg 還原糖所需的酶量。

1.3.3 SDS-PAGE分析驗證

將收集的胞外粗酶樣品與4倍 Loading Buffer混合，置于100 ℃金屬浴5 min，使蛋白變性。Maker與變性后的蛋白上樣量分別為5、20 μL。電泳條件為80 V，30 min以及120 V，70 min。最后用考馬斯亮藍(lán)染色2 h，再利用洗脫液[V(水)∶V(甲醇)∶V(冰醋酸)=6∶3∶1]脫至背景無色，拍照分析。

1.3.4 啟動子改造

從NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的B.subtilis168(ACCESSION:NC_000 964)基因組中獲得組成型或自誘導(dǎo)型啟動子的基因序列，包括trnQ、sigX、yolA、wapA、gapB、cdd、veg、mpr、nprE、aprE、epr、bpr、nprB、pst、gsiB、srfA共16條啟動子序列。以B.subtilis168 基因組為模板，分別采用表1所示的引物擴(kuò)增啟動子序列，以 pMA5 質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增去除原有啟動子HpaII的全質(zhì)粒片段；之后利用同源重組的方法將待替換啟動子序列插入至原啟動子位置。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和鑒定后，轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主B.subtilisWB600感受態(tài)細(xì)胞。通過酶活力比較，篩選合適的啟動子。進(jìn)一步考查啟動子拷貝數(shù)的影響，以篩選得到的重組質(zhì)粒mpr-pMA5-aly-ih為模板，擴(kuò)增其全質(zhì)粒片段，同上采用同源重組的方法將啟動子mpr添加到原有mpr序列后，獲得啟動子拷貝數(shù)為2的重組質(zhì)粒mpr×2-pMA5-aly-ih，工程菌命名為B.subtilis-mpr×2-pMA5-aly-ih。啟動子拷貝數(shù)為3和4的構(gòu)建方法以此類推。

表1 擴(kuò)增啟動子的引物序列Table 1 Primer sequences for promoter amplification

1.3.5 褐藻膠裂解酶培養(yǎng)基優(yōu)化

(1)碳源種類篩選及濃度優(yōu)化:選擇初始質(zhì)量濃度為4 g/L的甘油、玉米糊精、D-無水葡萄糖、D-麥芽糖、可溶性淀粉和蔗糖；對篩選得到的碳源進(jìn)一步優(yōu)化濃度，設(shè)置質(zhì)量濃度為1、4、8、12、16、20、24、28 g/L。

(2)氮源種類篩選及濃度優(yōu)化:初始質(zhì)量濃度為12 g/L的胰蛋白胨、蛋白胨、棉籽餅粉、大豆蛋白胨、酵母浸膏、玉米漿；對篩選得到的氮源進(jìn)一步優(yōu)化濃度，設(shè)置質(zhì)量濃度為1、4、8、12、16、20、24、28 g/L。

(3)金屬離子種類篩選及濃度優(yōu)化:初始濃度均為2 mmol/L Na+、K+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Ca2+、Mn2+、Fe2+(對應(yīng)的試劑分別為氯化鈉、硫酸鉀、硫酸鎂、硫酸鋅、無水硫酸銅、氯化鈣、五水合硫酸錳、七水合硫酸亞鐵)；對篩選得到的金屬離子進(jìn)一步優(yōu)化濃度，設(shè)置濃度為2、4、6、10、15、20、25、30 mmol/L。

分別按照上述培養(yǎng)基的配方優(yōu)化褐藻膠裂解酶發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵條件按照實驗步驟1.3.2。

1.3.6 褐藻膠酶解

配制質(zhì)量濃度分別為1、5、10 g/L的海藻酸鈉底物溶液，酶解4 h，分別在0.2、0.5、1、1.5、2.0、2.5、3、3.5、4 h時取樣測定還原糖含量，方法同1.3.2。

1.3.7 褐藻膠寡糖平均聚合度測定

采用苯酚-硫酸法測定總糖濃度[13]，以總糖濃度與還原糖濃度的比值定義為平均聚合度，監(jiān)測酶解過程。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組褐藻膠裂解酶的構(gòu)建與表達(dá)

2.1.1 工程菌的構(gòu)建

從實驗室前期篩選的I.halotoleransWX中克隆得到一段大小為771 bp的序列(圖1-a)，編碼 256個氨基酸殘基，其中信號肽序列為Met 1-Ala 32(圖2)。以限制性內(nèi)切酶BamH I和MluI對表達(dá)質(zhì)粒pMA5進(jìn)行雙酶切(圖1-b)，通過同源重組構(gòu)建重組質(zhì)粒，隨后轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主菌B.subtilisWB600感受態(tài)細(xì)胞中。結(jié)果表明，重組質(zhì)粒的PCR產(chǎn)物在771 bp處有單一條帶(圖1-c)。測序正確的重組質(zhì)粒命名為pMA5-aly-ih，工程菌命名為B.subtilis-pMA5-aly-ih。

2.1.2 重組褐藻膠裂解酶的表達(dá)及酶活力測定

將構(gòu)建成功的B.subtilis-pMA5-aly-ih工程菌進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。分別測定發(fā)酵上清液及胞內(nèi)酶活力，結(jié)果如表2所示，重組酶Aly-IH主要分泌到胞外，酶活力約30.3 U/mL。通過SDS-PAGE分析后發(fā)現(xiàn)，在25～35 kDa有1條單一、明亮的條帶(圖3)，與Aly-IH蛋白理論分子質(zhì)量28 kDa吻合。依據(jù)文獻(xiàn)[14]中有關(guān)褐藻膠裂解酶分類，該酶屬于低分子質(zhì)量的褐藻膠裂解酶。

a-褐藻膠裂解酶基因aly-ih擴(kuò)增(M-2 000 bp DNA Maker；1-aly-ih擴(kuò)增 產(chǎn)物)；b-雙酶切后的pMA5質(zhì)粒(M- 10 000 bp DNA Maker；1-BamH I 和Mul I酶切后的pMA5質(zhì)粒)；c-工程菌B.subtilis-pMA5-aly-ih 驗證(M-2 000 bp DNA Maker；1-B.subtilis-pMA5- aly-ih PCR驗證)圖1 重組表達(dá)載體的構(gòu)建Fig.1 Construction of recombinant expression vector

圖2 褐藻膠裂解酶Aly-IH的氨基酸序列Fig.2 Amino acid sequence of Aly-IH 注:紅色方框表示信號肽

表2 工程菌發(fā)酵產(chǎn)酶活力Table 2 Enzymatic activity of recombinant enzyme

M-Marker；1-重組表達(dá)后的Aly-IH圖3 重組褐藻膠裂解酶SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of recombinant alginate lyase

2.2 褐藻膠裂解酶Aly-IH的啟動子改造

2.2.1 啟動子替換

將內(nèi)源性啟動子HpaⅡ替換為B.subtilis168來源的16條啟動子。結(jié)果顯示，啟動子替換為sigX、P43、epr、bpr、nprB、pst、srfA后，Aly-IH的酶活力提高了20%～53%；替換為nprE和aprE后，酶活力提高至2.8倍；替換為veg和mpr后，酶活力提高最為顯著，特別是啟動子mpr，可以將酶活力提高至初始酶活力的4倍(圖4)。因此，選擇mpr作為進(jìn)一步優(yōu)化的啟動子序列。

圖4 啟動子替換對酶活力的影響Fig.4 Effect of promoter on enzymatic activity

2.2.2 啟動子拷貝數(shù)優(yōu)化

通過啟動子串聯(lián)提高mpr拷貝數(shù)。相較于單啟動子，通過多拷貝啟動子優(yōu)化后，酶活力隨拷貝數(shù)增加而增加，當(dāng)拷貝數(shù)為3時，發(fā)酵36 h時Aly-IH酶活力最高可達(dá)到154 U/mL。拷貝數(shù)進(jìn)一步增加時酶活力降低。結(jié)合工程菌的生長曲線分析發(fā)現(xiàn)，高拷貝數(shù)影響菌體生長，隨拷貝數(shù)增加，OD600值逐漸下降，在發(fā)酵36 h時，OD600值由12.1降至10.2。依據(jù)酶活力，后續(xù)研究選擇mpr拷貝數(shù)為3的工程菌作進(jìn)一步優(yōu)化。

a-啟動子拷貝數(shù)優(yōu)化后Aly-IH酶活力；b-啟動子拷貝數(shù)優(yōu)化后工程菌生長曲線圖5 啟動子拷貝數(shù)的影響Fig.5 Effect of promoter copy number

2.3 褐藻膠裂解酶的培養(yǎng)基優(yōu)化

2.3.1 碳源優(yōu)化

選擇初始質(zhì)量濃度為4 g/L的甘油、玉米糊精、D-無水葡萄糖、D-麥芽糖、可溶性淀粉和蔗糖作為碳源進(jìn)行優(yōu)化。相較其他碳源，甘油培養(yǎng)時OD600值最高，酶活力也略高于其他種類碳源(圖6)。進(jìn)一步優(yōu)化甘油濃度發(fā)現(xiàn)，質(zhì)量濃度在16 g/L時酶活力最高，同時隨著甘油濃度的提高菌體生長量呈現(xiàn)下降趨勢。這說明甘油有利于菌體生長和產(chǎn)酶，但過高濃度可能會影響甘油代謝酶促反應(yīng)進(jìn)而影響菌株生長和產(chǎn)酶[15]。

a-碳源種類；b-甘油濃度優(yōu)化圖6 碳源對生長與產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effect of carbon source on strain growth and enzymatic activity

2.3.2 氮源優(yōu)化

分別以初始質(zhì)量濃度為12 g/L的胰蛋白胨、蛋白胨、棉籽粉、酵母浸膏、大豆蛋白胨和玉米漿作為氮源進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)。結(jié)果顯示，大豆蛋白胨為氮源時菌體生長與產(chǎn)酶情況均較好(圖7-a)。進(jìn)一步優(yōu)化得到大豆蛋白胨最優(yōu)添加質(zhì)量濃度為16 g/L。過高濃度的大豆蛋白胨引起酶活力和OD600值的下降(圖7-b)。經(jīng)氮源優(yōu)化后Aly-IH酶活力達(dá)到220 U/mL左右。

2.3.3 金屬離子優(yōu)化

考查初始濃度為2 mmol/L的Na+、K+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Ca2+、Mn2+、Fe2+的不同金屬離子對酶活力的影響。添加K+、Zn2+、Mg2+、Ca2+、Mn2+可顯著提高酶活力(圖8-a)，特別是添加Mn2+時，酶活力和OD600值分別達(dá)到230 U/mL和9.6，效果最佳。繼續(xù)探究不同濃度Mn2+對酶活力的影響發(fā)現(xiàn)，Mn2+濃度的增加可促進(jìn)酶活力的提高，當(dāng)增加至25 mmol/L時酶活力達(dá)到最高，為320 U/mL，進(jìn)一步提高濃度則表現(xiàn)出明顯的抑制作用(圖8-b)。說明過高濃度的Mn2+對產(chǎn)酶有一定的副作用。

a-氮源種類；b-大豆蛋白胨濃度優(yōu)化圖7 氮源對生長與產(chǎn)酶的影響Fig.7 Effect of nitrogen source on strain growth and enzymatic activity

a-金屬離子種類；b-Mn2+濃度優(yōu)化圖8 金屬離子對生長與產(chǎn)酶的影響Fig.8 Effect of metal ion on strain growth and enzymatic activity

2.4 褐藻膠裂解酶的酶解應(yīng)用

為了探究Aly-IH降解海藻酸鈉的情況，分別選取1、5、10 g/L的底物進(jìn)行酶解實驗。如圖9-a所示，酶解0～2 h，酶解液中還原糖濃度隨時間延長而迅速增加；2 h時，酶解速率降低，還原糖濃度增加緩慢；進(jìn)一步延長時間并不能顯著促進(jìn)酶解。不同底物濃度下酶解行為基本相同，酶解在3 h均達(dá)到終點。平均聚合度測定結(jié)果顯示，低濃度底物酶解時，底物快速降解，但隨酶解過程的進(jìn)行，不同濃度底物酶解的最終產(chǎn)物平均聚合度均為2.3(圖9-b)。

a-還原糖產(chǎn)生量變化；b-平均聚合度變化圖9 海藻酸鈉的酶解與產(chǎn)物平均聚合度的測定Fig.9 Enzymatic hydrolysis of sodium alginate and determination of the average degree of polymerization of hydrolysates

3 結(jié)論與討論

褐藻膠裂解酶可高效且特異性降解褐藻膠制備褐藻膠寡糖，在海洋多糖利用開發(fā)中具有重要應(yīng)用[16]。從海洋等環(huán)境樣本中獲得的大部分野生酶存在活力弱、產(chǎn)量低、難分離等問題，這在一定程度上限制了其推廣應(yīng)用。利用基因工程技術(shù)進(jìn)行酶的表達(dá)和改造是進(jìn)一步提高褐藻膠裂解酶活力的有效途徑。目前，褐藻膠裂解酶的異源表達(dá)體系多為大腸桿菌，如來源于Vibriosp.NJ04的AlgNJ04比酶活力達(dá)2 416 U/mg[17]，來源于Microbulbifersp.BY17的BY17PV7比酶活力達(dá)(150.42±3.32) U/mg[18]。與此相比，枯草芽孢桿菌因其強(qiáng)大的蛋白分泌能力，可大大簡化重組酶下游分離的流程和投入，是食品、藥品行業(yè)中眾多重組酶分泌表達(dá)的理想宿主。但是目前報道的利用枯草芽孢桿菌成功表達(dá)的褐藻膠裂解酶還不多，且酶活力普遍不高。RHEIN-KNUDSEN等[19]最新報道了來源于北極大洋中脊(AMOR)宏基因組文庫里的嗜熱褐藻膠裂解酶AMOR-PL7 和AMOR-PL17，發(fā)酵50 h后還原糖濃度分別為3.5、2.5 mmol/L，酶活力換算約為315、225 U/mL(OD600值分別為9和7)。現(xiàn)階段，借助發(fā)酵技術(shù)可顯著提高枯草芽孢桿菌產(chǎn)酶水平，如黃桿菌來源的褐藻膠裂解酶rFlAlyA在枯草芽孢桿菌表達(dá)后，通過高密度發(fā)酵OD600值達(dá)85，最高酶活力為2 550 U/mL[20]。南寧漢和生物與中科院天津工生所合作，采用枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)褐藻膠裂解酶實現(xiàn)酶活力全球最高。因此，進(jìn)一步利用B.subtilis體系探究并提高褐藻膠裂解酶的催化性能具有良好的應(yīng)用潛力。從實驗室前期篩得的一株高產(chǎn)褐藻膠裂解酶的菌株I.halotoleransWX中成功克隆出一段褐藻膠裂解酶基因aly-ih，基因全長771 bp，編碼256個氨基酸。進(jìn)而構(gòu)建了1株B.subtilis-pMA5-aly-ih工程菌，蛋白電泳結(jié)果顯示該重組褐藻膠裂解酶Aly-IH分子質(zhì)量為28 kDa，與理論分子質(zhì)量及野生菌產(chǎn)酶特性相符[12]，酶活力為30.3 U/mL。

在現(xiàn)代酶工程研究領(lǐng)域中，基因元件的精細(xì)表達(dá)與調(diào)控是高效提升酶的催化與應(yīng)用性能的策略之一。啟動子序列是決定RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄識別效率的重要因素，與目的蛋白的表達(dá)水平密切相關(guān)[21]。因此選擇合適的啟動子是提高蛋白產(chǎn)量的重要手段[22]。本研究中，采用啟動子替換及拷貝數(shù)優(yōu)化的方法考查啟動子元件對褐藻膠裂解酶表達(dá)的影響。實驗從B.subtilis168基因組中獲得16種組成型或自誘導(dǎo)型啟動子序列，將內(nèi)源性啟動子HpaⅡ換成mpr后，酶活力較初始增加至4倍。進(jìn)一步優(yōu)化啟動子拷貝數(shù)提高轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)串聯(lián)后的多拷貝啟動子能促進(jìn)褐藻膠裂解的酶活力提升，但同時也一定程度上抑制菌體生長[23]，其中mpr拷貝數(shù)為3時，酶活力最高且生長未受顯著影響。在此基礎(chǔ)上，優(yōu)化菌株培養(yǎng)條件，通過碳源、氮源和金屬離子的種類與濃度的優(yōu)化，Aly-IH酶活力達(dá)到320 U/mL，較初始酶活力提高至10.7倍。考查Aly-IH酶解褐藻膠的性能，該酶在0.5 h內(nèi)快速降解底物，3 h即完成酶解，所得寡糖產(chǎn)物的平均聚合度為2.3。由于該酶是內(nèi)切酶，且酶解產(chǎn)物主要為2-6糖，結(jié)合其降解特性可推測酶解產(chǎn)物中含有大量二糖，說明該酶具有較高的酶解效率。酶解產(chǎn)物的定量分析以及酶進(jìn)一步改造優(yōu)化工作仍在進(jìn)行中。

本研究構(gòu)建B.subtilis-pMA5-aly-ih工程菌，通過同源重組方法對其進(jìn)行啟動子改造，并通過培養(yǎng)基優(yōu)化使褐藻膠裂解酶的酶活力由初始30.3 U/mL提高至320 U/mL，可高效酶解獲得平均聚合度為2.3的寡糖產(chǎn)物。這為進(jìn)一步拓展褐藻膠裂解酶在枯草芽孢桿菌體系中的表達(dá)及其在食藥行業(yè)的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。