白酒大生產過程中乙醇穩定碳同位素變化特征研究

岳濤，王道兵，李安軍，姜利，李國輝，岳紅衛，張洛琪，鐘其頂*

1(安徽古井貢酒股份有限公司，安徽 亳州，236820)2(國家市場監管技術創新中心(輕工消費品質量安全)，北京，100015) 3(中輕食品檢驗認證有限公司，北京，100015)

白酒是中國特有的蒸餾酒產品，與白蘭地、蘇格蘭威士忌、伏特加、朗姆酒和杜松子酒并列為六大世界著名的蒸餾酒。白酒是傳統產品，也是滿足人們不斷進步的物質文化和精神文化需求不可或缺的、具有深厚歷史文化底蘊的飲品。

近年來，隨著白酒理化分析技術和白酒現代勾調技術的進步，助推了白酒產業高速發展，逐步形成了低端搶份額、中高端賺利潤的市場局面，但隨之而來的是競爭壓力增大，一些不法分子摻入食用酒精冒充固態法白酒的現象禁而不絕，這種“摻雜”“以次充好”等違法行為嚴重干擾了白酒市場的健康有序發展。國內學者很早就開始了對固態法白酒摻假的鑒別研究，并應用了多種分析檢測技術[1-4]，但這些基于理化分析和感官特征的研究都是分析特征物質的成分與含量，隨著檢測技術的蓬勃發展，白酒中特征物質的成分與含量將逐一破解，制假者可以進行“配方式”造假進而勾兌出與品牌白酒特征相近的白酒，造成上述方法的局限性逐漸增大。

穩定同位素技術是已被證實的可用于食品摻假檢測和真實性鑒別的有效技術手段，在葡萄酒[5]、蜂蜜[6-7]、果汁[8]等食品領域已得到成功應用，而在食醋、牛奶、植物油等領域的研究也正在展開[9-14]。在白酒領域，國內研究者也已取得一些關鍵性突破[15-16]，發現在白酒摻假鑒別領域的應用可行性。但上述研究多是針對白酒產品或科研性樣品，而由于穩定同位素的自然分餾特征以及白酒開放式、多糧多菌種混合發酵，鐘其頂等[15]曾提出應用同位素數據庫進行白酒的真偽鑒別，也有研究[17-18]清晰分析了酒精發酵過程與蒸酒過程的影響，但白酒大生產條件下的同位素分餾特征和變化規律尚不明確。基于此，本文利用該技術研究了白酒生產過程中乙醇穩定碳同位素變化規律，為白酒的真偽鑒別方案制定提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2018年—2021年新生產的基礎酒(經發酵、蒸餾而得到的未經勾兌的酒)270個、酒醅23個、成品白酒58個，均由酒廠提供，產品真實性可保障。

丙酮(色譜級)，上海麥克林有限公司；過二硫酸鈉、正磷酸(分析級)，國藥集團化學試劑有限公司；BCR 656標準品(δ13C=-26.91‰)，歐洲標準局。

1.2 儀器與設備

Trace GC Ultra氣相色譜儀、GC Isolink燃燒轉化裝置、Delta V Advantage穩定同位素比值質譜儀、DIONEX 3000液相色譜儀、LC Isolink轉化裝置，Thermo Fisher公司。

1.3 測定方法

1.3.1 氣相色譜-燃燒-穩定同位素比值質譜(gas chromatography-combustion-isotope ratio mass spectrometry,GC-C-IRMS)測定基礎酒乙醇δ13C

色譜條件：Wax毛細管柱(50 m×0.32 mm×0.20 μm)；載氣為氦氣；柱流速1.2 mL/min；進樣口溫度 200 ℃；升溫程序：起始溫度40 ℃，保持5 min，以2 ℃/min升溫至50 ℃，然后以25 ℃/min速率升溫達到200 ℃，保持2 min。進樣體積1 μL；分流比20∶1[17-18]。

燃燒轉化裝置：配備陶瓷(Al2O3)氧化管(填料為CuO，NiO和Pt)，工作溫度為1 000 ℃。

1.3.2 液相色譜-穩定同位素比值質譜(liquid chromatograph-isotope ratio mass spectrometry,LC-co-IRMS)測定酒醅乙醇δ13C[19]

色譜柱為Hyper REZ XP Carbohydrate H+柱(300 mm×7.7 mm，8 μm)；流動相為超純水，流速350 μL/min；柱溫30 ℃，進樣體積10 μL。磷酸溶液和過二硫酸鈉溶液作為反應助劑，流速0.05 mL/min。

1.4 結果計算

由于自然界中各元素的輕重同位素比值(R)變化程度較小，國際上通常采用相對測量法表示物質的同位素比值，碳元素的穩定同位素特征均以國際基準物質為參照，δ(千分差，‰)的計算如公式(1)所示：

δ13C/‰=(R樣品/R標準-1)×1 000

(1)

式中：R=13C/12C；R樣品為被測樣品的同位素比值，R標準為國際基準物質的同位素比值。

1.5 數據處理

使用SPSS軟件對數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 蒸酒過程對穩定同位素特征的影響

MOUSSA等[20]研究Cadiot旋轉帶蒸餾系統提取溶液中乙醇時發現，回收率不同時乙醇的氫同位素特征是不同的，而是隨回收率的提高而偏負；BAUDLER等[21]研究白蘭地時發現乙醇的碳同位素特征隨著蒸酒過程進行而逐漸偏負，這是由于蒸餾過程中發生了反蒸汽壓分餾作用，含13C的、質量數大的乙醇分子優先被氣化而存在于氣態乙醇中，該部分乙醇最先流出蒸餾器而顯示出相對偏正的碳同位素特征；張倩等[18]用不同的發酵液模擬蒸餾過程研究時也發現了上述變化。為研究白酒大生產過程中的乙醇碳同位素變化情況，選取一批酒醅和其蒸酒過程，每1 min取樣1次，測定各樣品的乙醇δ13C值，結果見圖1。其中第0次是酒醅中的乙醇δ13C值，并作為零點。

由圖1可知，白酒的蒸酒過程中，第15 min以前的流出液中乙醇δ13C均比酒醅偏正，之后才相對偏負，并且餾分乙醇δ13C呈現出逐漸偏負的趨勢，這說明白酒大生產條件下，蒸酒工藝也會使得乙醇碳同位素出現反蒸氣壓分餾效應。本研究中各餾分乙醇δ13C最大差異可達2‰，與BAUDLER等[21]的研究結果一致。因此，若按照鐘其頂等[15]提出的基于真實樣品建立白酒數據庫的建議，在摘酒過程中取樣是不可行的，其不能代表白酒的真實特征。

圖1 白酒蒸酒過程中乙醇δ13C的變化Fig.1 Ethanol δ13C variation during distillation

2.2 酒醅與基礎酒的乙醇δ13C對應關系研究

王道兵等[17]和張倩等[18]的研究表明發酵底物是乙醇δ13C分布特征的決定性因素。研究酒醅與基礎酒的乙醇δ13C對應關系，分別選擇6個窖池進行跟蹤研究，分別取上中下層酒醅，并從蒸酒后的混合樣中取基礎酒樣品，分別測定乙醇δ13C值，研究酒醅與基礎酒中乙醇δ13C對應關系，結果見表1。

表1 基礎酒與酒醅的乙醇δ13C之間的差異分析(Δ13C ‰)Table 1 Ethanol δ13C difference between alcohol fermentative material and crude spirits (Δ13C ‰)

由表1可知，上中下3層酒醅與基礎酒乙醇δ13C之間的差異的平均值分別為0.01‰、0.06‰和-0.05‰，這說明酒醅與基礎酒具有很好的一致性，雖然2.1中表明蒸酒過程會導致乙醇碳同位素分餾，但由于基礎酒是不同酒段樣品的混合樣，涵蓋了比酒醅偏正和偏負的大部分餾分，因此蒸酒過程不會改變酒醅的乙醇δ13C分布特征，可通過分析酒醅推測其基礎酒的乙醇碳同位素特征。

2.3 糧食發酵過程中乙醇δ13C變化

白酒生產時會用到多種糧食，包括高粱、玉米、小麥、大米等，其淀粉含量、淀粉形態及顆粒的堅硬程度均有所差異，選擇了1個窖池，在發酵過程中每隔7 d取酒醅，測定酒醅的乙醇δ13C值。以上層酒醅第1個樣品的乙醇δ13C值為零點，對比分析各酒醅的同位素特征，結果見圖2。

圖2 發酵過程中乙醇δ13C變化特征Fig.2 Ethanol δ13C variation during fermentation

圖2顯示出隨著發酵逐漸深入，乙醇δ13C值略有不同,并且呈現逐漸偏正的趨勢，這是由于白酒屬于復合菌群多糧發酵過程，糧食糊化入池發酵后與微生物的結合程度不同，可能存在某類糧食優先被微生物利用的情況，但總的來說都在一定范圍內(極差<1‰)，各樣品間的差異不大，因此取發酵過程酒醅可以作為質量監控的一環，用作發酵完成后酒醅乙醇δ13C值的參考。

2.4 基礎酒乙醇δ13C變化

作為各類型白酒產品基礎的基礎酒，其穩定性決定了產品的特征。研究不同生產時間的基礎酒的乙醇δ13C特征，固定1個生產班組，每隔3 d共取樣112個，測定各酒樣的乙醇δ13C。以第1個樣品的乙醇δ13C值為零點作圖，結果見圖3。

圖3 不同基礎酒的乙醇δ13C特征Fig.3 Ethanol δ13C characteristics of crude spirits between different batches

由圖3可知本次跟蹤研究的基礎酒，不同樣品之間乙醇δ13C最大差異≤1‰，表明由于生產工藝條件相似、糧曲配比相同，乙醇的碳同位素特征是比較穩定的；而在一定范圍內波動的原因可能是不同產地糧谷原料的同位素差異導致。

連續4年收集96個基礎酒樣品(n分別為7、43、9和36)，分別測定各樣品的乙醇δ13C值，分析結果見圖4(縱坐標單位刻度為1%)。

圖4 不同年份基礎酒的乙醇δ13C分布Fig.4 Ethanol δ13C distribution of crude spirits in different year

圖4顯示，不同年份的基礎酒并無顯著性差異，但也不完全相同(極差分別為0.61‰、1.97‰、0.46‰和1.16‰)，這是由于白酒企業大規模生產時，生產用糧中碳水化合物的穩定同位素特征隨產地、年份、品種而有差異的緣故。有研究表明，同一類含糖物料由于產地、年份不同時，δ13C值的最大差異可達5‰，因此，乙醇δ13C的實際應用中需考慮此差異問題[22]。

2.5 白酒產品乙醇δ13C變化

收集了某酒廠2018/2019年度的多批次多糧(配比一致)釀造的同一品牌的白酒產品樣品58個，檢測各白酒樣品乙醇δ13C值，以第1個白酒樣品為零點作圖，結果見圖5。

圖5 同一酒廠2018/2019年度白酒乙醇δ13C變化Fig.5 Ethanol δ13C variation of Baijiu from one manufacture in 2018/2019

圖5顯示，該酒廠2018/2019年度生產的多批次白酒乙醇δ13C 均值最大差異為0.96‰，<1‰，并且標準偏差為0.25‰，這說明同一酒廠釀酒糧食配比一致的情況下白酒乙醇δ13C無顯著影響。但是，也要注意到該類型產品呈現微小的逐漸偏正的趨勢，這可能是由于基礎酒的穩定同位素特征存在自然波動的緣故，而基礎酒的乙醇δ13C必然與其對應的糧食有關。考慮到此波動性，白酒乙醇δ13C在用于外源食用酒精檢測時不能簡單設置統一的判定閾值，而是應以數據庫為前提開展真實性保障和摻假檢測應用。

3 結論

通過長期跟蹤試驗發現，基礎酒和成品酒的乙醇δ13C值均不是恒定值，而發生變化的原因在于乙醇δ13C值受釀酒原料的δ13C特征的影響，因此盡管白酒乙醇δ13C應用于外源食用酒精檢測在理論上是可行的，但不能簡單設置統一的判定閾值，而是應以數據庫為前提或以原酒的δ13C真實值為基礎開展真實性保障和摻假檢測應用。并且，蒸酒過程中會導致乙醇δ13C發生反蒸氣壓分餾效應，因此蒸酒過程中的取樣可能導致測定結果失真，但同批次酒醅蒸酒后混合的基礎酒，可作為“真實樣品”用于數據庫的建設。