納米SiO2改性無籽刺梨黃酮微膠囊的制備及特性

畢會敏，楊宗玲，范方宇，張學浩

(西南林業大學，西南山地森林資源保育與利用教育部重點實驗室，生命科學學院，云南 昆明，650224)

無籽刺梨(Rosasterilis)屬薔薇科薔薇屬植物，廣泛分布于四川、湖南、貴州等亞熱帶及暖溫帶地區，別名繅絲花、刺梨薔薇。果實中含有豐富的營養物質，其中黃酮含量約為8 000 mg/kg，是銀杏的11～12倍，堪稱“黃酮之王”[1]，具有預防心血管疾病、抗氧化、抗癌、抗疲勞及延緩衰老等生理功能[2-3]。無籽刺梨的黃酮類化合物主要以黃酮糖苷形式存在[4]，溶解性低，穩定性差，易受pH、溫度、光照及添加劑影響氧化分解，限制了其應用范圍。PEREZ-MORAL等[5]、ELEGBEDE等[6]研究發現植物黃酮在胃腸道消化中易被降解，導致生物利用率及穩定性降低，限制了其生物活性的發揮。因此，如何保證黃酮提取物的穩定性對無籽刺梨黃酮的應用具有極其重要的價值。

微膠囊技術是利用高分子材料將固體、液體或氣體包封形成微小粒子的保護技術，可以在保留芯材原有特性前提下實現緩釋或持久保存[7]。但單一的高分子材料存在機械性能差、熱穩定性較低等缺點。采用新型材料改性微膠囊壁材，強化壁材性能，提高微膠囊穩定性成為本領域的研究熱點[8]。納米SiO2作為一種常用的高分子材料改良劑，具有較高的比表面積、表面活性、熱穩定性以及良好的生物相容性，其自身基團如硅氧鍵(—Si—O—Si—)、羥基(—OH)，以及含有空的成鍵軌道的硅原子等，可與大豆分離蛋白的氨基等基團結合形成氫鍵和配位鍵，使分子間結構更致密，空間縮小，賦予高分子材料特殊性能，提高復合材料的機械性，降低透水、透氣性等[9]。

基于此，本文利用納米SiO2對大豆分離蛋白(soy protein isolate, SPI)進行修飾改性，以改性后的SPI為微膠囊的壁材、無籽刺梨果渣黃酮為芯材制備黃酮微膠囊，通過分析納米SiO2添加量對黃酮微膠囊性能的影響，為納米SiO2改性微膠囊壁材制備黃酮微膠囊技術提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

無籽刺梨果渣黃酮(實驗室自制)。

SPI，廣東廣雅食品有限公司；納米SiO2(20～30 nm)，舟山明日公司；蘆丁標準品(色譜級，98%)，上海源葉生物科技公司；三羥甲基氨基甲烷，北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；纖維素酶(CAS 9012-54-8，酶活力35 U/mg，BR級別)，南京都南生物公司；DPPH，上海麥克林生化科技有限公司；胃蛋白酶(豬胃黏膜)、胰蛋白酶(牛胰)，南京都萊生物技術有限公司；單甘脂(食品級)，佳力士添加劑有限公司。

1.2 儀器與設備

BUCHIB-290噴霧干燥設備，瑞士Buchi公司；HSP-80B恒溫恒濕箱，上海坤天實驗室儀器；SB25-12DTDS超聲波清洗儀，寧波新藝超聲設備有限公司；FJ200-SH高速剪切分散機，上海滬析實業有限公司；Sigma3 K15離心機，德國Sigma離心機有限公司；DSC204差示熱量掃描儀，德國Netzsch儀器制造有限公司；TERRA XRD衍射儀，美國Innov-X公司；650傅立葉變換紅外光譜儀，天津港東科技有限公司；TM3000掃描電鏡，日本Hitachi高新技術公司；SHZ-82恒溫振蕩器，常州智博瑞儀器制造有限公司。

1.3 無籽刺梨黃酮的純化

無籽刺梨黃酮粗提物的制備參照楊宗玲等[10]的方法。參照張匯慧[11]純化無籽刺梨黃酮粗提物。以1 mL無水乙醇溶解0.5 g黃酮粗提物，加蒸餾水至其質量濃度為5 mg/mL。50 ℃攪拌60 min使黃酮充分溶解。樣液加入AB-8大孔樹脂，37 ℃振蕩24 h。抽濾，用蒸餾水洗去樹脂表面雜質。加入體積分數80%的乙醇(pH=6)，37 ℃振蕩6 h以解吸吸附于樹脂中的黃酮。抽濾，濾液采用旋轉蒸發儀濃縮至浸膏，真空冷凍干燥，研磨即得純化黃酮，純度為(82.2±1.5)%。

1.4 納米SiO2改性黃酮微膠囊的制備

1.4.1 改性納米SiO2的制備

取1.00 g納米SiO2(20～30 nm)加入到200 mL、質量分數0.7%的十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)溶液，用10%(體積分數)醋酸溶液調pH值至4.0，80 ℃下攪拌6 h，5 500 r/min離心10 min，然后用70～80 ℃蒸餾水反復離心洗滌納米SiO2至中性。60 ℃干燥12 h，研磨，將研磨所得粉末保存于裝有干燥劑的干燥器中備用。本文中分析的SiO2性質均為改性后的SiO2。

1.4.2 納米SiO2/SPI為壁材的黃酮微膠囊的制備

以芯壁比1∶7，固形物含量5%，單甘脂添加量0.1%，納米SiO2添加量為SPI的0%、5%、7%(質量分數)制備納米SiO2改性黃酮微膠囊。具體方法如下：

(1)芯材溶液制備：稱取一定量純化后的黃酮粉末，加入體積分數為55%的乙醇50 mL、單甘脂于60 ℃攪拌(500 r/min)10 min，使黃酮和單甘脂充分溶解，用1 mol/L的NaOH調節芯材溶液pH為7.0，降溫至35 ℃得到芯材溶液。

(2)納米SiO2改性黃酮微膠囊的制備：不同添加量的納米SiO2分散到187.5 mL去離子水中，570 W超聲破碎2 h，得納米SiO2分散液。加入SPI到分散液，80 ℃、500 r/min攪拌30 min，使SPI充分溶解得壁材溶液。將制備好的芯材溶液，在500 r/min條件下緩慢加入到制備好的壁材溶液中，35 ℃攪拌30 min。攪拌結束后，以14 000 r/min高速分散4 min，所得溶液進行噴霧干燥。噴霧干燥條件為進風溫度140 ℃，出風溫度為60～70 ℃，進料流量為9 mL/min。噴霧干燥所得樣品即為納米SiO2改性黃酮微膠囊樣品。為方便后期描述，將制備好的微膠囊樣品根據納米SiO2的添加量命名為MIC-0(0%)、MIC-5(5%)和MIC-7(7%)。

1.5 微膠囊物理性質測定

1.5.1 包埋率測定

黃酮微膠囊包埋率的測定參考曹侃[12]的方法稍作修改。表面黃酮含量(m1)測定：取0.1 g黃酮微膠囊，用15 mL無水乙醇反復洗滌抽濾，合并濾液。采用劉暢等[13]黃酮含量的測定方法測濾液黃酮含量。

總黃酮含量(m2)測定：取0.1 g黃酮微膠囊，加4 mL蒸餾水溶解后，加入6 mL無水乙醇，超聲20 min得待測液。取2.5 mL待測樣液，以60%乙醇定容至25 mL。取1 mL于10 mL容量瓶，根據劉暢等[13]的方法向容量瓶中依次加入質量分數為5%的NaNO2溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min；加入質量分數為10%的Al(NO3)3溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min；再加入1 mol/L 的NaOH溶液4 mL后用60%(體積分數)乙醇定容至10 mL，搖勻后靜置15 min，波長510 nm下測量溶液吸光值。計算待測液中總黃酮含量，按照公式(1)計算微膠囊包埋率：

(1)

1.5.2 水分含量測定

采用直接干燥法，參考GB 5009.3—2016《食品安全國家標準 食品中水分的測定》。

1.5.3 堆積密度測定

參考黃珊等[14]的方法測定樣品的堆積密度。分別稱取2 g的MIC-0、MIC-5和MIC-7黃酮微膠囊樣品倒入帶有刻度的量筒中，反復振動使微膠囊粉末自然下沉，直至樣品不能被壓縮，計算單位體積微膠囊的質量，重復3次。按照公式(2)計算單位體積微膠囊質量：

(2)

1.6 微膠囊抗氧化活性及還原性測定

1.6.1 微膠囊DPPH自由基清除率測定

取MIC-0、MIC-5和MIC-7樣品各0.06 g，加入24 mL蒸餾水，60 ℃、500 r/min條件下攪拌20 min，使微膠囊壁材充分溶解。加入36 mL無水乙醇，繼續攪拌10 min，60%乙醇定容至60 mL，得1 mg/mL黃酮微膠囊溶液。用60%的乙醇分別稀釋得到質量濃度為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40 mg/mL的黃酮微膠囊溶液作為待測樣液。根據黃酮微膠囊中黃酮的含量配制具有相同質量濃度的黃酮溶液作為對照組(HT)，對照組質量濃度為0.01、0.02、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09 mg/mL。參照譚欽鐸[15]DPPH自由基清除率測定方法測定黃酮微膠囊DPPH自由基清除率。

1.6.2 微膠囊羥自由基(·OH)清除率測定

根據1.6.1方法，配制質量濃度為2.0、3.5、5.0、6.5、8、9.5、11、12.5 mg/mL的黃酮微膠囊溶液作為待測樣液，對照組黃酮質量濃度為0.5、0.8、1.2、1.5、1.9、2.2、2.6、2.9 mg/mL。參考張倩茹[16]·OH清除率的測定方法測定黃酮微膠囊的·OH清除率。

1.6.3 微膠囊還原能力測定

根據1.6.1方法配制質量濃度為0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 mg/mL的黃酮微膠囊溶液，對照組黃酮質量濃度為0.1、0.2、0.5、0.7、0.9、1.2、1.4、1.6、1.9 mg/mL。參照孟娜等[17]的方法測定黃酮微膠囊的還原力。

1.7 微膠囊模擬體外釋放性能

(1)模擬胃液配制：取800 mL去離子水于1 000 mL燒杯中，緩慢加入9 mL濃鹽酸，混勻，加入10 g胃蛋白酶。充分溶解混勻，移入1 000 mL容量瓶并用去離子水定容，所得模擬胃液于4 ℃保存備用。

(2)模擬腸液配制：取6.8 g磷酸二氫鉀于500 mL去離子水中，充分溶解，采用質量分數為0.4%的NaOH調節溶液pH為6.8。另取10 g胰蛋白酶溶解于水中，將兩溶液合并移入1 000 mL的容量瓶，于4 ℃保存備用。

(3)微膠囊緩釋性能的測定：取0.5 g微膠囊樣品于錐形瓶中，分別加入20 mL模擬胃液/腸液，37 ℃搖床110 r/min振蕩。期間每15 min取1 mL樣液在10 000 r/min離心15 min。取上清液測黃酮的濃度。黃酮的測定參照劉暢等[13]的方法測定，按照公式(3)計算黃酮釋放率：

(3)

1.8 微膠囊性能表征

1.8.1 熱穩定性分析

采用差示掃描量熱儀(differential scanning calorimeter, DSC)分析黃酮微膠囊熱穩定性。取3～5 mg樣品于鋁制坩堝中，空鋁坩堝為空白對照，掃描溫度為30～250 ℃，升溫速度為10 ℃/min，氮氣流速為20 mL/min。

1.8.2 X射線衍射分析

分別取0.5 g的黃酮微膠囊樣品于X射線衍射儀(X-ray diffractogram, XRD)樣品盒中，采用步進掃描法測得。掃描速率10°/min，掃描范圍為5°～80°。

1.8.3 紅外光譜分析

取少量黃酮微膠囊粉末和溴化鉀研磨，壓片。用紅外光譜儀(Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR)掃描樣品在400～4 000 cm-1的變化。

1.8.4 掃描電鏡分析

取少量微膠囊粉末產品，用雙面膠固定在樣品臺上，利用掃描電子顯微鏡在15 kV加速電壓下觀察MIC-0、MIC-5和MIC-7表面形貌，放大倍數4 000。

1.9 數據處理

圖表中數據為3次實驗數據的平均值，采用軟件Origin 8.0和GraphPad Prism 5對實驗數據進行繪圖，軟件IBM SPSS Statistics 20對實驗數據進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 微膠囊物理性質分析

黃酮微膠囊的包埋率、水分含量和堆積密度如表1所示。樣品MIC-0、MIC-5、MIC-7的包埋率均大于90%，分別為90.96%、95.44%、92.55%，MIC-5和MIC-7的包埋率略高。水分含量是影響粉末產品貨架期的重要因素，粉末產品水分含量不能超過10%[18]。本研究中，MIC-0、MIC-5和MIC-7的水分含量分別為6.28%、4.55%、6.58%，當納米SiO2添加量為5%時，水分含量最小，有利于樣品的長期貯存。根據TONON等[19]的研究，粉末密度主要與分子質量有關，分子質量越高，材料越重越有利于樣品容納到顆粒之間的空隙中，從而占用較少的空間，具有較高的堆積密度。在微膠囊中，堆積密度是微膠囊材料發生氧化的重要因素，較高的堆積密度可使其貯存于更小的容器中，減少粉末空隙中的空氣量，防止微膠囊氧化[20]。本研究中，MIC-0、MIC-5、MIC-7的堆積密度分別為0.29、0.22、0.28 g/cm3，相比于BOONCHU等[21]的研究，本研究制備的微膠囊堆積密度略低，這可能與微膠囊粒徑分布、表面粗糙度以及微膠囊形貌的差異有關。

表1 納米SiO2添加量對黃酮微膠囊性質的影響Table 1 Effect of nano-SiO2addition on the properties of flavonoid microcapsules

2.2 微膠囊抗氧化活性及還原性分析

2.2.1 微膠囊清除DPPH自由基能力分析

納米SiO2改性黃酮微膠囊對DPPH自由基清除率如圖1所示。隨著濃度的升高，對照組和樣品組(MIC-0、MIC-5和MIC-7)對DPPH自由基清除率逐漸升高，當質量濃度為0.40 mg/mL時，MIC-0、MIC-5、MIC-7和對照組對DPPH自由基的清除率分別為77.05%、76.36%、75.74%、91.5%。結果表明以納米SiO2改性為微膠囊壁材制備黃酮微膠囊，不會影響黃酮對DPPH自由基的清除率。相比對照組，樣品組DPPH自由基清除率略低，可能是微膠囊中黃酮因包埋作用，測定其DPPH自由基清除率時，黃酮未完全從微膠囊中釋放。譚欽鐸等[15]采用噴霧干燥法制備葛根異黃酮微膠囊，也發現了類似現象，微膠囊化后的葛根異黃酮微膠囊對DPPH自由基清除率與對照組相比下降了41.1%。本研究中，MIC-0、MIC-5和MIC-7對DPPH自由基清除率分別下降了14.15%、15.14%、15.76%。譚欽鐸[15]采用研磨法，先用水對微膠囊進行破壁處理，再用醇溶解暴露出的黃酮，測得樣品活性有所提高。本研究中，測定微膠囊樣品活性的方法還需進一步探索。

圖1 納米SiO2改性黃酮微膠囊對DPPH自由基清除作用Fig.1 Scavenging effect of nano-SiO2 modified flavonoid microcapsules on DPPH radicals

2.2.2 微膠囊清除·OH能力分析

MIC-0、MIC-5、MIC-7和對照組對·OH清除作用如圖2所示。隨著微膠囊質量濃度的升高，MIC-0、MIC-5和MIC-7對·OH清除率均呈現逐漸上升的趨勢。在濃度2.0～12.5 mg/mL范圍內，MIC-0、MIC-5、MIC-7和對照組對·OH清除率分別從39.35%、33.63%、35.90%、32.00%上升到84.04%、83.51%、84.51%、85.94%，樣品組與對照組對·OH清除率差異不大，結果表明制備的微膠囊具有較高的清除·OH的活性，同時也表明采用噴霧干燥法制備納米SiO2改性黃酮微膠囊對黃酮清除·OH的活性影響小。

圖2 納米SiO2改性黃酮微膠囊對·OH清除作用Fig.2 Scavenging effect of nano-SiO2 modified flavonoid microcapsules on ·OH

2.2.3 微膠囊還原能力分析

MIC-0、MIC-5、MIC-7和對照組在不同質量濃度下的還原力如圖3所示。質量濃度1 mg/mL增加至7 mg/mL時，MIC-0、MIC-5、MIC-7和對照組的還原力逐漸增強，從0.519、0.514、0.565、0.554上升至5.045、4.863、4.795、4.712。當質量濃度為7 mg/mL時，繼續增大微膠囊質量濃度，樣品還原力無變化，組間差異小。結果表明加入納米SiO2改性黃酮微膠囊壁材，并采用噴霧干燥法制備黃酮微膠囊對微膠囊的還原力無顯著影響(P<0.05)。

圖3 納米SiO2改性黃酮微膠囊的還原力Fig.3 Reducing power of nano-SiO2 modified flavonoid microcapsules

2.3 微膠囊在模擬胃液和腸液中的緩釋性能分析

微膠囊化可使物質具有緩慢釋放的效果，同時由于壁材的保護作用，芯材在被人體吸收前不易被破壞。納米SiO2改性黃酮微膠囊在模擬胃液和腸液中的緩釋性能如圖4所示。MIC-0、MIC-5和MIC-7在整個模擬胃液釋放過程中累計釋放量差異不大，說明加入納米SiO2不影響黃酮微膠囊在模擬胃液中的釋放。釋放時間為150 min時，MIC-0、MIC-5和MIC-7的累計釋放率分別為20.16%、20.16%、21.22%。黃酮微膠囊在模擬腸液中的累計釋放率如圖4-b所示，在整個釋放過程中MIC-5和MIC-7的釋放率低于MIC-0，這可能與納米SiO2在堿性環境中結構變化有關。釋放時間為150 min時，MIC-0、MIC-5和MIC-7的累計釋放率分別為61.76%、60.25%、61.25%，微膠囊在模擬腸液中的釋放遠高于在模擬胃液中的釋放，該結果說明微膠囊化能有效促進黃酮在腸道內的生物轉化與吸收，提高其利用率，具有較好的緩釋性能。

a-模擬胃液；b-模擬腸液圖4 納米SiO2改性黃酮微膠囊在模擬胃液和 腸液中的緩釋性能Fig.4 Sustained release properties of nano-SiO2 modified flavonoid microcapsules in simulated gastric and intestinal juice

2.4 微膠囊性能表征

2.4.1 微膠囊熱穩定性分析

由圖5可知，SPI、納米SiO2、HT、MIC-0、MIC-5和MIC-7對應的熔融溫度分別為106.7、127.2、97.1、101.2、120.7、114.2 ℃。微膠囊化后的MIC-0、MIC-5和MIC-7的熔融溫度分別比HT高出4、23.6、17.1 ℃。MIC-5和MIC-7的熔融溫度分別比MIC-0高出19.5、3.0 ℃。結果表明，添加納米SiO2顯著提高了黃酮微膠囊的熱穩定性，在納米SiO2添加量超過5%后，熔融溫度降低,這主要是由于納米SiO2與SPI產生氫鍵，破壞氫鍵需要更多的外部能量，當增加納米SiO2添加量時，納米SiO2易團聚，不易均勻分散在壁材中，壁材結構減弱，熔融溫度降低。張云峰等[22]以石蠟為芯材、三聚氰胺樹脂為壁材，納米SiO2為改性劑制備相變微膠囊，結果表明納米SiO2用量為5%的改性相變微膠囊有最大的相變潛熱，改性后復合涂料的儲熱性能增強。

圖5 納米SiO2添加量對黃酮微膠囊熱穩定的影響Fig.5 Effect of nano-SiO2 addition on thermal stability of flavonoid microcapsules

2.4.2 微膠囊衍射圖譜分析

納米SiO2、HT、SPI、MIC-0、MIC-5、MIC-7的XRD譜圖如圖6所示。SPI在2θ=8.8°和2θ=19.4°出現結晶峰，為SPI二級構象的α螺旋和β-折疊結構，其中2θ=19.4°的峰形較寬，為SPI中7S與11S無定形球蛋白2種主要成分的特征衍射峰。納米SiO2和HT分別在2θ=23.1°和2θ=21.0°出現特征衍射峰，說明納米SiO2和HT為非晶態結構。根據XRD的結果，MIC-5和MIC-7的XRD譜圖與MIC-0的XRD譜圖相似，說明納米SiO2的加入不影響黃酮微膠囊的結晶度。略有不同的是相比SPI的XRD衍射圖譜，樣品MIC-5、MIC-7在2θ約為8.8°處的衍射峰強度微弱，LIU等[23]將其解釋為納米SiO2與高分子化合物表面的羥基結合使羥基與氫鍵結合的數量減少，導致結晶度降低。

圖6 納米SiO2添加量對黃酮微膠囊XRD譜圖的影響Fig.6 Effect of nano-SiO2 addition on XRD spectra of flavonoid microcapsules

2.4.3 微膠囊紅外光譜分析

圖7 納米SiO2添加量對黃酮微膠囊紅外光譜圖的影響Fig.7 Effect of nano-SiO2 addition on infrared spectra of flavonoid microcapsules

2.4.4 微膠囊微觀結構分析

利用掃描電鏡對樣品進行了表征，圖8為MIC-0、MIC-5、MIC-7放大4 000倍的形貌圖。與采用噴霧干燥法制備其它微膠囊一樣，MIC-0、MIC-5和MIC-7具有球形結構，但部分微膠囊表面存在凹陷結構。主要原因噴霧干燥過程中，水分蒸發，微膠囊表面快速失水所致。然而，MIC-5、MIC-7樣品相比于MIC-0樣品表面更光滑，微膠囊形貌接近球形顆粒。納米SiO2改性微膠囊壁材提高了微膠囊壁材的機械強度和熱穩定性，在采用噴霧干燥法制備微膠囊的過程中，具有較高機械強度和熱穩定的微膠囊壁材可有效阻止由于微膠囊表面快速失水而引起的凹陷結構，因此，微膠囊發生形變量較小，顆粒較光滑。3種樣品的微膠囊表面未觀察到明顯裂痕和孔隙結構。

a-MIC-0；b-MIC-5；c-MIC-7圖8 納米SiO2添加量對黃酮微膠囊形態的影響Fig.8 Effect of nano-SiO2 addition on morphology of flavonoid microcapsules

3 結論

本文以納米SiO2改性大豆分離蛋白(SPI)為壁材，無籽刺梨果渣黃酮為芯材，采用噴霧干燥法制備黃酮微膠囊，對不同納米SiO2添加量(0%、5%、7%,質量分數)制備的黃酮微膠囊性能進行分析。添加納米SiO2的微膠囊物理性質得到改善，結構形態更加穩定。當納米SiO2添加量為5%時黃酮微膠囊的性能較好，此時包埋率最高為(95.44±1.16)%，水分含量最低為(4.55±0.33)%，熱穩定性最好，熔融溫度為120.7 ℃，有利于微膠囊的長期貯藏。體外抗氧化活性及還原性試驗表明，納米SiO2的加入和微膠囊化對黃酮的抗氧化活性及還原性沒有顯著影響，所制備的黃酮微膠囊依然具有較高的抗氧化活性。體外模擬胃腸道消化緩釋試驗表明，納米SiO2的加入對黃酮微膠囊在模擬胃液中的釋放沒有顯著影響，但微膠囊在模擬腸液中的釋放遠高于在模擬胃液中的釋放。XRD、FTIR、SEM分析表明黃酮微膠囊制備成功，所得微膠囊顆粒完整，大小均勻，納米SiO2的加入可增強壁材對芯材的包埋效果，提高壁材的機械強度和熱穩定性。