GAPDH@Fe3O4固定化酶脫除櫻桃酒生物胺的研究及對酒體指標的影響

邢鑫，王魯良，張冰艷，袁新杰，褚琪，孫舒揚

(魯東大學 食品工程學院，山東 煙臺，264025)

生物胺(biogenic amines, BA)是一類低分子含氮化合物，普遍存在于富含蛋白質的食品和含酒精的發酵飲料中，一般經由氨基酸脫羧酶對相應的氨基酸進行脫羧化反應生成。食品中常見的BA包括色胺、腐胺、酪胺、組胺、精胺、尸胺等[1]。適量的BA有助于人體正常的生理功能，過量則會引起頭痛、惡心、嘔吐、腹瀉、心悸、血壓變化、呼吸紊亂等過敏反應，嚴重時會危及生命[2]。

櫻桃味道鮮美、營養豐富且具有藥用價值，但是隨著引種栽培規模的不斷擴大，鮮櫻桃已出現供過于求的局面[3]。由于櫻桃采摘期短，不易保存，容易受到微生物侵染以致腐敗變質，由此造成的經濟損失每年達上億元[4]。將櫻桃釀制成櫻桃酒是解決上述難題的有效途徑，符合國家倡導的“壓縮糧食酒，發展水果酒”政策，也符合消費者追求天然、營養果酒的趨勢[5]。

近年來櫻桃酒在果酒市場的占比日漸增加，但有關其BA問題的相關研究卻未引起重視，存在一定的安全隱患。據報道，櫻桃酒發酵過程中會產生多種BA，以腐胺為主，此外還有一定量的組胺、亞精胺和色胺[6]。櫻桃酒中的 BA 可能來源于釀造原料，也可能經由多個釀造階段產生[7]，例如果皮浸漬、酒精發酵、蘋果酸乳酸發酵、陳釀等，其中蘋果酸乳酸發酵和陳釀是導致BA合成或積累的主要階段。如果發酵過程中衛生條件控制不力，導致混入帶有氨基酸脫羧酶的污染菌，或者個別生產過程處理不得當，如酵母酒泥與櫻桃酒長期共儲、未及時分離等，則有可能導致酒體 BA 含量快速增加[8]。在食品體系中加入能夠降解 BA 的酶類是近幾年來新興起的方法，這是降解果酒中已有BA的一種新的思路，具有高效性、經濟性和專一性，已經引起了眾多研究者的關注[9]。本課題組在前期研究中從自篩的一株植物乳桿菌中通過分離純化獲得了一種全新的BA降解酶——三磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)[10]，并在大腸桿菌中克隆和表達其基因活性，從而證實了該酶降解 BA 的新功能[11]。重組 GAPDH 在 pH 5.5 和 40 ℃ 條件下降解組胺的活性最強，并且對櫻桃酒的限制因素(SO2、乙醇)有很強的抵抗力。但是，游離 GAPDH 與大多數酶分子一樣，穩定性不高，而且在實際生產過程中無法實現重復利用，導致生產成本過高，所以在工業化應用中受到了極大的限制。

固定化酶可提高酶的穩定性，降低生產成本，是解決上述問題的有效手段。近年來，具有納米尺寸的磁性Fe3O4納米粒子(magnetic nanoparticles, MNPs)成為固定化酶領域研究的新熱點，這是因為其具有優異的機械穩定性和較大的比表面積，易于功能化修飾，能夠在外部磁場下快速地分離，生物相容性良好，因而極大地簡化了固定化酶的回收和再利用[12-13]。本課題組在獲得重組GAPDH的基礎上，對其在磁性Fe3O4納米粒子的固定化也進行了系統研究，發現對Fe3O4-MNPs進行表面改性后可以將GAPDH固定在Fe3O4-APTES納米粒子上，從而成功制備了GAPDH@Fe3O4固定化酶。固定化酶的酸堿穩定性和熱穩定性分別提高到4.5～8.5和50～60 ℃[14]，但是有關其在櫻桃酒環境中的實際作用效果還需要進一步研究。本文測試該固定化酶在櫻桃酒陳釀階段的應用，其在脫除BA的同時是否對酒體的各項指標，包括基本理化指標、揮發性組分、非揮發性酚類物質產生影響，以及固定化酶重復使用的批次問題。之所以選擇在櫻桃酒的陳釀階段進行GAPDH@Fe3O4降解BA效果的測試，主要原因在于可以將之前產生BA的所有生產過程，包括皮渣浸漬、酒精發酵、蘋果酸乳酸發酵等生成的BA[7]在該階段進行統一處理，能夠有效節約GAPDH@Fe3O4的使用成本。本文開啟了有關固定化酶實際應用的相關研究，可以彌補以往針對固定化酶只關注酶的制備和催化活性方面研究的不足，將研究范圍擴大到實際的食品體系，從新的視角解析了固定化酶的應用效果，對同類研究也具有良好的借鑒作用。此外，本文的研究結果有望為GAPDH@Fe3O4在果酒中的規模化應用奠定先期數據基礎，也是將其開發成為商業化酶制劑進程中的必須過程。

1 材料與方法

1.1 試劑

腐胺、尸胺、精胺、酪胺、亞精胺、組胺、苯乙胺、色胺、丹磺酰氯(純度均≥99%)，Sigma公司；沒食子酸、原兒茶酸、2,3,4-三羥基苯甲酸、新綠原酸、對羥基苯甲酸、綠原酸(均為色譜級)，上海麥克林生化科技有限公司；甲醇、乙腈(均為色譜純)，美國TEDIA天地試劑公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 GAPDH@Fe3O4的制備

GAPDH制備參考SUN等[11]的方法制備并保存在實驗室中。Fe3O4-MNPs根據共沉淀法合成。將FeCl2·4H2O(1.0 g)和FeCl3·6H2O(2.7 g)溶解于50 mL水中，然后向溶液中逐滴添加25%(體積分數)氨水，直到pH值達到12。接著將溶液在70 ℃攪拌3 h，用磁鐵收集黑色產物，洗滌并真空干燥過夜。在超聲波作用下，采用Stober法合成了氨基官能化Fe3O4納米粒子。將0.5 g Fe3O4納米顆粒分散在150 mL乙醇中。然后連續添加25%氨水(2.5 mL)、超純水(40 mL)和正硅酸乙酯(0.5 mL)機械攪拌12 h。將收集的納米顆粒洗滌并分散在200 mL異丙醇中，繼續添加1.5 mL 3-氨丙基三甲氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxysilane,APTES)(50 mL異丙醇中)。在40 ℃機械攪拌12 h，用永磁鐵收集。接著將制得的氨基包覆的Fe3O4-MNPs溶解在磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L，pH 7.0)中，使質量濃度達到10 mg/mL，然后在40 kHz下超聲處理15 min，然后加入1.0%(體積分數)戊二醛溶液，在40 ℃下攪拌30 min。通過永磁體收集得到的Fe3O4-APTES-戊二醛，并用磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L，pH 7.0)洗滌3次。將Fe3O4-APTES-戊二醛按照40 mg/mL先加入到無外源BA的櫻桃酒樣中靜置5 h，反應結束后，使用永磁鐵將其回收，再用磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L，pH 7.0)洗滌3次。之后將Fe3O4-APTES-戊二醛絡合物(8 mg/mL)添加到GAPDH溶液(3 mg/mL)中固定1.5 h，結束后使用永磁鐵分離GAPDH@Fe3O4納米顆粒，并用磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L，pH 7.0)洗滌3次。

1.2.2 櫻桃酒的制備

擠壓新鮮櫻桃成櫻桃漿，加入SO2和果膠酶，并使二者的質量濃度分別達到50、30 mg/L。25 ℃下反應6 h后，加入蔗糖，使還原糖質量濃度達到200 g/L。將經過預處理的櫻桃漿輸入發酵罐中，接種商業化釀酒酵母Lalvin D254，接種量為250 mg/L，25 ℃恒溫發酵，間隔6～8 h循環攪拌，直至總糖質量濃度<4 g/L。發酵結束后，8 000 r/min離心取出櫻桃清酒，再次加入SO2至其質量濃度為30 mg/L。將櫻桃清酒再次置于發酵罐中，調整溫度至20 ℃，進行自然蘋果酸乳酸發酵。利用蘋果酸檢測試劑盒測定酒中的蘋果酸濃度，待蘋果酸質量濃度<0.5 g/L，12 000 r/min離心取出櫻桃酒，輸入陳釀罐中，并加入SO2至其質量濃度為50 mg/L。陳釀2個月后，從罐中取出櫻桃酒，用于GAPDH@Fe3O4降解BA的試驗。

1.2.3 固定化酶在櫻桃酒中的應用

1.2.3.1 GAPDH@Fe3O4去除櫻桃酒中BA的研究

本文測試GAPDH@Fe3O4對8種常見BA的降解效果。由于自制櫻桃酒中的BA含量較低，故外源添加了6種胺類(色胺、苯乙胺、尸胺、精胺、組胺、亞精胺)，加入量均為5 mg/L，而酪胺(4.102 mg/L)和腐胺(8.528 mg/L)含量較高，因此不需再補充。將此污染的櫻桃酒樣品等分為20 份，作為GAPDH@Fe3O4降解BA試驗的試材。每份污染的櫻桃酒樣品為5 mL，向其中加入200 mg GAPDH@Fe3O4，然后置于18 ℃下密閉反應5 h，期間每間隔1 h輕微振蕩櫻桃酒，使固定化酶與酒樣充分混合。平行反應進行2次。反應結束后用永磁鐵回收固定化酶，并用PBS緩沖液(20 mmol/L，pH 7.4)將回收的GAPDH@Fe3O4清洗3次用于后續的櫻桃酒降胺反應。

1.2.3.2 GAPDH@Fe3O4重復使用性試驗

對GAPDH@Fe3O4重復使用性進行測試。在每一輪次試驗中，將200 mg GAPDH@Fe3O4置于5 mL污染的櫻桃酒樣中密閉反應5 h，而后立即回收、洗滌固定化酶，并再次投入其他盛有5 mL污染櫻桃酒的燒杯中，開啟下一批次的BA降解試驗。同樣的反應過程共計進行10輪次，每輪次設有2個平行樣品。

每輪次BA降解反應完成后，立即將處理后的櫻桃酒樣置于4 ℃冰箱中，用于后續的基本理化指標、揮發性組分和非揮發性酚類物質的測定。

1.2.4 櫻桃酒分析方法

1.2.4.1 櫻桃酒基本理化指標分析

櫻桃酒中的還原糖、總酸、揮發酸的含量依據GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》進行測定，具體方法：采用斐林試劑法測定還原糖；采用氫氧化鈉滴定法測定總酸和揮發酸；酒精度依據GB 5009.225—2016《食品安全國家標準 酒中乙醇濃度的測定》中的密度瓶法進行測定；使用酸度計測定酒體的pH值。

1.2.4.2 櫻桃酒揮發性組分測定

參考LIU[15]的方法，采用FlavourSpec?氣相離子遷移譜儀(具備自動頂空進樣器、分析軟件和定性軟件)測定櫻桃酒樣中的揮發性香氣物質。

頂空進樣條件：取1 mL的櫻桃酒樣置于20 mL的頂空小瓶中，60 ℃孵育10 min，進樣量為100 μL，進樣針溫度設為65 ℃。

GC條件：載氣為氮氣(純度≥99.999%)，初始流速設定2 mL/min，維持2 min后上升，10 min上升至10 mL/min，20 min上升至100 mL/min，持續10 min。

離子遷移譜(ion mobility spectrometry,IMS)條件：漂移氣為氮氣(純度≥99.999%)，流速150 mL/min，漂移管長度98 mm，溫度45 ℃，放射源為3H，正離子化模式。使用FlavourSpec?氣相離子遷移譜儀自帶的LAV軟件及NIST和IMS數據庫對揮發性香氣化合物定性分析。

1.2.4.3 櫻桃酒中非揮發性酚類物質的測定

將櫻桃酒通過0.22 μm尼龍過濾膜過濾后，直接進樣。采用HPLC對非揮發性酚類物質進行分離、鑒定。具體色譜操作條件如下：色譜柱：Besil C18-H(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫：25 ℃；流動相：A相為水相[0.1%(體積分數)的三氟乙酸]，B相由純甲醇與純乙腈按體積比1∶1混合而成；流速1 mL/min；進樣體積10 μL；檢測波長：UV 280 nm；溫度30 ℃；梯度：20～40 min 12%～18% B，40～45 min 18%～22% B，45～60 min 22%～35% B，60～65 min 35%～45% B，65～75 min 45%～80% B，75～80 min 80%～5% B，80～92 min 5% B。

通過比較標準品和樣品的出峰時間及光譜圖對非揮發性酚類物質進行鑒定，計算出峰面積，根據保留時間，以各樣品的進樣濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標進行標準曲線繪制，對各類組分進行定量。

1.2.4.4 櫻桃酒中BA的測定

參考LIU等[16]的方法，將櫻桃酒使用丹磺酰氯衍生后，通過0.22 μm尼龍過濾膜過濾上清液，然后進行HPLC分析，櫻桃酒中的BA濃度通過高效液相色譜-氫火焰離子化檢測器(high performance liquid chromatography-flame ionization detector, HPLC-FID)測定。在FLD探測器中，激發波長和發射波長分別設置為320、523 nm。乙腈和超純水分別為溶劑A和溶劑B。梯度曲線為0～5 min，65%～70% A；5～20 min，70%～100% A；24～25 min，100%～65% A；25～40 min，65% A。

BA的鑒定是通過比較其保留時間與相應的標準。櫻桃酒樣品中BA的定量是通過峰面積比(每種BA/內標物)與每種BA濃度的標準曲線進行的。

1.2.4.5 櫻桃酒感官質量分析

櫻桃酒感官評價小組由11位具有果酒品評經驗的老師和同學(7名女性，4名男性，年齡22～49歲)組成。在正式品評之前，小組成員先接受櫻桃酒描述性感官分析的培訓，通過進行多次檢驗與討論，品評小組確定了櫻桃酒中主要的香氣屬性特征，包括整體香氣、水果香、花香、甜香和辛辣氣味。品評實驗在感官評價室進行，室溫20 ℃，通風良好。品評者采取10點制打分，0表示無，9表示特征性最強[17]。香氣分值在0～3為低強度，3～6為中等強度，6～9為高強度。

1.3 統計分析

為了保證實驗的準確性，每個指標至少進行3次平行測定。采用SPSS Statistics 25.0軟件對獲取的各指標數據做方差分析(ANOVA)和顯著性差異(P<0.05)分析。

2 結果與分析

本文的研究目的在于測試GAPDH@Fe3O4固定化酶在櫻桃酒陳釀中的實際應用效果，特別關注對BA的降解作用、對酒體各項指標的影響以及固定化酶重復利用批次。本研究共測試了GAPDH@Fe3O4重復利用1～10次后對櫻桃酒體的影響，但為了表述和比較方便，取固定化酶第1次使用(IT-1)、第5次使用(IT-5)和第10次使用(IT-10)的結果列于本文中，并與未進行GAPDH@Fe3O4處理的樣品(ES)為對照。詳細結果見下文。

2.1 GAPDH@Fe3O4對降解櫻桃酒BA的影響

GAPDH@Fe3O4重復使用1次、5次和10次后，利用HPLC法測定櫻桃酒的BA含量，結果如表1所示。4種酒樣均檢測出8種BA，分別為色胺、苯乙胺、尸胺、精胺、組胺、酪胺、亞精胺和腐胺。在添加完外源BA后，檢測到ES中腐胺的含量最高(8.528 mg/L)，其次是色胺(5.974 mg/L)、組胺(5.897 mg/L)、精胺(5.729 mg/L)、亞精胺(5.646 mg/L)、苯乙胺(5.442 mg/L)、尸胺(4.822 mg/L)和酪胺(4.102 mg/L)。在使用GAPDH@Fe3O4處理后，櫻桃酒的BA濃度明顯降低。與ES相比，在IT-1中，BA降解率達到了28.54%，其中色胺、苯乙胺、尸胺、精胺、組胺、酪胺、亞精胺、腐胺的降解率分別達到了28.9%、55.2%、35.0%、27.0%、28.0%、18.8%、21.4%、18.6%；在IT-5中，上述各BA的降解率分別為22.3%、33.1%、18.0%、17.7%、21.0%、17.4%、19.4%、10.5%，總BA降解率為19.4%，與IT-1相比降解率下降了9.5%；在IT-10中，上述各BA的降解率分別為8.6%、17.1%、14.3%、11.1%、15.9%、8.5%、13.2%、6.4%，總BA降解率仍有11.6%。由上述數據看出，隨著循環次數的增多，GAPDH@Fe3O4降解BA的活性出現了下降，這可能與溶液環境干擾了GAPDH的構象、酶穩定性被破壞[18]、酶分子與納米顆粒逐漸脫離有關，但仍然維持了基本的活性，說明經過反復利用的GAPDH@Fe3O4結構仍比較穩定。

表1 GAPDH@Fe3O4重復利用批次下櫻桃酒BA含量Table 1 Biogenic amines content in cherry wines treated with reuse batch of GAPDH@Fe3O4

近年來，利用磁性納米粒子為載體制備固定化酶成為了固定化酶研究領域研究的熱點，國內外相關報道逐漸增多。LIU等[19]用共沉淀法合成了由APTES修飾的Fe3O4納米粒子，并成功地將α-葡萄糖苷酶直接共價固定在了該納米粒子上。與游離酶相比，固定化α-葡萄糖苷酶的耐酸堿度和熱穩定性均略有提高，也表現出了良好的重復利用性，經7次循環利用后，剩余活性仍達到66%。GUPTA等[20]將脂肪酶固定在磁性納米顆粒上，進行酯化反應，在溫和的條件下其最大轉化率達到82.7%，重復5次后轉化率仍然可以達到80.2%。上述研究結果與本文的研究結果趨勢相同，說明利用Fe3O4磁性納米粒子為載體制備固定化酶具有BA容性良好、易于回收等優勢，值得在相關領域進行更深入的研究和應用。本研究制備的GAPDH@Fe3O4具有BA降解效率高、操作簡便、成本可控等優點，具備在食品領域進行推廣應用的潛力。

2.2 櫻桃酒中基本理化指標分析

GAPDH@Fe3O4多批次處理結束后，立即測定櫻桃酒的基本理化指標，結果如表2所示。所有樣品的還原糖含量在2.17～2.20 g/L，酒精度均在11.4%vol左右，pH在3.40～3.41，總酸含量在8.36～8.38 g/L，揮發酸質量濃度為0.47 g/L。表2中的數據表明櫻桃酒在投入GAPDH@Fe3O4處理后，基本理化指標沒有發生明顯變化，說明固定化酶對酒體指標沒有負面作用。

表2 GAPDH@Fe3O4重復利用批次對 櫻桃酒理化指標的影響Table 2 Effect of GAPDH@Fe3O4 reuse batch on physicochemical indexes of cherry wine

2.3 櫻桃酒揮發性組分分析

GAPDH@Fe3O4多批次處理結束后，利用GC-IMS對櫻桃酒的揮發性香氣組分進行檢測，從櫻桃酒中共鑒定出37種揮發性化合物，其中酯類物質10種、醇類物質10種、醛類物質5種、酮類物質3種、酸類物質3種、萜烯及雜環類6種。每組樣品中每個物質的平均濃度及標準偏差如表3所示。

表3 GC-IMS分析櫻桃酒中揮發性化合物的信號強度Table 3 Signal intensities of volatile compounds in Cherry wine by GC-IMS

酯類物質既呈香也呈味，是酒類中重要的風味化合物。由表3可知，酯類物質中乙酸乙酯和乙酸甲酯所占比例較高，它們具有花香、甜香和果味，是櫻桃酒果香的重要來源[21]。對于櫻桃酒的揮發性酯類物質來說，與ES相比，GAPDH@Fe3O4多批次處理后，部分物質的含量發生了下降。例如，IT-1中，乳酸乙酯、異丁酸乙酯、乙酸異丁酯、乙酸異戊酯、丁酸乙酯的信號強度分別下降了19.5%、25.3%、34.5%、27.8%、25%，而乙酸甲酯、丙酸乙酯、乙酸丙酯、辛酸乙酯的信號強度幾乎未發生改變。IT-5中各物質的信號強度的損失率均小于IT-1，其中乳酸乙酯、異丁酸乙酯、乙酸異丁酯、乙酸異戊酯、丁酸乙酯的信號強度分別下降了19.3%、6.5%、10%、14.6%、17.5%，同樣地，乙酸甲酯、丙酸乙酯、乙酸丙酯、辛酸乙酯的信號強度也未發生改變。而在IT-10中，除乳酸乙酯和乙酸異丁酯的信號強度分別下降了8.8%和11.5%外，其余揮發性酯類的信號強度與ES相比均無變化。

本研究從櫻桃酒中鑒定出10種醇類物質，醇類物質是酵母在酒精發酵過程中利用氨基酸或糖代謝產生的次級產物，構成酒類的主體香氣成分[22]。櫻桃酒中對香氣有正面貢獻作用的醇類有正丙醇和異戊醇，均為一些具有花果香的化合物。由表3可知，GAPDH@Fe3O4多批次處理后，與ES相比，IT-1中，3-甲硫基丙醇、正己醇、正丁醇的信號強度分別下降了15.6%、18.7%、23%，而異戊醇、異丁醇、正丙醇、乙醇、異丙醇、甲醇、1-戊烯-3-醇等物質的信號強度未發生明顯降低。在IT-5中各物質的信號強度減少量均小于IT-1，3-甲硫基丙醇、正己醇、正丁醇的信號強度分別下降了7.8%、18.2%、16.7%，其余物質的信號強度均未降低。在IT-10中只有正己醇的信號強度下降了11.7%，其余揮發性醇類的信號強度與ES相比均未降低。

對櫻桃酒中揮發性酮類、醛類、酸類及萜烯、雜環等物質來說，酸類化合物在果酒中可起到協調香氣、減少刺激感等輔助作用[23]。雖然櫻桃酒中醛酮類物質和萜烯類含量較少，但其在維持酒體風味平衡及協調香氣中起著不可或缺的作用。與ES相比，IT-1中苯甲醛、2-己烯醛、丙醛、乙醛、丙酮、環戊酮、乙酸、α-蒎烯的信號強度均下降了20%左右，在IT-5中，上述物質的信號強度均下降了10%～12%左右；IT-10中只有乙醛的信號強度下降了14.7%。此外，不論是IT-1、IT-5還是IT-10中，丁酸、α-松油烯、丙酸、γ-松油烯、蒎烯、對甲苯、對二甲苯等物質的信號強度均未發生明顯降低，GAPDH@Fe3O4對上述物質沒有任何的負面影響。

綜上，隨著GAPDH@Fe3O4使用輪次的增加，櫻桃酒中揮發性組分的含量與初始樣品的差異性逐步減小，說明該固定化酶揮發性組分的吸附越來越少，處于幾乎飽和的狀態。

2.4 櫻桃酒酚類物質分析

櫻桃酒中非揮發性酚類物質的分離和鑒定通過HPLC法完成，通過對比標品和樣品的出峰時間來鑒定酚類物質，經過比較發現，如表4所示，ES中非揮發性酚類物質有沒食子酸(5.646 mg/L)、原兒茶酸(16.337 mg/L)、2,3,4-三羥基苯甲酸(9.541 mg/L)、新綠原酸(2 689.152 mg/L)、對羥基苯甲酸(9.335 mg/L)和綠原酸(47.475 mg/L)。

表4 GAPDH@Fe3O4重復利用批次對櫻桃酒的非揮發性酚類物質的影響Table 4 Effect of GAPDH@Fe3O4 reuse batch on non-volatile phenols of cherry wine

由表4可知，櫻桃酒中非揮發性酚類物質含量為2 777.486 mg/L，并且在GAPDH@Fe3O4多批次處理后，可以發現其對非揮發性酚類物質含量影響較小。與ES相比，在IT-1中，沒食子酸、原兒茶酸、2,3,4-三羥基苯甲酸、新綠原酸、對羥基苯甲酸、綠原酸的降解率分別為8.6%、4.9%、4.7%、1.08%、7.5%、9.1%，非揮發性酚類物質的總降解量為1.29%；在IT-5中，各物質的降解率都發生了不同程度的下降，上述物質的降解率為7.24%、3.6%、3.27%、0.94%、4.68%、3.1%，非揮發性酚類物質的總降解量為1%；在IT-10中，非揮發性酚類物質仍檢測出2 751.926 mg/L，其總降解量僅為0.9%，即在IT-10中，GAPDH@Fe3O4對非揮發性酚類物質幾乎無影響。

由于本研究在預實驗中發現磁性納米Fe3O4對多酚等物質具有一定的吸附作用(數據未列出)，故如材料與方法中所述，在磁性Fe3O4-APTES-戊二醛固定GAPDH之前，先將其投入櫻桃酒中靜置5 h進行預處理吸附多酚，使其達到吸附飽和狀態，洗滌后再進行磁性納米粒子與酶的結合。所以在正式投入使用后，櫻桃酒中主要的酯類化合物、醇類化合物、酸類化合物和酚類化合物等物質的種類數未發生改變并且各成分含量變化較小，總體穩定。可以發現GAPDH@Fe3O4對櫻桃酒的基本組成和風味物質都沒有負面影響。

2.5 櫻桃酒感官質量分析

雖然GC-IMS已對不同處理方式的櫻桃酒揮發性成分進行檢測分析，但其結果不能完全體現出酒體的整體香氣。因此由一個訓練有素的11人小組對酒體香氣進行感觀評估分析，結果如圖1所示。櫻桃酒的甜香和果香最濃郁，同時具有中等強度的花香，以及低強度的生青氣味，總體香氣得分ES和IT-10最高，IT-1和IT-5次之，GAPDH@Fe3O4重復利用批次下櫻桃酒的各項得分和總體得分均幾乎沒有差異，說明其對櫻桃酒的整體香氣沒有負面影響。

圖1 GAPDH@Fe3O4重復利用批次下櫻桃酒 感官評價雷達圖Fig.1 Radar chart of sensory evaluation of cherry wine under GAPDH@Fe3O4 reuse batch

這些結果表明，在實際的櫻桃酒環境中，GAPDH@Fe3O4在其底物上具有活性，并且其可重復使用性、可回收性和易回收性使其成為未來工業應用的一種強大的生物催化劑。

3 結論

在本研究中，通過將合成的新型功能化磁性納米顆粒固定三磷酸甘油醛脫氫酶，結合改性氧化鐵易于分離和特殊物理特性的優點，GAPDH@Fe3O4作為一種有效的納米生物催化劑被用于櫻桃酒中BA的去除。通過HPLC和GC-IMS分析櫻桃酒中BA和各項理化指標，發現其在BA的去除方面有極大的活性，并且在經過10次循環使用后還保持較高的BA降解活性，而對櫻桃酒的基本理化指標、揮發性物質以及非揮發性酚類物質幾乎無影響。綜上所述，GAPDH@Fe3O4在果酒釀造過程中去除BA方面具有巨大的潛力。