紅花椒精油對致口臭菌的抗菌和抗生物膜活性研究

易金枝，程志敏，陳彥榮，王建輝，李昌珠，肖志紅，劉冬敏1,,3,4，方芳,4，李思源

1(長沙理工大學 食品與生物工程學院，湖南 長沙，410114)2(湖南省林業(yè)科學院 省部共建木本油料資源利用國家重點實驗室， 湖南 長沙，410018)3(長沙理工大學 預制菜現代產業(yè)學院，湖南 長沙，410114)4(湖南省湘味餐調智造與質量安全工程技術 研究中心，湖南 瀏陽，410023)

紅花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim.)是蕓香科花椒屬植物，其果皮被譽為“八大味之一”，是我國傳統的香辛料[1]。紅花椒是我國一種重要的經濟作物，主要種植于甘肅、云南、山西、陜西和四川等省[2]，其中甘肅秦安、云南昭通、山西芮城和陜西韓城的花椒產量大而品質好，是我國種植花椒的重點產區(qū)。紅花椒中的主要活性成分包括精油、酰胺、黃酮和生物堿等，其中，精油是評價紅花椒果皮質量的重要指標[3]。研究表明，紅花椒精油(Zanthoxylumbungeanumessential oils, ZBEOs)具有廣譜抗菌活性，能有效抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和沙門氏菌的生長[4]。此外，LI等[5]研究發(fā)現ZBEOs能破壞硫色鐮刀菌細胞膜的完整性導致細菌死亡，從而達到抑菌效果。然而，關于ZBEOs對致口臭菌的抗菌和抗生物膜活性研究鮮有報道。

口臭是指從口腔、鼻、咽等充滿氣體的空腔中散發(fā)出的難聞氣味，其主要是由口腔中存在的革蘭氏陰性厭氧菌，如具核梭桿菌(Fusobacteriumnucleatum)和牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis)等，分解食物殘渣所產生的揮發(fā)性硫化物所致[6]。具核梭桿菌和牙齦卟啉單胞菌易黏附于牙齒和舌苔表面形成耐藥性更強的生物膜，且難以通過機械療法根除[7]。因此，清除致口臭菌生物膜是治療口臭的關鍵之一。目前治療口臭的主要手段是使用含化學抗菌劑的漱口水抑制或殺滅致口臭菌，如葡萄糖酸氯己定(chlorhexidine gluconate，CHX)[8]，但長期使用此類漱口水可能會導致口腔黏膜灼傷、口腔菌群失調等不良后果[9]。精油是植物的次生代謝產物，具有安全、低細胞毒性和環(huán)境友好等特性，已作為天然抗菌劑在漱口水等口腔護理產品中廣泛使用[3]。研究表明，柑橘精油在1 mg/mL時即可有效抑制牙齦卟啉單胞菌的生長[10]。王小玉[11]研究發(fā)現，檸檬精油在4.5 mg/mL和9 mg/mL時可有效抑制具核梭桿菌和牙齦卟啉單胞菌的生長；在2.5～9 mg/mL時，對牙齦卟啉單胞菌生物膜的形成有抑制作用。此外，《中華人民共和國藥典》記載，紅花椒可用于改善口腔衛(wèi)生[12]，且紅花椒與柑橘、檸檬同屬蕓香科植物，由此推測，ZBEOs可能對致口臭菌同樣具有抗菌和抗生物膜活性，但迄今尚無相關研究報道。

本研究以我國甘肅秦安、云南昭通、山西芮城和陜西韓城4個代表性產地的紅花椒為原料，分別提取精油，分析其主要化學成分；并選取與口臭密切相關的具核梭桿菌和牙齦卟啉單胞菌為受試菌，研究ZBEOs對致口臭菌的抗菌和抗生物膜活性，以期為ZBEOs在口臭防治中的潛在應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

以我國甘肅秦安、云南昭通、山西芮城和陜西韓城4個代表性產地的紅花椒為原料，其品種與地理位置信息如表1所示。

表1 原料信息Table 1 Raw material information

腦心浸液培養(yǎng)基(brain heart infusion，BHI)，美國BD公司；酵母粉、CHX、4%多聚甲醛固定液，麥克林生化科技有限公司；L-半胱氨酸鹽酸鹽，青島海博生物科技有限公司；氯化血紅素、維生素K1，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；PBS、結晶紫，上海源葉生物科技有限公司；Gluta固定液(電鏡專用，2.5%)，北京索萊寶科技有限公司；氯化鈉、無水硫酸鈉、無水乙醇、叔丁醇(均為分析純)，國藥集團化學試劑有限公司；L13152活/死菌染色試劑盒，美國賽默飛世爾科技公司。

1.2 儀器與設備

FW-200高速萬能粉碎機、SXKW-3000ML智能電熱套、SPX-250BⅢ生化培養(yǎng)箱，中興偉業(yè)儀器有限公司；ATY124電子天平，島津公司；Pegasus?4D全二維氣相色譜-飛行時間質譜，美國力可公司；LDZM-80 L立式高壓蒸汽滅菌鍋，申安醫(yī)療器械廠；YC-R50恒溫培養(yǎng)搖床，天津市泰斯特儀器有限公司；BBS-SDC醫(yī)用潔凈工作臺，山東博科醫(yī)療器械有限公司；VERSA max酶標儀，美谷分子儀器有限公司；JSM-IT500掃描電子顯微鏡，日本電子株式會社；激光共聚焦顯微鏡，日本奧林巴斯株式會社。

1.3 菌株

供試菌株：具核梭桿菌(ATCC 25586)、牙齦卟啉單胞菌(ATCC 33277)，北納創(chuàng)聯生物科技有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 ZBEOs的制備

ZBEOs的制備采用水蒸氣蒸餾法[13]。將干燥的紅花椒果皮粉碎后過60目篩，再行蒸餾。收集精油層，使用無水硫酸鈉脫水后，置于棕色螺旋蓋密封小瓶中，在(4±1) ℃貯存。ZBEOs提取率的計算如公式(1)所示：

(1)

式中：m1為所用紅花椒的質量，g；m2為提取后所得 ZBEO的質量，g。

1.4.2 ZBEOs的成分分析

ZBEOs的化學組成通過全二維氣相色譜-飛行時間質譜(comprehensive two-dimensional gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry，GC×GC-TOFMS)進行分析，其試驗條件在YAN等[14]的方法基礎上稍作修改。

GC×GC條件：第一維柱為DB-WAX(30 m×250 μm×0.25 μm)，進樣溫度250 ℃，初始溫度60 ℃保留1 min，以5 ℃/min升至260 ℃，保留4 min；氦氣(99.999 9%)流速為1.0 mL/min；分流比10∶1。第二維柱為DB-17MS(2 m×100 μm×0.10 μm)，柱溫高于第一維柱15 ℃；調制解調器溫度始終保持高于第二維柱15 ℃；全二維分析調制周期4.0 s，接口溫度270 ℃。

MS條件：離子源溫度230 ℃，電子轟擊源70 eV，檢測器1 670 V，采集率50張/s，質譜掃描范圍m/z33～550。

將10 μL精油樣品溶于1 mL無水乙醇中，取0.5 μL進樣。檢索NIST標準質譜庫，結合相關文獻確認精油的各個化學成分。采用面積歸一化法計算各成分相對含量。

1.4.3 菌懸液的制備

BHI液體培養(yǎng)基：準確稱取3.7 g BHI培養(yǎng)基，溶于100 mL去離子水中，高溫高壓滅菌，備用。

BHI-S液體培養(yǎng)基：準確稱取3.7 g BHI培養(yǎng)基、0.5 g酵母粉和0.004 gL-半胱氨酸鹽酸鹽，溶于100 mL去離子水中，高溫高壓滅菌后，室溫冷卻至40 ℃左右(手背觸碰不燙)，加入0.5 mL維生素K1和0.5 g氯化血紅素，備用。

具核梭桿菌懸液：挑取1環(huán)具核梭桿菌菌落于BHI液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床厭氧培養(yǎng)48 h后，用無菌生理鹽水稀釋至107CFU/mL，備用。

牙齦卟啉單胞菌懸液：挑取1環(huán)牙齦卟啉單胞菌菌落于BHI-S液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床厭氧培養(yǎng)72 h后，用無菌生理鹽水稀釋至107CFU/mL，備用。

1.4.4 ZBEOs對致口臭菌的抗菌活性研究

1.4.4.1 最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)和最小殺菌濃度(minimum bactericidal concentration，MBC)的測定

MIC的測定：采用微量肉湯稀釋法[15]。將ZBEOs溶解于無菌液體培養(yǎng)基中稀釋至32 mg/mL，通過連續(xù)二倍稀釋使ZBEOs的最終質量濃度為0.25～32 mg/mL，在無菌96孔板中加入100 μL菌懸液和等量梯度精油溶液。設置等量無菌液體培養(yǎng)基為陰性對照，等量12 mg/mL CHX溶液為陽性對照。96孔板在厭氧條件下于37 ℃培養(yǎng)48～72 h。MIC值為無可見細菌生長時ZBEOs的最低濃度。

MBC的測定：參考ZHANG等[15]的方法測定MBC值，并在此基礎上稍作修改。吸取10 μL無可見細菌生長孔的液體涂布于哥倫比亞血瓊脂平板上，在37 ℃下厭氧培養(yǎng)48～72 h，以確定MBC值。MBC值為無菌落形成時ZBEOs的最低濃度。

根據MIC和MBC值的測定結果確定抗菌活性最佳的ZBxEO，用于后續(xù)試驗。

1.4.4.2 致口臭菌生長曲線的測定

生長曲線的測定參考ZHANG等[16]的方法。將100 μL菌懸液和等量無菌液體加入至無菌96孔板中，37 ℃厭氧培養(yǎng)，分別在細菌生長的遲緩期和指數期加入終濃度為1×MIC的ZBxEO后繼續(xù)培養(yǎng)，每間隔2 h，從測試培養(yǎng)物中采集樣品，并通過酶標儀測量630 nm處的OD值。以細菌培養(yǎng)時間為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制生長曲線。

1.4.4.3 致口臭菌微觀結構的觀察

致口臭菌的微觀結構通過掃描電子顯微鏡觀察[17]。將無菌細胞爬片置于無菌24孔板中，每孔分別加入1 mL菌懸液和等量ZBxEO(1×MIC)，在37 ℃厭氧條件下孵育48～72 h，用無菌PBS輕輕漂洗爬片以去除浮游細菌，室溫干燥，加入Gluta固定液固定4 h后，用梯度乙醇(35%～100%,體積分數)脫水，叔丁醇脫去乙醇，所得樣品噴金后通過掃描電子顯微鏡觀察細菌的微觀結構。設置等量無菌液體培養(yǎng)基為陰性對照組，等量12 mg/mL CHX溶液為陽性對照組。

1.4.5 ZBxEO對致口臭菌的抗生物膜活性研究

1.4.5.1 ZBxEO對致口臭菌生物膜清除能力的測定

ZBxEO清除致口臭菌生物膜的能力采用結晶紫染色法測定[18]。將100 μL菌懸液和等量無菌液體培養(yǎng)基加入至無菌96孔板中，37 ℃厭氧培養(yǎng)48～72 h以預先形成生物膜。棄培養(yǎng)液，用無菌PBS輕輕漂洗以去除浮游菌。分別吸取200 μL已梯度稀釋的精油溶液(0.125～16 mg/mL)對應注入已形成生物膜的孔中，在37 ℃下繼續(xù)厭氧培養(yǎng)48～72 h后，棄培養(yǎng)液，漂洗。每孔注入200 μL 4%多聚甲醛固定液以固定生物膜，15 min后吸出，室溫干燥。每孔注入200 μL 1 g/L結晶紫溶液，染色5 min后棄去溶液，用無菌PBS洗去未結合的結晶紫溶液，室溫干燥。每孔加入200 μL 95%(體積分數)乙醇溶液振蕩以溶解結晶紫。將振蕩后孔板中的混合溶液對應轉入新的無菌96孔板中，在酶標儀中讀取波長595 nm處OD值。設置等量無菌液體培養(yǎng)基為陰性對照組，等量12 mg/mL CHX溶液為陽性對照組。MBEC50(50% of minimum biofilm eradication concentration，MBEC50)被定義為清除50%及以上細菌生物膜所需最低ZBxEO濃度，清除率的計算如公式(2)所示：

(2)

式中：ODNC為陰性對照組在595 nm下測得的OD值，%；ODTC為試驗組在595 nm下測得的OD值。

1.4.5.2 致口臭菌生物膜結構的觀察

致口臭菌的生物膜結構通過激光共聚焦顯微鏡觀察[19]。如1.4.5.1所述，在激光共聚焦培養(yǎng)皿中預先形成生物膜。將2 mL含ZBxEO(1×MBEC50)的液體培養(yǎng)基加入培養(yǎng)皿中，在37 ℃繼續(xù)厭氧培養(yǎng)48～72 h。用無菌蒸餾水輕輕漂洗培養(yǎng)皿以去除浮游菌。按照活/死菌染色試劑盒說明書，將SYTO 9(對活菌進行染色，綠色)和PI(對死菌進行染色，紅色)2種熒光染料預先混合，對培養(yǎng)皿底生物膜避光染色15 min。用無菌蒸餾水漂洗以去除未結合的染料。通過激光共聚焦顯微鏡觀察樣品中細菌生物膜結構。設置等量無菌液體培養(yǎng)基為陰性對照組，等量12 mg/mL CHX溶液為陽性對照組。

1.5 數據處理與統計分析

使用GraphPad Prism 9軟件對試驗數據進行方差分析(Two-way ANOVA，Turkey)和繪圖。所有試驗重復3次，結果均表示為平均值±標準偏差，P<0.05表示具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 ZBEOs的提取

2.1.1 ZBEOs的提取率

水蒸氣蒸餾法制備所得ZBEOs為淡黃色油狀液體。其中，云南紅花椒精油(ZB2EO)提取率最高，為(5.28±0.61)%，其次為甘肅紅花椒精油(ZB1EO)、山西紅花椒精油(ZB3EO)和陜西紅花椒精油(ZB4EO)，提取率分別為(4.07±0.29)%、(3.12±0.43)%和(2.54±0.57)%。

2.1.2 ZBEOs的成分分析

從ZB1EO、ZB2EO、ZB3EO和ZB4EO中分別鑒定出55、67、67、80種成分(相對含量>0.10%)，占總成分的95.98%～97.16%。受試紅花椒精油中均富含芳樟醇(4.68%～22.75%)、β-月桂烯(5.31%～17.02%)、檸檬烯(5.76%～9.78%)和檜烯(1.80%～6.18%)。其中ZB2EO中芳樟醇(22.75%)、檸檬烯(9.78%)和檜烯(7.18%)相對含量最高，ZB3EO中β-月桂烯的相對含量最高，達17.02%(附表https://kns.cnki.net/kcms/detail/detail.aspx?dbcode=CAPJ&dbname=CAPJLAST &filename=SPFX20220511003)。

花椒精油化學組成與花椒的品種、產地、提取方法等多個因素有關[20]。LI等[21]采用水蒸氣蒸餾法從陜西紅花椒中提取精油，運用GC-MS從ZBEOs中鑒定出39種化合物，占總成分的96.29%，其主要成分為D-檸檬烯(22.19%)、β-月桂烯(9.66%)、反式-β-羅勒烯(9.58%)、萜烯-4-醇(8.96%)和γ-萜烯(4.45%)。LEI等[22]以安徽紅花椒為原料，采用超臨界二氧化碳萃取法制備ZBEOs，運用GC-MS從ZBEOs共鑒定出48種化合物，占中成分的98.77%，其主要成分為6,9,12,15-十六碳四烯酸甲酯(12.40%)、4-松油基乙酸酯(11.87%)、D-檸檬烯(8.28%)、桉葉醇(5.69%)和α-松油醇(4.77%)。

“臨難抱佛腳”也好，常年燒香拜供也罷，神靈救不了貪官，菩薩更不會為他顯靈，這是毫無疑問的——劉志軍劉部長辦公室里，天天供著一塊辟邪避險的偌大“靠山石”，結果怎么樣呢？！

2.2 ZBEOs對致口臭菌的抗菌活性

2.2.1 ZBEOs對致口臭菌的抑制效果

ZBEOs對具核梭桿菌和牙齦卟啉單胞菌的MIC和MBC值如表2所示。受試ZBEOs對具核梭桿菌和牙齦卟啉單胞菌的MIC分別為1～2 mg/mL和2～4 mg/mL，MBC分別為1～4 mg/mL和4～8 mg/mL。其中ZB2EO對具核梭桿菌和牙齦卟啉單胞菌的MIC和MBC值最小，MIC分別為1 mg/mL和2 mg/mL，MBC分別為1 mg/mL和4 mg/mL。

由ZBEOs對2種致口臭菌MIC和MBC值的結果可知，受試ZBEOs對2種致口臭菌均具有一定的抑制作用，其中ZB2EO的抑制效果最佳。研究發(fā)現，芳樟醇[23]和檸檬烯[24]對熒光假單胞菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌具有良好的抗菌活性，可用作食品抗菌劑。ZB2EO的抗菌活性可能與其組成中芳樟醇和檸檬烯相對含量較高，以及不同組分之間的協同作用有關[25]。根據本實驗結果，選用ZB2EO進行后續(xù)試驗。

表2 ZBEOs對2種致口臭菌MIC和MBC值 單位：mg/mL

2.2.2 ZB2EO對致口臭菌生長的影響

ZB2EO對具核梭桿菌和牙齦卟啉單胞菌生長的影響結果如圖1所示。空白組中無ZB2EO添加，受試菌的生長曲線呈典型“S”型，具核梭桿菌和牙齦卟啉單胞菌分別在10 h和28 h后進入對數期，又分別在38 h和60 h后進入穩(wěn)定期。在遲緩期將ZB2EO(1×MIC)加入培養(yǎng)基，生長曲線呈平緩直線狀，表明受試菌增殖停止。在細菌生長對數期加入ZB2EO(1×MIC)，菌液OD值緩慢增長后停止，表明ZB2EO可有效抑制受試菌的增殖。此結果與LEI等[22]報道的1×MIC ZBEO(MIC=24 mg/mL)在體外對大腸桿菌生長的抑制效果相似，在細菌生長的不同時期加入ZBEO(1×MIC)均可有效抑制細菌增殖。

a-空白組，未添加ZB2EO(1×MIC)；b-對數期組，在對數中期 (分別在18 h和46 h)添加ZB2EO(1×MIC)；c-遲緩期組，在0 h 添加ZB2EO(1×MIC) A-具核梭桿菌；B-牙齦卟啉單胞菌圖1 ZB2EO(1×MIC)對具核梭桿菌和 牙齦卟啉單胞菌生長的影響Fig.1 Effects of ZB2EO (1×MIC) on the growth of F.nucleatum and P.gingivalis

2.2.3 ZB2EO對致口臭菌微觀結構的影響

經ZB2EO處理后具核梭桿菌和牙齦卟啉單胞菌的微觀結構變化如圖2所示。陰性對照組中的具核梭桿菌呈細長飽滿的紡錘狀。經12 mg/mL CHX處理后，具核梭桿菌細胞膜向內收縮，菌體表面有明顯褶皺。與12 mg/mL CHX處理結果不同，經ZB2EO(1×MIC)處理后細菌通透性發(fā)生明顯變化。陰性對照組中的牙齦卟啉單胞菌呈圓潤的短棒狀。而經12 mg/mL CHX和ZB2EO(1×MIC)處理后，牙齦卟啉單胞菌菌體明顯變形、收縮和破碎。

掃描電子顯微鏡結果直觀的反映出經ZB2EO(1×MIC)處理后，具核梭桿菌和牙齦卟啉單胞菌的形態(tài)結構嚴重損傷。精油可以穿透細胞壁并破壞細胞膜，從而對細菌的代謝產生負面影響，甚至導致細菌死亡[26]。研究表明，經1×MIC肉桂精油(MIC=6.25 μg/mL)處理后，牙齦卟啉單胞菌細胞膜通透性改變、形態(tài)被嚴重破壞[27]。LEI等[22]發(fā)現經1×MIC ZBEO(MIC=24 mg/mL)處理后，大腸桿菌嚴重變形，表面呈凹陷、皺縮狀，細菌形態(tài)的改變可能是由于ZBEO改變了細胞膜通透性，導致細菌內容物的泄漏所致。本研究結果與ZBEO對其他病原菌的作用結果較為一致，由此推測，ZB2EO(1×MIC)可能通過破壞具核梭桿菌和牙齦卟啉單胞菌的細胞膜，改變細胞膜通透性，導致其不能維持正常的生理結構，從而發(fā)揮抗菌作用。

圖2 ZB2EO(1×MIC)對2種致口臭菌微觀結構的影響 (×10 000)Fig.2 Effects of ZB2EO (1×MIC) on the microstructure against the two halitosis-causing bacteria (×10 000)

2.3 ZB2EO對致口臭菌的抗生物膜活性

2.3.1 ZB2EO清除致口臭菌生物膜的能力

ZB2EO清除2種致口臭菌生物膜的能力如圖3所示，ZB2EO對生物膜的清除能力存在劑量依賴性。ZB2EO對具核梭桿菌和牙齦卟啉單胞菌生物膜的MBEC50分別為4 mg/mL和8 mg/mL，清除率分別為(55.47±1.28)%和(55.66±1.71)%。當濃度高于MBEC50時，ZB2EO對具核梭桿菌和牙齦卟啉單胞菌生物膜的清除能力與陽性對照組相當(P>0.05)。當質量濃度為2～8 mg/mL時，ZB2EO對具核梭桿菌生物膜的清除能力極顯著高于對牙齦卟啉單胞菌生物膜的清除能力(P<0.01)。生物膜能抵御宿主防御機制、抗生素和其他環(huán)境波動等影響，賦予了細菌抵抗外界惡劣環(huán)境的能力，難以清除[7]。當肉桂精油濃度為4×MIC時(MIC=6.25 μg/mL)，可清除33.5%牙齦卟啉單胞菌生物膜[27]。研究表明，對傘花烴和γ-萜品烯對變形鏈球菌B200生物膜的MBEC50分別169 μg/mL和379 μg/mL[28]。此外，經1×MIC芳樟醇(MIC=0.5%)處理8 h后即可降低單核細胞增生李斯特氏菌生物膜中56.6%的生物量[29]。ZB2EO中含有對傘花烴、γ-萜品烯和芳樟醇，結合本試驗結果推測，ZB2EO可能具有替代化學抗菌劑防治口臭的潛力。

圖3 ZB2EO清除2種致口臭菌生物膜的能力Fig.3 Eradication ability of ZB2EO against the two halitosis-causing bacteria biofilms 注：不同字母表示同菌種不同濃度之間差異顯著(P<0.05)， **表示同濃度不同菌種之間差異極顯著(P<0.01)，ns表示 同濃度不同菌種之間差異不顯著(P>0.05)；PC代表陽性對照組

2.3.2 ZB2EO對致口臭菌生物膜結構的影響

ZB2EO(1×MBEC50)對受試菌生物膜的影響如圖4所示，活菌經SYTO 9染色呈綠色熒光，死菌經PI染色呈紅色熒光。陰性對照組中，生物膜中具核梭桿菌和牙齦卟啉單胞菌大量存活，且結構致密、生物膜形狀完整。經ZB2EO(1×MBEC50)和12 mg/mL CHX處理后，生物膜結構呈松散狀，膜中具核梭桿菌和牙齦卟啉單胞菌出現大量死亡但同時存在少許活菌。ZB2EO對具核梭桿菌和牙齦卟啉單胞菌的MBEC50大于其對2種受試菌的MBC值。由此推測，ZB2EO可能通過殺死生物膜內細菌，從而發(fā)揮清除生物膜作用。郭佳婧[29]研究發(fā)現，經柑橘精油處理后，單核細胞增生李斯特氏菌生物膜中的生物量減少，生物膜明顯變薄，與本研究結果相似。

如前所述，ZB2EO化學組成復雜，含有多種具有抗菌和抗生物膜活性的化合物。其中，對傘花烴、γ-萜品烯[28]和芳樟醇[29]可與細菌細胞膜結合，破壞菌體細胞膜完整性，使菌體內容物泄露，從而發(fā)揮抗菌活性，導致生物膜內生物量減少。而β-石竹烯則可與細菌胞外酶結合，通過抑制酶的活性間接影響細菌生物膜的形成與發(fā)展[30]。然而，ZB2EO是否可通過抑制致口臭菌的毒力因子(如菌毛、產酸、產糖等)而發(fā)揮抗生物膜活性，有待進一步研究。

圖4 ZB2EO對2種致口臭菌生物膜結構的影響Fig.4 Effects of ZB2EO against the two halitosis-causing bacteria biofilm structure

3 結論

本研究分析了我國4個代表性產地ZBEOs的主要化學成分，首次評估了ZBEOs對具核梭桿菌和牙齦卟啉單胞菌的抗菌和抗生物膜活性。研究結果表明，從云南紅花椒果皮中提取的精油(ZB2EO)的抗菌活性最強，并能有效清除受試菌生物膜，但其具體抗菌和抗生物膜機制有待進一步研究。后期體外研究可從基因學角度出發(fā)，探討ZBEOs對具核梭桿菌和牙齦卟啉單胞菌毒力因子相關基因表達的影響。但考慮到人體口腔微生態(tài)的復雜性，ZBEOs在體內使用是否安全，能否發(fā)揮相應的抗菌作用，宜通過動物模型進行深入研究，以期為ZBEOs在口腔中的應用提供理論參考。