歐李原花青素體外抗氧化性及對小鼠肝損傷保護的研究

徐瀟吟，田爭福，張惠玲*

1(寧夏食品微生物應用技術與安全控制重點實驗室，寧夏 銀川，750021)2(寧夏大學 食品與葡萄酒學院，寧夏 銀川，750021)

歐李(又稱“鈣果”)是我國獨有特殊的沙生藥用植物，薔薇科櫻屬矮生小灌木[1]。歐李中含有豐富的營養物質，如蛋白質、礦質元素、維生素以及原花青素等酚類化合物[2-3]。原花青素一般呈紅棕色粉末且易溶于水，是一種生物類黃酮[4]，具有抗氧化、抗癌、降血糖等作用[5-6]。肝臟作為動物體內最大的器官，為全身各組織器官供應血液，長期肝損傷是不可逆的，會進一步發展成肝硬化或者肝癌[7-8]，現代生活中的汽車尾氣、化工廠排出的廢水廢氣，不健康飲食和過度飲酒都是導致化學性肝損傷發病率不斷增高的誘因，如何有效預防和改善化學性肝損傷越來越受到人們重視[9]。有研究發現，其他植物如葡萄籽和蓮房中的原花青素分別對小鼠和大鼠肝損傷有一定保護作用[10-11]，但尚未見有研究證明歐李中的原花青素對肝有保護作用。CCl4是一種無色液體，吸入或者口服會肝中毒、引起肝功能衰竭[12]。CCl4進入生物體內代謝產生自由基和氧活性物質，和肝細胞膜脂質發生過氧化反應，破壞肝細胞膜的完整性和結構[13]。本實驗擬研究歐李中原花青素清除自由基的能力，再探討對CCl4誘導小鼠肝損傷的保護作用，為歐李作為副產品在食品及醫藥行業的開發應用提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

4周齡ICR雄性小鼠60只，購自寧夏醫科大學，許可證號：SCXK(寧)2020-0001。動物實驗在寧夏醫科大學動物實驗中心進行，所有動物實驗均經過寧夏醫科大學實驗動物倫理委員會(倫理審查號:IACUC-NYLAC-2020-186)審查批準，實驗過程嚴格遵守動物福利倫理與3R原則。動物飼養于SPF級動物房，相對濕度(50±10)%，溫度(22±2) ℃，每12 h明暗輪換。

1.2 材料與試劑

歐李購于寧夏中衛地區的農大四號。歐李原花青素，實驗室自制(歐李原花青素含量24.28 mg/g，由AB-8型大孔樹脂純化后純度最高可達58.53%)，通過高效液相色譜-質譜聯用技術測得歐李原花青素含有十余種原花青素種類，主要單體為表兒茶素，其次是原花青素B2。制備流程如下：

原料預處理(去核，凍干，粉碎)→有機溶劑浸提→減壓濃縮浸提液→離心除蛋白→低溫處理后抽濾除果膠→乙酸乙酯萃取→石油醚沉淀→冷凍干燥沉淀物→粗品→純化

原花青素標準品，源葉生物科技；抗壞血酸，北京博奧拓達科技有限公司；過硫酸鉀，天津市大茂化學試劑廠；四氯化碳，上海麥克林生化科技有限公司；2,2-二氮-雙(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)銨鹽、聯苯雙脂，上海源葉生物科技有限公司；DPPH標準品，梯希愛化成工業發展有限公司；丙氨酸轉氨酶(alanine aminotransferase，ALT)測定試劑盒、天冬氨酸轉氨酶(aspartate aminotransferase，AST)測定試劑盒、氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)測定試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)測定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)測定試劑盒、琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase，SDH)測定試劑盒，南京建成生物工程研究所。

1.3 儀器與設備

TG16-W離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；HH-3A數顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；BioTek酶標儀，西安騰領生物科技有限公司；麥克奧迪MOTIC生物顯微鏡，南京貝登醫療股份有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 歐李原花青素體外抗氧化活性研究[14-16]

1.4.1.1 ABTS陽離子自由基清除能力

7.4×10-3mol/mL ABTS與2.6×10-6mol/mL過硫酸鉀體積比1∶1混合，避光放置到溶液變為綠色，用無水乙醇稀釋至734 nm處的吸光值為0.7±0.02，分別加入1.0 mL質量濃度為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 μg/mL的原花青素樣品液、抗壞血酸溶液，原花青素標準品溶液，再加入2.0 mL ABTS陽離子自由基工作液，混合搖勻室溫下反應幾分鐘后在波長734 nm下測吸光度A1。

1.4.1.2 DPPH自由基清除能力

抗壞血酸、歐李原花青素、原花青素標準品溶于甲醇溶液，分別配制成質量濃度為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 g/mL的樣品液，加入3.8 mL DPPH-甲醇溶液，快速混勻反應30 min后在波長515 nm下測定吸光值A1。

上述實驗空白用蒸餾水代替樣品，測出吸光度為A0，分別計算ABTS陽離子自由基、DPPH自由基的清除率，計算如公式(1)所示：

(1)

式中：A0為空白上清液的吸光度；A1為樣品上清液的吸光度。

1.4.2 動物實驗設計與模型建立

60只4周齡ICR雄性小鼠，適應性飼養1周后隨機分為正常組、模型組、陽性組、歐李原花青素低、中、高劑量組，每組10只，除正常組外，其余各組每隔3 d腹腔注射1次CCl4和橄欖油的混合物1 mL/kg(體積比為1∶3)，正常組腹腔注射等量橄欖油。陽性組給予聯苯雙脂50 mg/kg、歐李原花青素低、中、高分別給藥25、50、100 mg/kg[17]。每日1次，連續灌胃5周。末次給藥后，小鼠禁食不禁水18 h，麻醉后心臟取血后處死。迅速取出小鼠肝、脾、腎臟組織并稱重，取部分肝臟和腎臟做蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining，HE)染色。另一部分迅速采用液氮速凍，移至-80 ℃備用[18]。

1.4.3 小鼠體重及臟器指標測定

實驗期間每隔3 d記錄1次小鼠體重，小鼠處死后，立即取出小鼠肝、脾、腎臟進行稱重，按公式(2)計算小鼠臟器指數：

(2)

式中：m1為小鼠臟器質量，g；m2為小鼠體重，g。

1.4.4 小鼠肝臟指標測定

精確稱取0.5 g肝臟組織，用無菌生理鹽水制成10%肝組織勻漿，5 000 r/min離心15 min,取上清液稀釋并測定小鼠肝組織MDA含量、GSH-Px和SOD活力大小，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.4.5 小鼠血清指標測定

末次給藥后，麻醉心臟取血，靜置20 min，3 000 r/min離心10 min制備血清。測定小鼠血清中AST和ALT水平，嚴格按照試劑盒說明書操作測定。

1.4.6 小鼠肝臟病理觀察

取肝臟和腎臟未有機械損傷部分于4%(體積分數)多聚甲醛中固定24 h后，脫水包埋，定位切片，做HE染色，最后鏡檢。

1.4.7 數據分析

所有實驗重復3次，實驗數據采用Origin 8.5軟件工具進行分析。

2 結果與分析

2.1 歐李原花青素體外抗氧化活性分析

如圖1和圖2所示，原花青素標準品、歐李原花青素提取樣品和抗壞血酸對于ABTS陽離子自由基和DPPH自由基的清除率與3種樣品使用濃度呈正相關，且ABTS陽離子自由基清除率最終可以達到100%。相同濃度條件下，3種樣品對ABTS陽離子自由基和DPPH自由基的清除率由高到低的順序均為：原花青素標準品>歐李原花青素提取樣品>抗壞血酸。

圖1 歐李原花青素對ABTS陽離子自由基的清除作用Fig.1 The scavenging effect of Cerasus humilis proanthocyanidins on ABTS cationic radicals

圖2 歐李原花青素對DPPH自由基清除作用Fig.2 The scavenging effect of Cerasus humilis proanthocyanidins on DPPH free radicals

2.2 歐李原花青素對小鼠體重及臟器指數的影響

如圖3所示，自然生長的情況下，小鼠的平均體重呈增長趨勢，模型組比正常組整體體重減輕。由圖4可知，對比正常組、模型組小鼠肝臟質量上升，肝臟指數顯著增加(P<0.05)，說明CCl4能導致肝臟一定程度上病變腫大。與模型組相比，高劑量組小鼠肝臟指數為模型組的90.55%，說明歐李原花青素能顯著抑制CCl4造成的肝組織腫大趨勢。脾臟為機體的淋巴器官，含淋巴細胞和巨噬細胞，在免疫系統中起重要作用。因此，脾臟指數可作為免疫反應功能變化的參考指標[19]。歐李原花青素中、高劑量組的腎臟和脾臟指數都有所降低，說明激發了小鼠機體的免疫反應，抑制脂肪在肝組織中的沉積和脾腎組織腫大效果更明顯。

圖3 小鼠體重指標Fig.3 Body weight index of mice in each group

a-肝指數；b-脾指數；c-腎指數圖4 小鼠臟器指數Fig.4 Organ index of mice in each group 注：與正常組比較，*代表P<0.05, **代表P<0.01;與模型組比較，#代表P<0.05，##代表P<0.01(下同)

2.3 歐李原花青素對小鼠肝臟酶活力的影響

如圖5所示，與正常組相比，模型組MDA值顯著升高(P<0.05)，SOD、GSH-Px值顯著下降(P<0.05)；與模型組相比，歐李原花青素中、高劑量組SOD、GSH-Px活性極顯著增加(P<0.01)，MDA含量極顯著下降(P<0.01)。MDA值是脂質過氧化的終產物，其活性大小可以反映脂質過氧化程度，活性越高表明對人體肝損傷越大[20]。結果表明，歐李原花青素各劑量組能夠提高機體抗氧化酶的活性，加速體內清除自由基的能力，降低脂質過氧化發生，原花青素在小鼠體內通過提升機體的抗氧化能力來減少CCl4對肝細胞的損傷，對CCl4引起的化學性肝損傷有較好的保護作用。

2.4 歐李原花青素對小鼠血清的影響

由圖6可知，與正常組相比，模型組血清中ALT顯著上升(P<0.01)、AST顯著上升(P<0.05)，表明CCl4誘導肝組織損傷模型建立，這是一種常用的模型，與人類肝臟病變相似[21]。肝細胞受到損傷時，其細胞膜通透性增加，胞質會釋放出ALT和AST，血清中兩者活力會顯著升高，是評價肝損傷程度的重要指標[22]。與模型組相比，歐李原花青素中、高劑量組小鼠血清中ALT、AST活性極顯著降低(P<0.01)，其中高劑量組ALT與AST活性分別比模型組降低了82.46%和69.41%，強于陽性藥物聯苯雙酯(29.15%、8.80%)。結果表明，歐李原花青素高劑量可以降低肝細胞膜的通透性，保護肝組織由于CCl4引起的損傷。

a-MDA值；b-SOD值；c-GSH-Px值圖5 小鼠肝臟指標Fig.5 Liver index of mice in each group

a-ALT值；b-AST值圖6 歐李原花青素對小鼠血清水平的影響Fig.6 Effect of Cerasus humilis proanthocyanidins on serum in mice

2.5 肝組織病理觀察結果

CCl4誘導的肝損傷是一種化學性模型，肝細胞會出現彌漫性脂肪變性[23]。如圖7所示,正常組肝組織結構正常，肝細胞形狀規則，排列整齊且形態清晰，模型組對比正常組有多處細胞死亡，細胞結構模糊且雜亂無章，箭頭處可以看到細胞間有明顯脂肪變性。歐李原花青素組隨著劑量增高，肝細胞中的脂肪變性有顯著緩解，但是低、中劑量組還是有明顯的脂肪變性，說明歐李原花青素可能具有護肝作用，且與劑量呈正相關。

3 結論與討論

本實驗通過腹腔注射CCl4建立肝損傷模型，CCl4在人體肝臟內進行一系列代謝，生成三氯甲基、氯自由基、羥自由基等，這些自由基會造成細胞脂質過氧化性損傷，使得肝細胞中ALT、AST得到充分釋放導致血清中ALT、AST含量明顯升高，脂質過氧化物MDA升高[24-25]。給予歐李原花青素干預后，與模型組相比較，MDA值顯著下降，血清中ALT、AST含量也顯著降低。結合肝病理觀察結果，說明歐李原花青素可以緩解小鼠肝細胞受到的病理損傷。綜上所述，歐李原花青素對CCl4造成的肝損傷有保護作用，其作用機理可能與降低脂質過氧化水平、提高肝細胞抗氧化酶活性、清除自由基有關。

a-正常組；b-模型組；c-陽性組;d歐李原花青素低劑量組；e-歐李原花青素中劑量組；f-歐李原花青素高劑量組圖7 CCl4誘導肝損傷小鼠肝組織病理學觀察結果Fig.7 Histopathological examination of CCl4-induced liver injury in mice