不同加工工藝藤椒油的麻味物質和風味成分研究

蔣凌燕，朱翔，趙麟，文成剛，尤霜，謝天芳，代倩

(幺麻子食品股份有限公司，四川 洪雅，620360)

藤椒，學名竹葉花椒(ZanthoxylumarmatumDC.，Z.armatum)，屬蕓香科花椒屬落葉植物，具有獨特的“香、麻”風味，是一種特色的藥食同源資源[1-2]。藤椒具有抗炎鎮痛、降血糖等功效[3-4]。在我國主要分布于西南等地，其中在四川省種植歷史悠久，尤以洪雅的藤椒種植較早[5]。

新鮮藤椒果實為翠綠色，表面布滿油胞，水分含量高[6]，極易褐變、霉變，因此大多加工為藤椒油[7]。藤椒油常見生產方法與花椒油類似，有油浸法(閟制法)、壓榨法、CO2超臨界萃取、溶劑萃取法、微波提取法等[8-10]。不同工藝生產的藤椒油呈現以香氣為主、麻味為輔的風味，其中“麻”和“香”由藤椒中的主要化學成分酰胺類和揮發油類組成[11]。

藤椒作為農產品或農副產品，大多數企業加工為藤椒油產品銷售。盡管目前藤椒油的工藝有很多，但對不同工藝制備的藤椒油中主要麻味物質含量及揮發性風味成分的比較鮮有報道。因此，本實驗以鮮榨工藝、閟制工藝和CO2超臨界萃取3種不同加工工藝制備的藤椒油為樣品，采用HPLC測定藤椒油中主要麻味物質含量及頂空固相微萃取聯合氣相色譜-質譜法(headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS)測定揮發性風味成分的組成，以期為藤椒油產品的開發及標準建立提供技術參考，為進一步研究藤椒油的生產加工奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮榨藤椒油、閟制藤椒油和CO2超臨界萃取藤椒油由幺麻子食品股份有限公司提供，菜籽油購于成都新興糧油有限公司。

色譜純甲醇、分析純甲醇、色譜純乙腈，成都市科隆化學品有限公司；羥基-α-山椒素標準品、羥基-β-山椒素標準品、羥基-γ-山椒素標準品，成都普思生物科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

ME-204分析天平，梅特勒-托列多儀器(上海)有限公司；FD-15-F-500A粉粹機，浙江永康市奮斗工程有限公司；YM-040S超聲波清洗器，深圳市方奧微電子有限公司；DZKW-S-4恒溫水浴鍋，北京市光明醫療儀器有限公司；1260高效液相色譜儀、Agilent CTC-8890—5977B氣相色譜-質譜聯用儀，美國安捷倫。

1.3 實驗方法

1.3.1 藤椒油加工工藝

1.3.1.1 鮮榨加工工藝

鮮榨藤椒油的加工工藝如圖1所示。

圖1 鮮榨藤椒油加工工藝Fig.1 Processing technology of freshly squeezed Z. armatum oil

1.3.1.2 閟制加工工藝

閟制藤椒油的加工工藝如圖2所示。

圖2 閟制藤椒油加工工藝Fig.2 Processing technology of fried Z. armatum oil

1.3.1.3 CO2超臨界萃取藤椒油加工工藝

CO2超臨界萃取藤椒油的加工工藝如圖3所示。

圖3 CO2超臨界萃取藤椒油加工工藝Fig.3 Processing technology of supercritical CO2 extraction of Z. armatum oil

1.3.2 藤椒油感官評定方法

感官評價小組一共有12名，其中男、女各6名。由經過專業培訓并具有熟悉感官評定方法的人員組成，參考感官品質評分標準對人員進行色澤、氣味、滋味及組織形態培訓描述，同時熟悉藤椒油相關知識。藤椒油評價要求及標準如表1所示[12]。

表1 藤椒油感官品質評分標準Table 1 The Sensory quality scoring standard of Z.armatum oil

1.3.3 藤椒油麻味物質的測定

1.3.3.1 樣品處理

準確稱取1.000 0 g(精確至0.000 1 g)藤椒油加入20.0 mL色譜級甲醇后，置于離心管渦旋1 min后在超聲波中浸提10 min，超聲結束后在4 500 r/min的條件下離心5 min，取上清液轉入25.0 mL棕色容量瓶中定容。制得的樣品在進樣前使用0.22 μm的有機相過濾膜過濾至進樣瓶中，-20 ℃冷凍保藏待用[13]。

1.3.3.2 液相色譜條件

1260型高效液相色譜儀，色譜柱Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)，檢測器DAD，流動相為超純水(A)-乙腈(B)，檢測波長268 nm，柱溫35 ℃，流速0.8 mL/min，進樣量10 μL。洗脫程序如表2所示。

表2 HPLC洗脫程序Table 2 HPLC elution procedure

1.3.3.3 羥基-α-山椒素標準曲線的繪制

準確稱取羥基-α-山椒素標準品0.010 0 g(精確至0.000 1 g)，用色譜級甲醇溶液定容于10.0 mL的棕色容量瓶中，配制成質量濃度為1 mg/mL的對照品貯備液。分別吸取對照品貯備液0.1、0.2、0.4、0.8、1.2 mL，用色譜級甲醇定容至2 mL，配制成一系列濃度的羥基-α-山椒素溶液(0.05、0.1、0.2、0.4、0.6 mg/mL)。各濃度分別取10 μL進行HPLC檢測，以峰面積為Y軸，濃度為X軸，繪制得到藤椒油麻味物質中羥基-α-山椒素的標準曲線為y=28.347x-185.72，R2=0.999 2。

1.3.3.4 羥基-β-山椒素標準曲線的繪制

準確稱取羥基-β-山椒素標準品0.001 0 g(精確至0.000 1 g)，用色譜級甲醇溶液定容于10.0 mL的棕色容量瓶中，配制成質量濃度為0.1 mg/mL的對照品貯備液。分別吸取對照品貯備液0.02、0.04、0.08、0.12、0.2 mL，用色譜級甲醇定容至2 mL，配制成一系列濃度的羥基-β-山椒素溶液(0.001、0.002、0.004、0.006、0.01 mg/mL)。各濃度分別取10 μL進行HPLC檢測，以峰面積為Y軸，濃度為X軸，繪制得到藤椒油麻味物質中羥基-β-山椒素的標準曲線為y=71.352x+17.05，R2=0.999 8。

1.3.3.5 羥基-γ-山椒素標準曲線的繪制

準確稱取羥基-γ-山椒素標準品0.002 0 g(精確至0.000 1 g)，用色譜級甲醇溶液定容于10.0 mL的棕色容量瓶中，配制成質量濃度為0.01 mg/mL的對照品貯備液。分別吸取對照品貯備液0.02、0.1、0.2、0.4、0.6 mL，用色譜級甲醇定容至2 mL，配制成一系列濃度的羥基-γ-山椒素溶液(0.000 1、0.000 5、0.001、0.002、0.003 mg/mL)。各濃度分別取10 μL進行HPLC檢測，以峰面積為Y軸，濃度為X軸，繪制得到藤椒油麻味物質中羥基-γ-山椒素的標準曲線為y=68.568x-1.702 5，R2=0.999 1。

1.3.3.6 樣品中羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素、羥基-γ-山椒素含量的計算

根據樣品峰面積從標準曲線中計算出山椒素的濃度，再根據公式(1)計算出樣品中羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素、羥基-γ-山椒素的含量：

山椒素含量/(mg·g-1)

(1)

1.3.4 藤椒油揮發性風味成分的測定

1.3.4.1 樣品處理

稱取樣品約0.1 g于5 mL頂空瓶中，壓蓋密封后，待上機分析。

老化溫度250 ℃；進樣前老化時間3 min；進樣后老化時間3 min；樣品平衡溫度60 ℃；樣品平衡時間10 min；萃取時間20 min；解吸時間3 min。

1.3.4.2 測試條件

色譜條件：色譜柱DB-WAX 50 m×0.25 μm×0.25 mm；程序升溫：初始柱溫為35 ℃，保持1 min，以5 ℃/min升至230 ℃，保持5 min；載氣為高純He；進樣口溫度230 ℃，分流比為10∶1；流量1 mL/min；全掃描。

質譜條件：電轟擊電離，離子源溫度230 ℃，NIST11.1標準譜庫檢索。

1.3.4.3 定性和定量

揮發性風味成分定性分析時，鮮榨藤椒油、閟制藤椒油和CO2超臨界萃取藤椒油的HS-SPME-GC-MS檢測結果采用NIST11.1標準譜庫檢索，從檢索結果中選擇匹配度>90%的揮發性風味成分，并結合相關文獻，確定其化學組成，進行定性分析[14]。

揮發性風味成分定量分析時，根據峰面積歸一化法計算藤椒油中揮發性風味成分的相對含量[15-16]。

1.3.5 數據統計分析

采用Microsoft Excel 2010軟件處理實驗數據和統計分析，運用Visio 2013、Origin 9.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 不同加工工藝對藤椒油感官評價的影響

根據藤椒油的感官品質評價結果(圖4)可以看出，因加工工藝的不同，鮮榨藤椒油、閟制藤椒油和CO2超臨界萃取藤椒油在色澤和氣味上存在明顯差異。采用鮮榨工藝能夠較好地保留新鮮藤椒的色澤及風味，使得加工的鮮榨藤椒油色澤翠綠、藤椒清香風味突出；通過閟制工藝生產的閟制藤椒油呈現出黃褐色的椒香風味，CO2超臨界萃取加工工藝制備的藤椒油在色澤、氣味上呈現出深褐色的麻香風味。對于滋味和組織形態的結果可以看出3種藤椒油均呈現為口味清爽、麻味綿長、柔和、持久的無雜質透明油狀液體。說明3種藤椒油加工工藝能夠賦予藤椒油不同的感官品質。

2.2 不同加工工藝對藤椒油麻味物質含量的影響

由圖5可知，鮮榨藤椒油、閟制藤椒油和CO2超臨界萃取藤椒油HPLC色譜峰的保留時間基本一致，峰面積大小存在區別，其中羥基-α-山椒素的峰面積明顯高于羥基-β-山椒素、羥基-γ-山椒素。結合表3可知，3種山椒素的保留時間差異不顯著(P>0.05)，說明采用不同加工工藝制備藤椒油，其主要麻味物質成分相同。

圖4 鮮榨、閟制和CO2超臨界萃取藤椒油的感官評價雷達圖Fig.4 Sensory radar map of freshly squeezed Z.armatum oil, fried Z.armatum oil and supercritical CO2 extraction of Z.armatum oil

圖5 鮮榨、閟制和CO2超臨界萃取藤椒油的HPLC色譜圖Fig.5 HPLC chromatograms of freshly squeezed Z.armatum oil, fried Z.armatum oil， and supercritical CO2 extraction of Z.armatum oil

由表3可知，鮮榨藤椒油、閟制藤椒油、CO2超臨界萃取藤椒油3種藤椒油的羥基-α-山椒素含量最高，是因為3種藤椒油原料中的主要麻味物質為羥基-α-山椒素[17-18]。ZHAO等[19]對花椒油和和青花椒油的主要麻味物質含量分析也得到了類似的結論。CO2超臨界萃取藤椒油中羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素含量及羥基-γ-山椒素顯著高于其他2種藤椒油(P<0.05)，羥基-α-山椒素含量達到(605.02±7.940) mg/g，分別是鮮榨藤椒油的10倍、閟制藤椒油的86倍；羥基-β-山椒素含量為(48.76±0.673) mg/g，是鮮榨藤椒油的83倍、閟制藤椒油的318倍；羥基-γ-山椒素含量為(1.58±0.004) mg/g，是鮮榨藤椒油的10倍、閟制藤椒油的68倍。超臨界萃取可以借助減壓、升溫的方法使超臨界流體CO2變成普通氣體，被萃取物質則完全或基本析出，從而達到分離提純的目的[20]，因此CO2超臨界萃取藤椒油中3種山椒素的含量均遠高出其他2種藤椒油。

鮮榨藤椒油的羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素、羥基-γ-山椒素含量均高于閟制藤椒油。一方面是因為鮮榨藤椒油是由鮮藤椒直接壓榨制得，閟制藤椒油則是以菜籽油為媒介浸提出麻味物質，使得閟制藤椒油中鮮藤椒原料占比少；另一方面是因為閟制工藝溫度較高，造成不穩定的山椒素發生分解或異構化[21]。

表3 羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素、 羥基-γ-山椒素保留時間及含量Table 3 The eretention time content of hydroxy-α-sanshool, hydroxy-β-sanshool, and hydroxy-γ-sanshool

2.3 不同加工工藝對藤椒油揮發性風味成分組成和含量的影響

2.3.1 鮮榨藤椒油揮發性風味成分測定結果

鮮榨藤椒油揮發性風味成分結果如表4所示。鮮榨藤椒油揮發性風味成分共計76種，烯類物質有28種、醛類物質有13種、酮類物質有5種、酯類物質有10種、醇類物質有13種、其他有7種，含量最高的是烯類物質，占總數的53.65%。76種鮮榨藤椒油揮發性風味成分中，相對含量大于2%的共有7種，分別為芳樟醇(30.04%)、D-檸檬烯(20.95%)、(-)-β-蒎烯(11.92%)、3-異丙基-6-亞甲基-1-環己烯(5.53%)、乙酸芳樟酯(3.08%)、(Z)-3,7-二甲基-1,3,6-十八烷三烯(2.75%)、α-崖柏烯(2.37%)。與鮮藤椒相同，鮮榨藤椒油中主要揮發性風味成分為芳樟醇、檸檬烯[5]。芳樟醇作為鮮榨藤椒油的主要揮發性風味成分，具有獨特的花香、青香、木香、甜香[22]；常被作為芳香劑和調味劑添加到洗滌劑和食品中，同時還具備抗菌、抗炎癥等功效[23]。梅佳林等[24]研究了芳樟醇對三文魚源莓實假單胞菌的抑菌機理，結果顯示芳樟醇能破壞莓實假單胞菌的細胞膜和細胞壁的通透性和完整性，對細菌有良好的抑制作用。其次，D-檸檬烯是一種單萜類化合物[25]，呈現為薄荷味、柑橘味，使得鮮榨藤椒油體現出濃郁的清香風味。

2.3.2 閟制藤椒油揮發性風味成分測定結果

經過高溫閟制得到的藤椒油擁有鮮藤椒的清香和麻味，體現出濃郁的椒香風味。閟制藤椒油揮發性風味成分結果如表4所示。閟制藤椒油揮發性風味成分共計78種。烯類物質有18種、醛類物質有23種、酮類物質有8種、酯類物質有4種、醇類物質有13種、其他物質有12種，含量最高的是醇類物質，占總數的43.62%。閟制藤椒油78種揮發性風味成分中，相對含量大于2%的共有6種，分別為芳樟醇(40.57%)、D-檸檬烯(18.54%)、月桂烯(7.28%)、檜烯(5.75%)、3-異丙基-6-亞甲基-1-環己烯(2.97%)、(E,E)-2,4-庚二烯醛(2.75%)。其中，芳樟醇含量高達40.57%，是D-檸檬烯的2.19倍。閟制工藝的高溫，導致鮮藤椒中部分不穩定的揮發性風味成分散失或分解，而穩定的D-檸檬烯得到保留。因此，相較于鮮榨藤椒油的芳樟醇，閟制藤椒油的芳樟醇相對含量得到提升。

2.3.3 CO2超臨界萃取藤椒油揮發性風味成分測定結果

CO2超臨界萃取藤椒油極大的保存藤椒的麻味物質和揮發性風味成分，體現出了濃郁的麻香風味。其揮發性風味成分結果如表4所示。CO2超臨界萃取藤椒油揮發性風味成分共計74種。烯類物質有23種、醛類物質有12種、酮類物質有3種、酯類物質有6種、醇類物質有12種、其他物質有18種，含量最高的是烯類物質，占總數的68.01%。其中，相對含量大于2%的共有10種，分別為芳樟醇(17.20%)、D-檸檬烯(16.51%)、檜烯(14.24%)、(-)-β-蒎烯(12.41%)、3-異丙基-6-亞甲基-1-環己烯(3.65%)、α-水芹烯(3.54%)、乙酸芳樟酯(3.41%)、β-可帕烯(2.93%)、(+)-α-蒎烯(2.68%)、β-石竹烯(2.34%)。與鮮榨藤椒油和閟制藤椒油一樣，芳樟醇和D-檸檬烯在CO2超臨界萃取藤椒油中也是主要揮發性風味成分，但芳樟醇的相對含量顯著少于鮮榨藤椒油和閟制藤椒油，D-檸檬烯的差異不顯著。一方面是因為CO2超臨界萃取藤椒油的原料是干藤椒，鮮榨藤椒油與閟制藤椒油的原料是鮮藤椒，揮發性風味成分存在區別，SRIWICHAT等[26]的研究表明干燥會導致藤椒中芳樟醇的含量降低；另一方面是芳樟醇屬于鏈狀結構化合物，D-檸檬烯是環狀結構化合物，在面臨超臨界萃取的高壓時，環狀結構的D-檸檬烯穩定性高于鏈狀結構的芳樟醇。

表4 藤椒油揮發性風味成分相對含量Table 4 Relative content of volatile flavor components in Z.armatum oil

續表4

續表4

2.3.4 三種不同工藝的藤椒油揮發性風味成分對比

根據表4所示，3種藤椒油共檢測出的揮發性風味成分有143種，分別為：烯類物質37種、醛類物質28種、醇類物質28種、酯類物質12種、酮類物質10種、其他物質28種。其中，鮮榨藤椒油、閟制藤椒油和CO2超臨界萃取藤椒油共有的揮發性風味成分有23種，包括烯類物質8種(24.02%～44.81%)、醛類物質6種(0.82%～2.42%)、酮類物質3種(0.87%～2.69%)、酯類物質2種(0.88%～3.67%)、醇類物質2種(17.23%～30.15%)、其他物質2種(0.38%～0.50%)。采用熱圖可減少分析中的干擾和誤差，同時能將3種藤椒油共有揮發性風味成分的相對含量數據進行可視化[27-28]。圖6為3種藤椒油共有的23種揮發性風味成分熱圖，藍色代表同類揮發性風味成分在不同藤椒油中的相對含量高、紅色代表同類揮發性風味成分在不同藤椒油中的相對含量低。可明顯觀察出共有的23種揮發性風味成分中，芳樟醇和D-檸檬烯相對含量較高，分別達到17.20%～30.04%、16.51%～20.95%。與閟制藤椒油相比，鮮榨藤椒油和CO2超臨界萃取藤椒油中的(-)-β-蒎烯相對含量較高，分別達到11.92%和12.41%。

圖6 藤椒油共同揮發性風味成分熱圖Fig.6 Heat map of common volatile flavor components of Z.armatum oil

圖7列出了鮮榨藤椒油、閟制藤椒油和CO2超臨界萃取藤椒油的HS-SPME-GC-MS色譜圖。從色譜圖中可知3種藤椒油的揮發性風味成分在種類和含量上存在差異，CO2超臨界萃取藤椒油的揮發性風味成分種類大于其他2種藤椒油。3種藤椒油分別含有特有揮發性風味成分，分別為鮮榨藤椒油的特有揮發性風味成分共有20種，分別為烯類物種6種[異戊二烯、(E)-4,8-二甲基-1,3,7-壬三烯、(3E,5E)-2,6-二甲基-1,3,5,7-辛四烯、(-)-α-蓽澄茄油烯、(+)-γ-卡地烯、反-菖蒲烯]、醛類物種1種(十一醛)、酮類物種2種(4-乙基環己酮、苯乙酮)、酯類物種5種[乙酸異戊酯、乙酸己酯、乙酸庚酯、左旋乙酸冰片酯、(±)-α-乙酸松油酯]、醇類物種5種(3-己烯-1-醇、反式-3-己烯-1-醇、正壬醇、香葉醇、橙花叔醇)、其他物種1種(間-傘花烴)，其中含量最多的為橙花叔醇，是一種重要的香料和倍半萜精油成分，同時具有抗菌、抗氧化等生物學功能[29]，相對含量為0.31%。閟制藤椒油的特有揮發性風味成分共有35種，分別為烯類物種3種(2-甲基-1-丁烯、月桂烯、松油烯)、醛類物種10種[丙烯醛、丁醛、戊醛、反式-2-戊烯醛、(E)-2-庚烯醛、2-甲基庚-2-烯醛、反-2-辛烯醛、(E,E)-2,4-庚二烯醛、(E)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛、反式-2,4-癸二烯醛]、酮類物種5種(2-丁酮、1-戊烯-3-酮、2-庚酮、仲辛酮、甲基庚烯酮)、酯類物種1種(苯甲酸2-氯乙酯)、醇類物種9種[1-戊烯-3-醇、1-戊醇、順-2-戊烯-1-醇、蘑菇醇、(-)-4-萜品醇、α-萜品醇、橙花醇、蘇合香醇、反式-橙花叔醇]、其他物種7種(醋酸、戊烷油、庚烷、正辛烷、2-乙基呋喃、1,3,3-三甲基2，6-環-正十八烷、4-乙烯基-1,2-二甲基-苯)，其中含量最多的為月桂烯，具有獨特的花香氣味[22]，相對含量達到7.28%。CO2超臨界萃取藤椒油的特有揮發性風味成分共有26種，分別為烯類物質5種[α-水芹烯、3-蒈烯、7-十四碳烯、(+)-香橙烯、3,7,11-三甲基-1,3,6,10-十二碳-四烯]、醛類物質3種[(E,E)-2,4-己二烯醛、苯甲醛、十三醛]、醇類物質6種[(1R,5R)-香芹醇、三甲基苯甲醇、香芹醇、2，6-二甲基-3，7-辛二烯-2，6-二醇、4-異丙基苯甲醇、2S，4aR)-a，a，4a，8-四甲基-1，2，3，4，4a，5，6，7-八氫-2-萘基醇)]、其他物質12種[7,7-二甲基-2-甲基降冰片烷、2-甲基十二烷、4-四氫呋喃、正十五烷、正十六烷、2-甲基二六烷、1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)環己烷-1,2-二醇、縮水甘油、乙酸銨、(1S,8aR)-1-異丙基-4,7-二甲基-1,2,3,5,6,8a-六氫萘、(1S)-1,2-二氫-4,7-二甲基-1-(1-甲基乙基)-萘、石竹素]，其中含量最多的為α-水芹烯，具有黑胡椒香和藹荷香[22]，相對含量為3.54%。3種藤椒油揮發性風味成分的種類及相對含量存在的差異，可能是3種藤椒油分別具有獨特香味的原因。

圖7 鮮榨、閟制和CO2超臨界萃取藤椒油的 HS-SPME-GCMS色譜圖Fig.7 HS-SPME-GCMS chromatogram of freshly squeezed Z. armatum oil, fried Z. armatum oil and supercritical CO2 extraction of Z.armatum oil

3 結論

本文研究對比分析了鮮榨藤椒油、閟制藤椒油和CO2超臨界萃取藤椒油3種藤椒油產品中主要麻味物質和揮發性風味成分。結果發現，三者的羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素、羥基-γ-山椒素含量存在顯著差異(P<0.05)，CO2超臨界萃取藤椒油中3種山椒素含量最高，羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素、羥基-γ-山椒素含量分別為(605.02±7.940) mg/mL、(48.76±0.673) mg/mL、(1.58±0.004) mg/mL。從3種藤椒油中共鑒定出143種揮發性成分，主要種類是烯類、醛類和醇類化合物，共有揮發性風味成分有23種。其中，作為主要成分的芳樟醇、D-檸檬烯相對含量分別到達17.20%～30.04%和16.54%～20.95%。而3種藤椒油的特有風味成分分別有20種、35種、26種。可見，不同加工工藝制備的藤椒油中麻味成分含量和揮發性風味成分的種類及相對含量存在差異，影響了藤椒油產品的感官品質，為藤椒油組分的進一步研究提供了數據參考。