急性溫度脅迫對(duì)縊蟶不同組織脂質(zhì)過氧化及抗氧化生理響應(yīng)的影響

方佳琪，張敏,2,3*，鄭凱，賈淼，李奇勛，李玉申，王紅婷

1(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306)2(食品科學(xué)與工程國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心(上海海洋大學(xué))，上海，201306) 3(上海冷鏈裝備性能與節(jié)能評(píng)價(jià)專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺(tái)，上海，201306)

縊蟶(Sinonovaculaconstricta)是瓣鰓綱竹蟶科貝類動(dòng)物，俗稱蟶子，在北方稱之為蜻。縊蟶廣泛分布于中國沿海地區(qū)，是中國四大養(yǎng)殖貝類之一，也是浙江、福建等地重要的養(yǎng)殖品種[1]。縊蟶含有豐富的碳水化合物和灰分，并以高蛋白和低熱量的特點(diǎn)深受消費(fèi)者喜愛。隨著縊蟶養(yǎng)殖技術(shù)的成熟，培育出的優(yōu)良品種具有生長周期短、成本低、經(jīng)濟(jì)效益高等優(yōu)點(diǎn)[2]，同時(shí)縊蟶池塘養(yǎng)殖規(guī)模也逐漸擴(kuò)大，但天氣變化[3]和季節(jié)更替[4]常常引起池塘水體溫度的劇烈波動(dòng)，對(duì)其生長和存活造成不利影響。因此，研究溫度變化對(duì)縊蟶的影響具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

溫度是影響貝類生長及代謝的重要環(huán)境因子，溫度的急劇變化會(huì)引起貝類的多種應(yīng)激反應(yīng)，使生理代謝加速并導(dǎo)致其耗氧量大幅增加，當(dāng)貝類長時(shí)間處于這種應(yīng)激狀態(tài)下，機(jī)體進(jìn)一步生成活性氧并大量積累[5-6]。楊儉等[7]研究了文蛤(Meretrixmeretrix)在不同急性溫度(20、25、30、35 ℃)脅迫下的生理響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)由于溫度的上升提高了文蛤體內(nèi)相關(guān)酶的活性，加快了生化反應(yīng)的速率，導(dǎo)致了耗氧率的升高；孟廣瑋等[8]研究了長牡蠣(Crassostreagigas)在溫度漸升和溫度突升脅迫下的存活情況，發(fā)現(xiàn)高溫脅迫會(huì)導(dǎo)致長牡蠣內(nèi)臟團(tuán)中過氧化氫酶(catalase, CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、總抗氧化能力(total antioxidant capacity, T-AOC)以及丙二醛(malondialdehyde, MDA)顯著上升。李曉英等[9]在對(duì)青蛤(CyclinasinensisGmelin)過氧化物酶(peroxidase, POD)的研究中發(fā)現(xiàn)，青蛤機(jī)體內(nèi)不同組織受到的氧化應(yīng)激程度各不相同，溫度驟升脅迫引起青蛤機(jī)體中POD的大量表達(dá)，在各組織中肝胰腺POD活性最高，其次為外套膜和鰓瓣。貝類機(jī)體應(yīng)激脅迫狀態(tài)下常常伴隨著抗氧化酶活性的變化，其中SOD、CAT、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GPX)以及T-AOC被認(rèn)為是研究氧化應(yīng)激的重要指標(biāo)[10]。目前，國內(nèi)外學(xué)者在溫度脅迫對(duì)貝類生理機(jī)能的影響方面進(jìn)行了大量的研究，但對(duì)縊蟶溫度脅迫的研究均限于單一組織，而對(duì)縊蟶不同組織的氧化應(yīng)激和生理代謝的研究少有報(bào)道。因此，本研究以縊蟶為試驗(yàn)對(duì)象，探討縊蟶外套膜、鰓和消化腺組織中抗氧化酶活性和活性氧代謝物質(zhì)在急性溫度脅迫(25、28、30、32、35 ℃)下的變化規(guī)律，旨在為縊蟶主要組織的氧化應(yīng)激響應(yīng)機(jī)制提供更完善的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)用縊蟶于2021年4月購自上海市浦東新區(qū)南匯新城鎮(zhèn)蘆潮港集貿(mào)市場(chǎng)，1 h內(nèi)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，殼長(5.8±0.3) cm，殼寬(2.1±0.2) cm。挑選富有活力且雙殼均無破損的縊蟶作為試驗(yàn)研究對(duì)象。

超氧化物歧化酶測(cè)試盒、過氧化氫酶測(cè)試盒、谷胱甘肽過氧化物酶測(cè)試盒、總抗氧化能力測(cè)試盒、丙二醛測(cè)試盒、過氧化氫測(cè)試盒、谷胱甘肽測(cè)試盒、總蛋白定量測(cè)試盒，南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

BPS-100CA 型恒溫恒濕箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；AUW320 型分析天平，上海亞津電子科技有限公司；FSH-2A 型勻漿機(jī)，江蘇金怡儀器科技有限公司；H-2050R 型離心機(jī)，湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

為使縊蟶處在適宜的生長代謝環(huán)境，且減少鹽度改變導(dǎo)致滲透壓的變化帶來的應(yīng)激反應(yīng)，首先在大塑料箱中配制鹽度為(18±0.5) ‰的人工海水，并用增氧泵持續(xù)充氣，不斷增加溶解氧，使水中溶氧量≥4.0 mg/L，形成一個(gè)小型暫養(yǎng)池。將帶有泥沙的縊蟶清洗干凈后分裝在2個(gè)塑料筐中，完全浸沒于大塑料箱人工海水中進(jìn)行暫養(yǎng)，貝水比(體積比)約為1∶3，每隔3 h換1次水，在整個(gè)暫養(yǎng)過程中使暫養(yǎng)池水溫保持在(20±1) ℃。

試驗(yàn)設(shè)置25、28、30、32、35 ℃共5個(gè)溫度組，每個(gè)溫度組3個(gè)平行，每個(gè)平行100只縊蟶。暫養(yǎng)結(jié)束后，隨機(jī)選取規(guī)格相近的縊蟶，平均體質(zhì)量為(15±0.6) g。將縊蟶由暫養(yǎng)池中取出，直接轉(zhuǎn)移至恒溫恒濕箱中，在溫度脅迫4 h后取樣，每個(gè)平行組隨機(jī)取3只縊蟶。

1.3.2 樣品采集

解剖縊蟶，提取外套膜、鰓和消化腺組織，分別在冷的生理鹽水中漂洗，用濾紙擦干其表面水分后，在分析天平上稱重并移入勻漿管中。同時(shí)按質(zhì)量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例加入0.86%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))生理鹽水，冰浴條件下使用勻漿機(jī)勻漿，轉(zhuǎn)速為8 000～10 000 r/min。將10%勻漿液用離心機(jī)以8 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心20 min, 所得上清液進(jìn)行總蛋白定量、抗氧化酶活性以及MDA、H2O2、還原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量的測(cè)定。

1.3.3 SOD、CAT、GPX、T-AOC活性的測(cè)定

SOD活性的測(cè)定參照南京建成SOD測(cè)試盒說明書，采用羥胺法，定義每毫克組織蛋白在1 mL反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD量為1個(gè)SOD活力單位(U)。CAT活性的測(cè)定參照南京建成CAT測(cè)試盒說明書，采用紫外比色法，定義每毫克組織蛋白中CAT每秒鐘分解吸光度為0.50～0.55的底物中的H2O2相對(duì)量為1個(gè)CAT活力單位(U)。GPX活性的測(cè)定參照南京建成GPX測(cè)試盒說明書，采用分光光度法，定義每毫克蛋白質(zhì)每分鐘扣除非酶反應(yīng)的作用，使反應(yīng)體系中GSH濃度降低1 mol/L為1個(gè)GPX活力單位(U)。T-AOC的測(cè)定參照南京建成T-AOC測(cè)試盒說明書，采用比色法，定義每分鐘每毫克組織蛋白使反應(yīng)體系的吸光度值每增加0.01時(shí)為1個(gè)T-AOC活力單位(U)。

1.3.4 MDA、H2O2以及GSH含量的測(cè)定

MDA含量的測(cè)定參照南京建成MDA測(cè)試盒說明書，采用硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)法，結(jié)果以nmol/mg表示；H2O2含量的測(cè)定參照南京建成H2O2測(cè)試盒說明書，采用分光光度法，結(jié)果以mmol/g表示。GSH含量的測(cè)定參照南京建成GSH測(cè)試盒說明書，采用比色法，結(jié)果以mg/g表示。

1.4 數(shù)據(jù)處理分析

應(yīng)用SPSS 19.0軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析及Duncan多重比較，顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 急性溫度脅迫對(duì)縊蟶不同組織MDA含量的影響

MDA是細(xì)胞膜脂過氧化作用的產(chǎn)物之一[5]。如圖1所示，不同溫度組之間，只有縊蟶消化腺中MDA含量差異顯著(P<0.05)；且隨著脅迫溫度的升高，3個(gè)組織中MDA含量均呈現(xiàn)出持續(xù)升高的趨勢(shì)，并在35 ℃時(shí)達(dá)到最大值，分別為6.03、4.96、4.49 nmol/mg，其中35 ℃時(shí)消化腺M(fèi)DA含量大幅上升，是25 ℃的2.6倍，相較于32 ℃上升了53.0%。在同一溫度下，各組織MDA含量由高到低分別為外套膜、鰓、消化腺，與SOD等抗氧化酶的活性變化趨勢(shì)相反；除35 ℃鰓和消化腺組織，其他溫度下各組織MDA含量均有顯著性差異(P<0.05)，這表明溫度的升高對(duì)縊蟶機(jī)體產(chǎn)生的氧化應(yīng)激較為嚴(yán)重，外套膜中脂質(zhì)過氧化作用較鰓和消化腺更為顯著。

圖1 急性溫度脅迫對(duì)縊蟶不同組織MDA含量的影響Fig.1 Effects of acute temperature stress on MDA content in different tissues of Sinonovacula constricta 注：圖中不同小寫字母表示不同溫度組間的差異顯著(P<0.05), 不同大寫字母表示同一溫度組不同組織間的差異顯著(P<0.05) (下同)

2.2 急性溫度脅迫對(duì)縊蟶不同組織H2O2含量的影響

H2O2是一種具有細(xì)胞毒性的物質(zhì)，會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激和細(xì)胞損傷。如圖2所示，在同一溫度下，除28 ℃外，外套膜和消化腺中H2O2含量無顯著性差異(P>0.05)，且與鰓中差異顯著(P<0.05)。隨著脅迫溫度的升高，鰓和消化腺中H2O2含量持續(xù)升高，而外套膜中H2O2含量則呈現(xiàn)出先降低后升高的趨勢(shì)；整體來看，3個(gè)組織H2O2含量均在35 ℃時(shí)達(dá)到最大值，分別為184.52、162.74、180.30 mmol/g。在較高溫度的脅迫下，對(duì)比3個(gè)組織，外套膜中H2O2含量上升幅度最大，35 ℃時(shí)相較于32 ℃上升了25.0%，而消化腺上升幅度最小，僅比32 ℃上升了18.4%，這表明在高溫環(huán)境下消化腺中活性氧積累速率較慢，且清除H2O2的能力強(qiáng)于外套膜。

圖2 急性溫度脅迫對(duì)縊蟶不同組織H2O2含量的影響Fig.2 Effects of acute temperature stress on H2O2 content in different tissues of Sinonovacula constricta

2.3 急性溫度脅迫對(duì)縊蟶不同組織SOD活性的影響

圖3 急性溫度脅迫對(duì)縊蟶不同組織SOD活性的影響Fig.3 Effects of acute temperature stress on SOD activity in different tissues of Sinonovacula constricta

2.4 急性溫度脅迫對(duì)縊蟶不同組織CAT活性的影響

CAT能夠直接將 H2O2分解為H2O[5]，其活性變化如圖4所示。與SOD類似的是，在同一溫度下3個(gè)不同組織之間的CAT活性有著顯著性差異(P<0.05)，其中消化腺中CAT活性最高，鰓次之，外套膜最低。不同溫度組之間，隨著脅迫溫度的升高，外套膜和消化腺中CAT活性均呈現(xiàn)出持續(xù)降低的趨勢(shì)；在鰓中，其CAT活性先升高后降低，但25和28 ℃組CAT活性無顯著差異(P>0.05)。3個(gè)組織CAT活性均在35 ℃時(shí)達(dá)到最小值，分別為7.33、10.63、19.87 U/mg，其中外套膜中CAT活性下降得最快，較峰值下降了22.6%，這表明縊蟶機(jī)體內(nèi)CAT活性與溫度變化呈負(fù)相關(guān)，且溫度越高，CAT失活越快，各組織內(nèi)CAT失活速率由高到低分別為外套膜、鰓、消化腺。

圖4 急性溫度脅迫對(duì)縊蟶不同組織CAT活性的影響Fig.4 Effects of acute temperature stress on CAT activity in different tissues of Sinonovacula constricta

2.5 急性溫度脅迫對(duì)縊蟶不同組織GPX活性的影響

GPX能與SOD、CAT協(xié)同作用，進(jìn)一步將H2O2分解為無毒性物質(zhì)[11]，其活性變化如圖5所示。同一溫度下各組活性出現(xiàn)了明顯下降的趨勢(shì)，且與32 ℃差異顯著(P<0.05)；而消化腺中GP織GPX活性有顯著性差異(P<0.05), 由高到低分別為消化腺、鰓、外套膜，表明在縊蟶消化腺中GPX受溫度影響被大量激活。外套膜和鰓中GPX活性隨著脅迫溫度的持續(xù)升高均呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，在32 ℃時(shí)達(dá)到峰值，分別為93.13、119.52 U/mg，當(dāng)脅迫溫度為35 ℃時(shí)，鰓中GPX活性則在35 ℃組達(dá)到峰值，為172.36 U/mg, 較25 ℃上升了17.1%，并相較其他溫度組均有顯著性差異(P<0.05)，這表明消化腺中GPX活性與溫度變化呈正相關(guān)，與CAT活性持續(xù)下降的趨勢(shì)不一致。

圖5 急性溫度脅迫對(duì)縊蟶不同組織GPX活性的影響Fig.5 Effects of acute temperature stress on GPX activity in different tissues of Sinonovacula constricta

2.6 急性溫度脅迫對(duì)縊蟶不同組織GSH含量的影響

GSH是一種重要的非酶類抗氧化劑，能清除機(jī)體內(nèi)的活性氧，保護(hù)細(xì)胞不被氧化[12]。如圖6所示，縊蟶3個(gè)組織中GSH含量在高溫脅迫條件下差異顯著(P<0.05)，其中消化腺中最高，鰓中次之，外套膜中最低，這與SOD等抗氧化酶的活性變化趨勢(shì)相一致。不同溫度的脅迫對(duì)縊蟶各組織GSH含量的影響也各不相同，鰓和消化腺中GSH含量均在28 ℃熱水應(yīng)激下達(dá)到最大值，分別為31.53、38.25 mg/g，其中28 ℃消化腺中GSH含量與30 ℃脅迫差異顯著(P<0.05)；在35 ℃時(shí)，鰓和消化腺中GSH含量均出現(xiàn)明顯回落，并與其他脅迫溫度有顯著性差異(P<0.05)。外套膜中GSH含量則始終處于較低水平，可見外套膜細(xì)胞缺少足夠的GSH進(jìn)行保護(hù)，溫度升高產(chǎn)生的氧化損傷較鰓和消化腺嚴(yán)重。

圖6 急性溫度脅迫對(duì)縊蟶不同組織GSH含量的影響Fig.6 Effects of acute temperature stress on GSH content in different tissues of Sinonovacula constricta

2.7 急性溫度脅迫對(duì)縊蟶不同組織T-AOC的影響

T-AOC體現(xiàn)了機(jī)體防御體系抗氧化能力的整體水平[13]，其變化趨勢(shì)如圖7所示。隨著脅迫溫度的升高，縊蟶3個(gè)組織中T-AOC均先升高后降低，且在28 ℃ 時(shí)T-AOC達(dá)到峰值，分別為5.21、8.42、10.52 U/mg。當(dāng)溫度繼續(xù)升高時(shí)，T-AOC出現(xiàn)了明顯的回落，其中30、32以及35 ℃的T-AOC較28 ℃顯著下降(P<0.05)，尤其在35 ℃時(shí)，外套膜、鰓和消化腺的T-AOC相較于峰值分別降低了35.6%、29.1%和25.2%，與SOD活性的變化趨勢(shì)一致。在同一溫度下，各組織中T-AOC存在顯著性差異(P<0.05)，消化腺中最高，鰓中次之，外套膜中最低，這與SOD、CAT、GPX這些抗氧化酶相一致，可見縊蟶機(jī)體抗氧化防御能力與SOD等抗氧化酶活性高低緊密相關(guān)，也表明了縊蟶消化腺的總抗氧化防御能力高于鰓和外套膜。

圖7 急性溫度脅迫對(duì)縊蟶不同組織T-AOC的影響Fig.7 Effects of acute temperature stress on T-AOC in different tissues of Sinonovacula constricta

3 討論

逆境條件下機(jī)體產(chǎn)生的氧自由基會(huì)攻擊生物膜中多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids，PUFA)，通過脂質(zhì)過氧化作用，生成大量脂質(zhì)氫過氧化物(lipid hydroperoxide，LOOH)[14]，使縊蟶顏色、香味和質(zhì)地發(fā)生改變。與此同時(shí)，脂質(zhì)過氧化反應(yīng)還會(huì)形成MDA等有毒物質(zhì)，導(dǎo)致縊蟶肌肉進(jìn)一步發(fā)生有害變化。MDA作為氧化終產(chǎn)物之一，通過其含量高低可以判斷機(jī)體受到自由基損傷的程度以及肉質(zhì)是否出現(xiàn)異味或酸敗現(xiàn)象[15]。本研究中，各組織中MDA含量隨著脅迫溫度的升高大幅上升，可見高溫顯著影響了縊蟶活性氧代謝，洪美玲等[16]研究了中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis) 20～32 ℃的升溫脅迫過程，同樣發(fā)現(xiàn)脅迫6 h后其MDA含量顯著上升。此外，在較高溫度的脅迫條件下，外套膜中MDA含量顯著高于鰓和消化腺，表明縊蟶外套膜對(duì)升溫有著極高的敏感性，細(xì)胞膜受損程度嚴(yán)重，而在鰓和消化腺中MDA含量得到有效抑制。H2O2是一種氧化性很強(qiáng)的物質(zhì)，在機(jī)體活性氧代謝中會(huì)穿透細(xì)胞膜，與細(xì)胞內(nèi)一些金屬離子發(fā)生反應(yīng)生成具有極強(qiáng)細(xì)胞毒性的羥自由基(·OH)，因此H2O2含量也代表了機(jī)體活性氧水平[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，溫度脅迫產(chǎn)生的活性氧打破了原有氧化還原循環(huán)的平衡，鰓中H2O2含量顯著低于外套膜和消化腺，推測(cè)升溫導(dǎo)致耗氧量的大幅上升，而相較于外套膜和消化腺，鰓作為呼吸器官能進(jìn)行氧交換，從而補(bǔ)充更多O2維持正常代謝，使得H2O2處在較低水平[18-19]。

T-AOC是衡量機(jī)體抗氧化能力的綜合指標(biāo)[13]。本研究中，各組織T-AOC先升高后降低，與SOD活性的變化趨勢(shì)有一致性，可見在縊蟶抗氧化防御體系中，酶促體系起到了主導(dǎo)作用，升溫誘導(dǎo)抗氧化酶水平的升高，SOD在響應(yīng)氧化應(yīng)激與清除過量中起重要作用；且在閾值溫度左右，T-AOC達(dá)到最大值，表明在該溫度臨界區(qū)間附近，適宜的升溫提高了抗氧化酶的表達(dá)以及誘導(dǎo)釋放更多的低分子清除劑，如GSH[12]。而外套膜中T-AOC始終處于較低水平，說明外套膜組織在升溫后仍處于應(yīng)激狀態(tài)，大量活性氧未得到及時(shí)清除，需要更長的時(shí)間恢復(fù)原有的代謝平衡。

縊蟶的外套膜能夠分泌形成貝殼，同時(shí)包裹著內(nèi)臟團(tuán)，在防護(hù)免疫過程中發(fā)揮著作用[23]。鰓是其重要的呼吸器官，能與外界環(huán)境直接作氣體交換，同時(shí)也是負(fù)責(zé)一些酶的生物轉(zhuǎn)化過程的組織器官[24]。雙殼貝類的消化腺主要為肝胰腺，是體內(nèi)的消化器官[25]。本研究中，縊蟶外套膜中主要抗氧化酶活性在響應(yīng)高溫脅迫帶來的氧化應(yīng)激時(shí)受到了不同程度的抑制，可能由于外套膜同樣也是作為縊蟶抵擋外界有害物質(zhì)入侵機(jī)體的第一道防線，組織中抗氧化系統(tǒng)受損較為嚴(yán)重；鰓組織在應(yīng)對(duì)高溫脅迫時(shí)能及時(shí)補(bǔ)充O2從而顯著抑制H2O2的積累；消化腺組織在活性氧代謝過程中，氧化應(yīng)激促進(jìn)了抗氧化酶的合成，誘導(dǎo)抗氧化酶活性的升高，有效地減輕了脂質(zhì)過氧化反應(yīng)帶來的生物膜損傷。

4 結(jié)論

在25～35 ℃溫度脅迫下，相比外套膜和鰓，縊蟶消化腺維持著最高的SOD、T-AOC活性以及GSH含量，且隨溫度升高而先升高后降低，在28 ℃達(dá)到最高值。此外，縊蟶CAT活性持續(xù)下降并于35 ℃時(shí)達(dá)到最低值，而GPX活性則呈現(xiàn)出不斷升高的趨勢(shì)。縊蟶3個(gè)組織中MDA含量均受脅迫溫度的升高而升高，但在同一脅迫溫度下，消化腺中的MDA積累最少。綜合對(duì)比3個(gè)組織，消化腺維持著顯著最高的SOD、CAT、GPX、T-AOC活性和GSH含量以及顯著最低的MDA含量，這表明縊蟶消化腺較外套膜和鰓在應(yīng)對(duì)外界升溫脅迫時(shí)能更好地引起抗氧化酶的大量表達(dá)以及激活非酶促體系，有效地減輕了縊蟶在不利溫度脅迫條件下的氧化損傷。因此，消化腺是縊蟶活性氧代謝的主要場(chǎng)所，同時(shí)也是較能代表縊蟶機(jī)體抗氧化防御變化的組織。