殼聚糖改性對蒙脫石吸附茶飲料中咖啡堿的影響

王根女，徐春明，周城，楊嘉偉，張鑫，常旋

(恒楓食品科技有限公司，浙江 杭州，311200)

隨著我國居民生活水平的提高，消費觀念轉(zhuǎn)變，消費者對飲料的健康屬性也愈發(fā)關(guān)注。各式茶飲料是近年來增長最為迅速的品類之一，其富含茶多酚、氨基酸、維生素等有益成分，具有抗氧化、防輻射、抗癌、抗衰老等功能[1-2]。另一方面，茶飲料中富含咖啡堿，適量的攝入咖啡因能提高中樞神經(jīng)興奮[3]，有效緩解疲勞[4]，但是有醫(yī)學(xué)研究表明，長期攝入咖啡堿對心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)造成損傷，對兒童、孕婦的損害作用尤為顯著[5]。鑒于現(xiàn)代年輕人群對健康生活理念的追求，若能有效除去茶飲料中的咖啡堿，且盡可能減少茶多酚等有益成分的損失，這種飲料將適應(yīng)更多的人群，擁有更廣闊的市場前景[6]。

除去茶葉中咖啡堿的方法有很多種，包括超臨界萃取法[7]、吸附法[8]、水溶液洗脫法[9]、有機溶劑萃取法等[10]。綜合考慮安全性和工藝便捷性，吸附法是目前最經(jīng)濟(jì)高效的方法，吸附材料主要包括離子交換樹脂、活性炭、蒙脫石等。蒙脫石具有高效的咖啡堿選擇性吸附能力，但是吸附過程會使茶湯色澤變暗，影響茶飲料品質(zhì)。殼聚糖是天然甲殼素脫除部分乙酰基的產(chǎn)物，具有出色的抗菌性[11]、金屬離子螯合能力[12]，被作為潛在的功能性材料，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥生物[13]、食品添加劑[14]、農(nóng)業(yè)[15]等領(lǐng)域。

本研究在前期蒙脫石吸附咖啡堿機理研究的基礎(chǔ)上[8]，利用殼聚糖對蒙脫石進(jìn)行改性處理，研究蒙脫石負(fù)載殼聚糖后脫咖啡堿處理對茶湯品質(zhì)的影響，彌補單一蒙脫石吸附工藝的不足，以期為開發(fā)優(yōu)質(zhì)脫咖啡堿茶飲料提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠茶、紅茶、烏龍茶，浙江茶乾坤食品股份有限公司；蒙脫石，石家莊飛吉礦產(chǎn)品有限公司；殼聚糖(脫乙酰度>85%)，浙江金殼藥業(yè)有限公司；維生素C，帝斯曼(中國)有限公司；咖啡堿、鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液，國藥集團(tuán)；乙腈、冰乙酸、甲醇，均為市售色譜純；沒食子酸、碳酸鈉、福林酚、硝酸等，均為市售化學(xué)純。

1.2 儀器與設(shè)備

磁力攪拌器，德國IKA儀器有限公司；Agilent 1260型HPLC高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；UV1800型紫外分光光度計，日本島津儀器有限公司；XS403S型電子分析天平，梅特勒-托力多儀器有限公司；PHS-3C型pH計，上海雷磁儀器有限公司；ST16型高速離心機，賽默飛世爾科技有限公司；Sigma 300型掃描電鏡，卡爾蔡司股份有限公司；X′Pert3 Powder X射線衍射儀，馬爾文帕納科公司；UltraScan PRO色差儀，美國Hunterlab公司；AFS-930原子熒光光度計，北京吉天儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 殼聚糖改性蒙脫石的制備

殼聚糖改性蒙脫石的制備參考胡超等[16]的方法。將1 g殼聚糖溶解到1 L 1%(體積分?jǐn)?shù))HCl中，用0.1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)殼聚糖溶液pH到5.0。室溫攪拌下，稱取一定量的蒙脫石，以m(蒙脫石)∶m(殼聚糖)分別為1∶0.005(B1)、1∶0.01(B2)、1∶0.02(B3)、1∶0.04(B4)的比例添加到殼聚糖溶液中，持續(xù)攪拌12 h，分散液在9 000 r/min離心30 min。棄去上清液，50 ℃減壓烘干至恒重，磨細(xì)備用。

將制備好的改性蒙脫石分別投入綠茶提取液，添加量為茶提取液質(zhì)量的2%，通過測定咖啡堿的脫除率、茶多酚保留率以及溶液中鐵元素的含量確定蒙脫石與殼聚糖復(fù)合的最佳質(zhì)量比。

1.3.2 茶提取液制備

取50 g茶葉，0.15 g維生素C，投入到1 500 g純凈水中，80 ℃攪拌提取15 min后經(jīng)冷卻，過濾，調(diào)配制得茶提取液，按相同方法分別制備紅茶、綠茶、烏龍茶茶提取液。

1.3.3 殼聚糖改性蒙脫石在茶飲料中的應(yīng)用

各取1.3.2中的100 g茶提取液，分別投入2 g蒙脫石或殼聚糖改性蒙脫石，25 ℃水浴攪拌10 min，8 000 r/min離心6 min，取上清液分析茶多酚、咖啡堿、鐵元素含量以及色差，另取部分上清液稀釋配制成純茶飲料，進(jìn)行感官分析。

1.4 檢驗分析方法

1.4.1 掃描電鏡(scanning electron microscope，SEM)分析

分別取適量蒙脫石、殼聚糖改性蒙脫石樣品，經(jīng)噴金預(yù)處理后在Sigma 300型掃描電鏡下觀察樣品的微觀表面形態(tài)，并拍攝照片[17]。

1.4.2 X射線衍射分析

分別取適量蒙脫石、殼聚糖改性蒙脫石樣品，用X'Pert3 Powder X射線衍射儀對改性前后的蒙脫石進(jìn)行X射線衍射(X-ray diffraction, XRD)分析，分析其晶體結(jié)構(gòu)[18]。工作參數(shù)：掃描電壓40 kV，掃描電流40 mA，掃描速度2°/min，測試范圍5°～60°。

1.4.3 茶多酚的測定

茶提取液中茶多酚含量的測定參考GB/T 8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》。以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別取純水和測試液各1 mL于25 mL容量瓶中，每個容量瓶內(nèi)加入5.0 mL福林酚試劑，搖勻，反應(yīng)5 min，加入4.0 mL 7.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))Na2CO3溶液，加水定容至刻度，搖勻靜置60 min。用1 cm比色皿在765 nm下測定吸光度(A、A0)。

1.4.4 咖啡堿的測定

茶提取液中咖啡堿的測定方法參考GB/T 8312—2013《茶 咖啡堿測定》中高效液相色譜法。以咖啡堿的質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

HPLC測定條件：紫外檢測器；SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：V(水)∶V(甲醇)=7∶3；流速1 mL/min；進(jìn)樣量20 μL；檢測波長280 nm；柱溫40 ℃。

1.4.5 鐵元素的測定

茶提取液中鐵元素的測定參考GB 5009.90—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中鐵的測定》中的火焰原子吸收光譜法。

1.4.6 感官評定

感官評定小組由10位經(jīng)過培訓(xùn)的專業(yè)研究人員組成，以整體喜好度對茶飲料進(jìn)行打分[19]。“0～3”分表示差，難以接受；“4～7”分表示合格，可以接受；“8～10”分表示優(yōu)秀，非常喜歡。

1.4.7 色差分析

取適量樣品，用UltraScan PRO色差儀分析色差[20]。色差計算如公式(1)所示：

(1)

式中：ΔE表示色差綜合評定指標(biāo)，值越小表示顏色越接近；ΔL為正表示樣品偏亮，為負(fù)表示樣品偏暗；Δa為正表示樣品偏紅，為負(fù)值表示樣品偏綠；Δb為正值，表示樣品偏黃，為負(fù)值表示樣品偏藍(lán)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

每個樣品設(shè)3組平行，采用Oringin 9.0和SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行ANOVA方差分析，并以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 殼聚糖和蒙脫石質(zhì)量比的確定

通過考察殼聚糖和蒙脫石復(fù)合的質(zhì)量比對茶湯中咖啡堿脫除率的影響，以及處理后溶液中鐵元素的含量，來確定殼聚糖和蒙脫石復(fù)合的最佳質(zhì)量比，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，負(fù)載了殼聚糖的蒙脫石對咖啡堿的吸附效率降低，并且隨著殼聚糖負(fù)載量的增加，吸附效率降低越明顯。由表1可知，蒙脫石處理后茶飲料中鐵離子含量明顯增高，負(fù)載殼聚糖的蒙脫石處理后，溶液中鐵離子濃度明顯降低，當(dāng)殼聚糖負(fù)載量≥1%(B2組)，蒙脫石層間鐵離子無法通過離子交換進(jìn)入溶液中。前期的研究表明，蒙脫石對咖啡堿的吸附過程受化學(xué)吸附控制，包括外部膜擴散、表面吸附、顆粒內(nèi)部擴散多個過程，負(fù)載在表面的殼聚糖顆粒可能占據(jù)了部分吸附位點，導(dǎo)致吸附效率下降。另一方面，殼聚糖對金屬離子有明顯的螯合作用，負(fù)載在蒙脫石表面的殼聚糖也可能導(dǎo)致孔道堵塞[21]，有效抑制蒙脫石插層中Fe3+、Fe2+等金屬離子的溶出和交換能力，避免引起茶飲料的顏色劣變。

表1 殼聚糖負(fù)載量對鐵離子溶出率的影響Table 1 The effect of chitosan loading on the dissolution rate of iron ions

圖1 殼聚糖負(fù)載量對咖啡堿去除率的影響Fig.1 The effect of chitosan loading on the removal rate of caffeine 注：不同字母表示具有顯著性差異(P<0.05)

2.2 SEM圖分析

本研究利用SEM分析蒙脫石和殼聚糖改性蒙脫石的形貌變化。由圖2可知，殼聚糖改性前后蒙脫石的表面結(jié)構(gòu)發(fā)生了很大的變化，蒙脫石表面結(jié)構(gòu)致密，殼聚糖改性后表面結(jié)構(gòu)變得疏松，表面顆粒明顯增多，形成剝離型結(jié)構(gòu)，表明殼聚糖附著在蒙脫石表面。

a-蒙脫石；b-殼聚糖改性蒙脫石圖2 蒙脫石和殼聚糖改性蒙脫石的SEM圖Fig.2 SEM images of montmorillonite and chitosan modified montmorillonite

2.3 XRD分析

圖3為蒙脫石改性前后的XRD圖，由圖3可知，經(jīng)殼聚糖改性后的蒙脫石的2θ角度基本不變，在2θ=5.99°有明顯尖銳的001峰，根據(jù)布拉格定律λ=2·d·sinθ(λ為入射波波長，d為平行原子平面的間距，θ為入射光與晶面之夾角)，說明蒙脫石的結(jié)晶骨架延c軸d(001)之間沒有擴大，即殼聚糖沒有插入蒙脫石的夾層中，只吸附在蒙脫石表面，形成復(fù)合吸附劑。這可能是因為殼聚糖的分子質(zhì)量太大，不易插入蒙脫石層間。另一方面，由于蒙脫石晶包層狀結(jié)構(gòu)中間存在諸多陽離子，例如Cu2+、Mg2+、Fe3+、Fe2+、Ni2+等，使層間產(chǎn)生較弱的負(fù)電荷，而殼聚糖分子含有較多的—NH2基團(tuán)，溶于酸性溶液后產(chǎn)生正電荷，兩者通過正負(fù)電荷的相互作用結(jié)合在一起，形成復(fù)合吸附劑。

a-蒙脫石；b-殼聚糖改性蒙脫石圖3 XRD圖Fig.3 XRD pattern

2.4 蒙脫石改性前后對茶飲料品質(zhì)的影響

表2顯示了蒙脫石和殼聚糖改性蒙脫石在不同茶飲料中的應(yīng)用結(jié)果。與蒙脫石相比，殼聚糖改性蒙脫石對咖啡堿的吸附效果基本不變，但對茶多酚的吸附效果加強，說明殼聚糖改性蒙脫石對咖啡堿和茶多酚的選擇性吸附性能下降。可能是因為殼聚糖吸附在蒙脫石表面，引起表面電荷或者結(jié)構(gòu)的變化，對咖啡堿的特異吸附點減少。感官評定顯示蒙脫石進(jìn)行脫咖啡堿處理的茶飲料得分較低，是因為蒙脫石的層間金屬陽離子通過離子交換溶入茶飲料中，導(dǎo)致色澤、口感發(fā)生改變[22]。當(dāng)蒙脫石負(fù)載殼聚糖后，由于殼聚糖對金屬離子的絡(luò)合作用，減少了離子交換，茶飲料口感得到明顯改善，整體與原樣更接近。

表2 殼聚糖改性蒙脫石對茶飲料品質(zhì)的影響Table 2 Effect of chitosan modified montmorillonite on the quality of tea beverage

經(jīng)脫咖啡堿處理后茶飲料的色差分析結(jié)果如表3所示，蒙脫石處理樣品ΔL均為負(fù)值，表明茶飲料顏色明顯偏暗，這是由于蒙脫石夾層中的鐵離子溶出引起的[8]，有研究表明，0.01%的鐵離子就能使綠茶茶湯明顯變暗[23]。負(fù)載殼聚糖后抑制了鐵離子溶出，B組的茶飲料ΔL均為正值，并且B組的整體色差ΔE值均小于A組，說明相同條件下，殼聚糖改性蒙脫石作為吸附劑用于茶飲料脫咖啡堿處理對茶飲料原有色澤影響更小，能更有效地保持茶飲料的品質(zhì)。

表3 脫咖處理后茶飲料的色差分析Table 3 Analysis of the color difference of tea beverages after coffee removal

3 結(jié)論

本實驗通過將殼聚糖吸附在蒙脫石表面制備復(fù)合吸附劑，用于選擇性去除茶飲料中的咖啡堿，制備高品質(zhì)脫咖啡堿茶飲料。結(jié)果表明，以質(zhì)量比1∶0.01負(fù)載殼聚糖的蒙脫石，對茶飲料中的咖啡堿脫除率與改性前相似，但是茶多酚的保留率略有下降，可見負(fù)載殼聚糖后，蒙脫石對咖啡堿的選擇性吸附性能下降。此外，之前的研究表明在蒙脫石吸附咖啡堿的過程中，層間陽離子會通過離子交換溶入到茶飲料體系中，引起風(fēng)味色澤變化。而經(jīng)殼聚糖改性后能有效遏制層間鐵離子溶出，鐵離子不僅能引起茶湯褐變，同時也是自動氧化的催化劑，遏制鐵離子的溶出，能有效提高茶飲料的感官品質(zhì)。本文在蒙脫石吸附咖啡堿的研究基礎(chǔ)上，對吸附劑材料進(jìn)行了優(yōu)化，為工業(yè)生產(chǎn)風(fēng)味更佳的脫咖啡堿茶飲料提供試驗依據(jù)。