雙酶偶聯法測定發酵液中L-高絲氨酸的含量

趙金花，魏亮，徐寧，馬振平，劉君*

1(天津科技大學 生物工程學院，天津，300457)2(中國科學院天津工業生物技術研究所，天津，300308)

L-高絲氨酸是一種重要的非蛋白質氨基酸，是合成蘇氨酸和甲硫氨酸等多種天冬氨酸家族氨基酸的重要前體物質，具有重要的生理功能，在食品、飼料、化工和醫藥領域具有廣泛的應用[1-2]。研究表明，L-高絲氨酸可以誘導植物免疫反應，增加植物對疾病的抵抗力[3]。在雛雞日糧中添加L-高絲氨酸，可以替代蘇氨酸改善幼雛的生長性能。作為一種重要的醫藥中間體，L-高絲氨酸可合成具有抗癌活性物質生物堿和神經酰胺等藥物，而且還可用于合成低毒性除草劑L-草銨膦[4]。此外，L-高絲氨酸也是一種重要的C4平臺化學品，可用于γ-丁內酯、丙烯酸和1,3-丙二醇等多種大宗化學品的合成[5-7]。近年來，隨著對L-高絲氨酸研究的不斷深入和下游產品的持續開發，L-高絲氨酸需求量迅速增大，市場規模持續提升。

微生物發酵法具有環境友好、周期短、過程容易控制等優勢，被廣泛應用于氨基酸和有機酸等化合物的工業生產[8-10]。近年來，利用微生物發酵法生產L-高絲氨酸越來越受到關注[11-15]。發酵法生產L-高絲氨酸的關鍵是菌種選育，需要對菌株進行不斷地測試和改造，以獲得最優的生產菌株。在此過程中存在大量的L-高絲氨酸分析檢測工作，然而目前L-高絲氨酸的檢測方法非常有限。常用的檢測方法主要是HPLC，此法雖然靈敏度、準確度高，但對儀器精密度和設備要求較高，且需要鄰苯二甲醛(O-phthalaldehyde, OPA)、2,4-二硝基氟苯(2,4-dinitrofluorobenzene, DNFB)等柱前衍生[11,15]，步驟繁瑣，檢測時間長，對于樣品多、工作量大的L-高絲氨酸生產菌的高通量篩選并不適用。因此，本研究建立了一種基于雙酶偶聯的L-高絲氨酸快速檢測方法。該方法將L-高絲氨酸濃度與NADH濃度關聯，具有結果準確、操作簡便、特異性強、檢測速度快、能同時檢測大批量樣本等優點，可用于發酵液中L-高絲氨酸含量的測定和L-高絲氨酸高產菌株的高通量篩選工作。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株和質粒

大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α、BL21(DE3)由中國科學院天津工業生物技術研究所保藏。大腸桿菌表達質粒pET21b由本實驗室保藏。

1.1.2 試劑

甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、纈氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、色氨酸(Trp)、絲氨酸(Ser)、酪氨酸(Tyr)、半胱氨酸(Cys)、蛋氨酸(Met)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、蘇氨酸(Thr)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、賴氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)和組氨酸(His)，北京索萊寶生物科技有限公司；L-高絲氨酸、L-亮氨酸脫氫酶、L-乳酸脫氫酶，上海源葉生物試劑有限公司；NADH，碧云天試劑公司；限制性內切酶NdeI、XhoI、T4 DNA連接酶、蛋白Marker、Phusion DNA聚合酶，Thermo Fisher公司；質粒提取試劑盒和膠回收試劑盒，天根生物公司；氨芐青霉素(ampicillin, Amp)、磷酸吡哆醛(pyridoxal phosphate, PLP)、異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl -β-D- thiopyrangalactoside, IPTG)、咪唑，索萊寶生物科技有限公司；其他試劑如Na2HPO4、NaH2PO4、NaCl等均為國產分析純。

1.1.3 培養基

LB培養基(g/L)：酵母粉5.0，胰蛋白胨10.0，NaCl 10.0，氨芐青霉素0.1。固體培養基加20 g/L的瓊脂粉。

1.2 儀器與設備

Synergy NEO2多功能酶標儀，美國Biotek儀器有限公司；搖床，美國精騏有限公司；Scientz-ⅡD超聲破碎儀，寧波新芝公司；高速冷凍離心機，德國Eppendoff股份公司；Agilent 1260高效液相色譜儀，美國Agilent公司。

氨基酸含量測定方法：色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse AAA色譜柱(4.6 mm × 150 mm，5 μm)；檢測器：紫外檢測器，檢測波長280 nm；流動相：A：40 mmol/L磷酸二氫鈉溶液(pH=7.8)，B：V(乙腈)∶V(甲醇)∶V(水)=45∶45∶10。流速2.0 mL/min；檢測波長338 nm；柱溫40 ℃。自動衍生化進樣程序：吸取0.4 mol/L硼酸緩沖液(pH=10)2.5 μL，吸取待測樣品0.5 μL，自動混合2次，等待0.5 min；吸取OPA衍生溶液0.5 μL，自動混合2次；吸取水32 μL，自動混合2次，進樣。自動梯度洗脫程序：0～1.9 min，100%流動相A；1.9～18.1 min，43%流動相A，57%流動相B；18.1～18.6 min，100%流動相B；18.6～22.3 min，100%流動相B；22.3～26 min，100%流動相A。有機酸含量檢測方法：色譜柱采用Bio-Rad Aminex HPX-87H Column；流動相為5 mmol/L的硫酸溶液；流速0.6 mL/min；柱溫40 ℃。

1.3 實驗方法

1.3.1 重組菌E.coliBL21(pET21b-cgl)的構建

采用Phusion DNA聚合酶，以合成的cgl基因為模板，通過PCR方法獲得基因片段。然后用NdeI和XhoI雙酶切cgl基因片段和質粒pET21b，連接酶切后的片段，轉化到E.coliDH5α感受態中，涂布于含100 μg/mL Amp的LB平板上，提取質粒測序，測序正確后將重組質粒轉化到E.coliBL21感受態細胞中，獲得重組菌E.coliBL21(pET21b-cgl)。

1.3.2 胱硫醚γ-裂解酶誘導表達和純化

將過夜培養的重組菌E.coliBL21(pET21b-cgl)按照1%接種量接種含有100 μg/mL Amp的LB液體培養基中，37 ℃、200 r/min培養至菌液OD600值為0.6，加入終濃度為0.4 mmol/L的IPTG，16 ℃、200 r/min誘導培養20 h。4 ℃、6 000 r/min離心收集菌體，加入適量裂解緩沖液(20 mmol/L Na2HPO4，200 mmol/L NaCl，pH 7.5)重懸，冰水浴超聲破碎處理20 min，隨后在4 ℃、6 000 r/min條件下離心10 min，收集上清液即為粗酶液。采用鎳柱親和層析的方法對含有His標簽的胱硫醚γ-裂解酶進行純化，用保存緩沖液[20 mmol/L Na2HPO4溶液，5%(體積分數)甘油，pH 7.5]進行超濾，除去咪唑，分裝保存于-80 ℃冰箱中。用SDS-PAGE方法檢測粗酶液和純化的胱硫醚γ-裂解酶，并用Bradford方法測定蛋白質含量。

1.3.3 胱硫醚γ-裂解酶催化L-高絲氨酸反應產物的確定

胱硫醚γ-裂解酶催化L-高絲氨酸的反應產物通過HPLC測定。反應體系為100 mmol/L Na2HPO4緩沖液(pH 7.5)，10 mmol/LL-高絲氨酸，0.1 mmol/L PLP，并加入50 μg酶液，反應體積為1 mL，37 ℃反應30 min后，加鹽酸終止反應，經0.22 μm濾膜過濾，用于HPLC分析。

1.3.4 α-酮酸還原酶的確定

為了確定合適的α-酮酸還原酶，分別在反應體系中加入乳酸脫氫酶和亮氨酸脫氫酶，測定NADH的消耗量。反應體系為0.1 g/LL-高絲氨酸，100 mmol/L Na2HPO4緩沖液(pH 7.5)，0.5 mmol/L NADH，0.1 mmol/L PLP，10 μg胱硫醚γ-裂解酶，反應體積為200 μL。同時向體系中分別添加50 U/mL的乳酸脫氫酶和亮氨酸脫氫酶，在37 ℃測量340 nm處吸光度的變化值。

1.3.5 胱硫醚γ-裂解酶催化底物特異性的測定

將常見的20種氨基酸配制成質量濃度為10.0 g/L，添加到反應液中，反應體系為100 mmol/L Na2HPO4緩沖液(pH 7.5)，0.5 mmol/L NADH，0.1 mmol/L PLP，10 μg胱硫醚γ-裂解酶，氨基酸終質量濃度為0.5 g/L，反應體積為200 μL，檢測10 min 內340 nm處的吸光度的變化，以反應體系中去離子水取代氨基酸為對照。

1.3.6 胱硫醚γ-裂解酶酶學性質的測定

胱硫醚γ-裂解酶的活性是通過偶聯乳酸脫氫酶來測定的。反應體系為100 mmol/L Na2HPO4緩沖液(pH 7.5)，4 mmol/LL-高絲氨酸，0.5 mmol/L NADH，0.1 mmol/L PLP，10 μg胱硫醚γ-裂解酶，50 U/mL乳酸脫氫酶，反應體積為200 μL。在此條件下，分別測定胱硫醚γ-裂解酶的最適溫度，最適pH和動力學常數。酶活力單位定義:在40 ℃、pH 7.5條件下，1 min催化消耗1 nmol NADH的酶量為1個酶活力單位(1 U)。

1.3.7 胱硫醚γ-裂解酶檢測L-高絲氨酸反應條件的確定

在1.3.6中反應體系的基礎上，對反應體系中胱硫醚γ-裂解酶的濃度、乳酸脫氫酶的濃度、輔因子NADH的濃度和輔酶PLP的濃度進行優化，測定340 nm處吸光度的減少，以確定最佳的反應體系。

1.3.8 標準曲線制定

準確配制10.0 g/LL-高絲氨酸樣品，加入到反應體系中，使L-高絲氨酸終質量濃度分別為0.005、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1 g/L。根據1.3.6測定方法，在1.3.7確定的最適條件下，以不加L-高絲氨酸的反應體系為空白對照，在340 nm處測定其吸光度，以L-高絲氨酸濃度為橫坐標，以吸光度變化值為縱坐標，繪制回歸曲線。

1.3.9 加標回收實驗

取L-高絲氨酸發酵液，加入不同濃度L-高絲氨酸標準液混勻，以發酵培養基為空白對照，分別檢測對照樣本及回收樣本，平行檢測3次。

2 結果與分析

2.1 胱硫醚γ-裂解酶的表達及純化

2.1.1 胱硫醚γ-裂解酶重組質粒的構建

胱硫醚γ-裂解酶(cystathionine γ-lyase，EC4.4.1.1)，是一種磷酸吡哆醛依賴酶，能催化胱硫醚γ位裂解，脫去NH3后生成α-酮酸。本研究從BRENDA數據庫中選擇具有較高活性的來源于家鼠(Rattusnorvegicus)的胱硫醚γ-裂解酶(RnCGL)，該酶由cgl基因(NCBI-GeneID：24962)編碼，含有398個氨基酸。將上述基因按照大腸桿菌密碼子偏好性進行密碼子優化，由金斯瑞生物科技公司合成。將目的基因連接至pET21b表達載體上，并且在C末端加上組氨酸標簽用于后期表達純化。利用通用引物T7和T7 Ter對重組質粒進行檢測驗證。如圖1所示，經核酸電泳檢測，PCR產物條帶大小位于1 000～2 000 bp，與預期結果相符。隨后將重組質粒利用限制性內切酶NdeI和XhoI雙酶切驗證，電泳圖譜上可見有5 500 bp左右的質粒骨架條帶和1 200 bp左右的基因片段條帶，說明重組質粒pET21b-cgl構建正確。

泳道1-PCR驗證；泳道2-雙酶切驗證；M-DNA ladder Marker圖1 質粒PCR和酶切驗證Fig.1 Verification of plasmid by PCR and restriction enzyme digestion

2.1.2 RnCGL的誘導表達及純化

將含有表達質粒pET21b-cgl的重組菌株E.coliBL21(DE3)在37 ℃下培養至OD600值為0.6左右，加入終濃度為0.4 mmol/L IPTG于16 ℃誘導約20 h，離心收集菌體，超聲破碎，采用鎳柱親和層析方法純化胱硫醚γ-裂解酶，并對粗酶液和純酶進行SDS-PAGE分析。結果如圖2所示，純化后RnCGL蛋白條帶單一，蛋白分子質量約為40 kDa，與預測結果一致，說明該蛋白在E.coliBL21中成功表達。

泳道1-破碎上清液；泳道2-破碎沉淀；泳道3-穿柱液； 泳道4-洗雜液；泳道5-100 mmol/L咪唑洗脫液；泳道6-200 mmol/L 咪唑洗脫液；泳道7-300 mmol/L咪唑洗脫液；泳道8-400 mmol/L 咪唑洗脫液；泳道9-500 mmol/L咪唑洗脫液；M-protein ladder Marker圖2 SDS-PAGE檢測分析RnCGLFig.2 SDS-PAGE analysis of RnCGL

2.2 雙酶偶聯法測定L-高絲氨酸方法的建立

2.2.1 雙酶偶聯法測定L-高絲氨酸含量的原理

L-高絲氨酸在胱硫醚γ-裂解酶(RnCGL)催化下脫去氨基生成α-酮酸，α-酮酸在脫氫酶的催化作用下，與NADH偶聯發生還原反應生成醇酸。NADH在340 nm吸光度處有吸光度，其下降速率與L-高絲氨酸濃度呈正比。反應方程式(1)如下：

(1)

2.2.2 RnCGL催化L-高絲氨酸反應產物的確定

研究表明，RnCGL催化L-高絲氨酸發生γ消除反應，生成的產物為α-丁酮酸和氨[反應方程式(1)]。本研究利用HPLC方法檢測確定RnCGL催化L-高絲氨酸的反應產物，結果如圖3所示，反應體系中產物相對單一，一個為高絲氨酸底物峰，另一個為α-丁酮酸產物峰，且產物峰與標準品α-丁酮酸出峰時間完全一致，說明RnCGL能夠催化L-高絲氨酸裂解生成α-丁酮酸，與文獻報道結果相符[16]。

2.2.3 α-丁酮酸與NADH偶聯反應的建立

亮氨酸脫氫酶(leucine dehydrogenase，EC1.4.1.9)和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，EC1.1.1.27)是依賴NAD(H)的氧化還原酶，可選擇性催化多種脂肪族2-氧代酸或α-酮酸還原為相應的α-氨基酸及其衍生物。因此，本研究首先嘗試利用亮氨酸脫氫酶催化α-丁酮酸的反應偶聯NADH。但實驗結果并沒有檢測到在340 nm(NADH氧化)下吸光度的下降。說明在該體系中亮氨酸脫氫酶不能有效發揮作用，可能原因是亮氨酸脫氫酶還原過程中不僅需要NADH，還需要銨根離子，盡管該體系中L-高絲氨酸裂解可生產部分銨根離子，但是濃度很低，從而影響酶活性。接下來，嘗試利用乳酸脫氫酶催化該反應。結果如圖4所示，在340 nm處吸光度隨著時間的增加而下降，說明NADH發生反應生成NAD+。通過上述實驗，本研究將L-高絲氨酸濃度與NADH濃度變化相偶聯，建立了基于雙酶偶聯的L-高絲氨酸測定方法，即RnCGL將L-高絲氨酸裂解為α-丁酮酸，生成的α-丁酮酸在乳酸脫氫酶的催化下消耗NADH生成2-羥基丁酸。在反應過程中，NADH減少量與L-高絲氨酸濃度呈正比。

圖4 α-丁酮酸與NADH偶聯反應的建立Fig.4 The coupling relationship of α-ketobutyric acid and NADH

2.2.4 雙酶偶聯L-高絲氨酸檢測法特異性驗證

為了驗證基于雙酶偶聯的L-高絲氨酸測定方法的特異性，本研究分別以20種常用氨基酸為底物，在10 min內監測340 nm處吸光度的變化量，并以不加氨基酸底物的體系作為空白對照。如圖5-a所示，在10 min內L-高絲氨酸在340 nm處吸光度下降值為0.26，而其他氨基酸在該體系中340 nm處吸光度均無明顯變化。結果表明該方法能夠特異性地檢測L-高絲氨酸。此外，為確定該方法中L-高絲氨酸檢測是否受到其他氨基酸干擾，本研究配制含有等量L-高絲氨酸和20種氨基酸的混合液，并利用雙酶體系檢測方法對該混合液進行檢測，以等濃度的L-高絲氨酸標準液為對照。結果如圖5-b所示，混合液在340 nm處的吸光度下降值與對照組只有L-高絲氨酸標準液的減少量基本相當。結果說明，該方法具有良好的特異性和穩定性，不會受到其他氨基酸的干擾。

a-雙酶偶聯方法檢測20種氨基酸的吸光度下降值； b-氨基酸混合液對L-高絲氨酸檢測方法的影響圖5 雙酶偶聯L-高絲氨酸檢測法特異性的驗證Fig.5 Verification of the specificity of the double-enzyme coupling method for L-homoserine detection

2.3 RnCGL酶學性質測定

2.3.1 溫度對酶活性的影響

為進一步確定和優化基于雙酶體系的L-高絲氨酸測定方法，本研究對RnCGL的酶學性質進行測定，分別探究溫度和pH對其酶活性的影響。在pH 8.0的100 mmol/L Na2HPO4緩沖液中，分別測定RnCGL在25、30、35、37、40、45 ℃條件下酶活性。結果如圖6-a所示，重組酶RnCGL在25～45 ℃均有活性，在25～40 ℃，酶活性隨著溫度的升高逐漸提高，在40 ℃時酶活性達到最高為125 U/mg。由于雙酶偶聯檢測體系需要保證較高的RnCGL活性，因此確定40 ℃為該反應體系的最適溫度。

2.3.2 pH對酶活性的影響

在40 ℃最適溫度條件下，分別測定RnCGL在不同pH條件下的Na2HPO4緩沖體系中的酶活性，其中pH條件設定為6.0、7.0、7.5和8.0。結果如圖6-b所示，重組酶RnCGL在pH 6.0～8.0均有酶活性，在pH 6.0～7.5，CGL酶活性持續升高，在pH 7.5時酶活性達到最高為145 U/mg。但隨著pH繼續升高，酶活性反而降低。結果表明pH 7.5為RnCGL的最適pH。

2.3.3 動力學常數測定

在確定的RnCGL最適催化溫度和pH反應條件下(pH 7.5、40 ℃)，對RnCGL的動力學常數進行了測定。分別測定在L-高絲氨酸0～10 mmol/L濃度下的酶活性，并按照Lineweaver-Burk的方法利用雙倒數作圖求算RnCGL對底物L-高絲氨酸的Km和Vmax。結果如圖6-c和圖6-d所示，RnCGL在以L-高絲氨酸為底物時，動力學常數Km為6.76 mmol/L，最大反應速率Vmax為217.39 U/mg。

a-溫度對RnCGL酶活性的影響；b-pH對RnCGL酶活性的影響；c-RnCGL在不同L-高絲氨酸濃度下酶活性擬合； d-雙倒數分析RnCGL動力學常數圖6 RnCGL酶學性質測定Fig.6 Determination of the enzymatic properties of RnCGL

2.3.4 保存時間對RnCGL酶活性的影響

分別在純化的第1天、第10天、第20天、第30天取出保存于-80 ℃冰箱的RnCGL，測定其比酶活力，分別為27.87、31.30、28.30、33.87 U/mg。結果表明RnCGL在-80 ℃條件下保存30 d后，比酶活力無明顯變化，說明RnCGL具有良好的穩定性，無需每次重新表達純化，可現取現用。

2.4 單因素優化L-高絲氨酸檢測系統中各組分含量

2.4.1 RnCGL濃度優化

RnCGL的酶量直接影響反應速率，在一定底物濃度下，反應體系中酶應過量。向反應體系中加入2、6、10、12、13 U/mL的胱硫醚γ-裂解酶，結果如圖7-a所示，反應速率隨酶量的增加而變大，當酶量為12 U/mL時，反應速率達到最大，且再增加酶量，反應速率也不再增加，最終確定在L-高絲氨酸質量濃度為0.1 g/L時，RnCGL的濃度為12 U/mL。

2.4.2 乳酸脫氫酶濃度優化

偶聯的乳酸脫氫酶的濃度影響檢測方法的準確性，只有在偶聯的乳酸脫氫酶處于過量時，乳酸脫氫酶的濃度才不是限制因素。向反應體系中加入12.5、25、50、75、100、150 U/mL的乳酸脫氫酶，結果如圖7-b所示，當乳酸脫氫酶的量為50、75、100、150 U/mL時，反應速率達到最大，且基本不再變化。因此，選擇乳酸脫氫酶的濃度為50 U/mL。

2.4.3 NADH濃度優化

輔因子NADH的濃度直接影響反應速率和中間產物α-丁酮酸的生成。向反應體系中加入終濃度為0.25、0.5、1、1.5 mmol/L的NADH，結果如圖7-c所示，當NADH的濃度為0.25 mmol/L時，反應速率較慢，而當NADH的濃度為0.5、1、1.5 mmol/L時，反應速率達到最大，因此，選擇NADH的濃度為0.5 mmol/L。

2.4.4 PLP濃度優化

輔酶PLP也參與胱硫醚γ-裂解酶催化L-高絲氨酸的反應，輔酶的濃度也限制反應速率。當反應體系中PLP的濃度為0.1、0.2、0.3、0.4 mmol/L時，結果如圖7-d所示，隨著PLP濃度的增加，反應速率變化不大，說明0.1 mmol/L的PLP已經足夠催化反應，所以確定PLP的濃度為0.1 mmol/L。

a-RnCGL濃度對檢測體系效率的影響；b-LDH濃度對檢測體系效率的影響；c-NADH濃度對檢測體系效率的影響； d-PLP濃度對檢測體系效率的影響圖7 單因素優化雙酶偶聯L-高絲氨酸檢測體系中各組分的含量Fig.7 Single factor optimization of the component concentration in the enzyme-coupled L-homoserine detection system

2.5 標準曲線繪制

根據1.3.8的方法，在反應體系中分別加入終質量濃度為0.005～0.1 g/L的L-高絲氨酸，測定10 min內在340 nm處吸光度的下降值。結果表明，L-高絲氨酸終質量濃度在0.005～0.1 g/L，吸光度的減少值(ΔOD340值)和L-高絲氨酸濃度呈良好的線性關系。標準曲線的回歸方程為Y=3.72X+0.024，R2為0.998 2。標準曲線的R2接近于1，說明ΔOD值和L-高絲氨酸濃度的線性關系較為理想，檢測范圍為0.005～0.1 g/L，檢測靈敏度高，檢測范圍寬，適用于L-高絲氨酸濃度的檢測。

2.6 雙酶偶聯檢測方法的回收率測定

取L-高絲氨酸發酵液，在反應體系中分別加入終質量濃度為10、20、30 g/L的L-高絲氨酸標準液振蕩混勻，將混合液稀釋到標準曲線檢測范圍以內，利用雙酶偶聯檢測方法測定L-高絲氨酸的回收率。結果如表1所示，HPLC和酶法測定發酵液中L-高絲氨酸質量濃度分別為12.4、12.1 g/L，2種方法結果基本一致。通過加標實驗檢測，雙酶偶聯檢測方法平均回收率達到98.87%。結果表明，本方法能滿足發酵過程中L-高絲氨酸定量的要求。

表1 發酵液中L-高絲氨酸回收率測定Table 1 Determination of L-homoserine recovery in fermentation broth

3 結論

本方法利用胱硫醚γ-裂解酶和乳酸脫氫酶偶聯催化，將L-高絲氨酸濃度與NADH在340 nm處吸光度變化相關聯，建立了一種簡單快速、專一性強的L-高絲氨酸檢測技術。通過測定RnCGL的酶學性質和酶催化體系各組分濃度，最終確定該方法的測定溫度為40 ℃，pH 7.5，RnCGL為12 U/mL，乳酸脫氫酶為50 U/mL，NADH 0.5 mmol/L，PLP 0.1 mmol/L，測定范圍為0.005～0.1 g/L。本方法分析儀器簡單，試劑價格低廉，準確性高，能在較短時間內完成L-高絲氨酸含量的檢測，能夠適用于L-高絲氨酸菌株選育過程中大批量樣品的檢測工作。而且本方法可實現發酵液樣品的高通量檢測，為L-高絲氨酸高產菌種的高通量篩選和選育提供了重要技術保障。