α-葡萄糖苷酶的異源表達及應用研究進展

李林波，張士雙，楊天佑，王寶石，張明霞

(河南科技學院 生命科技學院，現代生物育種河南省協同創新中心，河南 新鄉，453003)

α-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.20)是一種外切碳水化合物酶，能催化α-D-葡萄糖基從不同大小的底物，包括麥芽低聚糖、α-糖苷和α-葡聚糖等非還原端水解糖苷鍵，釋放α-D-葡萄糖[1]，除水解作用外，α-葡萄糖苷酶還可通過轉糖基化作用[2-3]，將葡萄糖基從底物轉移至受體，形成相應的低聚糖、糖脂或糖肽等，在生產功能性低聚異麥芽糖(isomaltooligosaccharides,IMOs)和有生物功能的糖-共軛復合物方面顯示出巨大的應用潛力。

α-葡萄糖苷酶可由包括細菌、真菌、動物和植物在內的各種生物體產生[4]，這種廣泛的分布導致其底物特異性也因酶的來源而不同。根據底物特異性，α-葡萄糖苷酶傳統上分為3組，第1組可水解多種異質底物(主要來自細菌)，如蔗糖、芳香基-α-葡萄糖苷，而且比水解同質底物更有效，第2組在水解同質底物上更有效(主要來自真菌)，如麥芽糖、異麥芽糖等，第3組與2組活性相似，但對淀粉等長鏈底物也有高水解活性(大多來自植物)[5-6]。α-葡萄糖苷酶的主要微生物來源有曲霉、乳酸桿菌和芽孢桿菌，而黑曲霉α-葡萄糖苷酶具有較高的轉糖基化活性，且耐酸性強，容易避免細菌污染，因此被成功地應用于生產IMOs[2]，然而，在工業化應用過程中仍存在著熱穩定性差、底物特異性差、底物譜窄等問題，其應用受到了極大的限制，因此學者通過克隆不同生物來源的酶，并對其進行分子改造和異源表達等，以克服規模化生產中魯棒性差和產量不高的問題。

α-葡萄糖苷酶作為目前工業化生產IMOs的關鍵酶制劑，其高效表達直接影響IMOs的生產成本，此外，α-葡萄糖苷酶還能以麥芽糖等作為糖基供體，催化合成糖-共軛復合物等生物活性物質，在化妝品、食品、醫藥行業展現出巨大的應用前景。因此，本文介紹了不同來源的α-葡萄糖苷酶的特性和異源表達情況，綜述了α-葡萄糖苷酶用于高效生產IMOs的工業合成途徑和糖苷類生物活性物質合成等方面的研究進展，并展望了α-葡萄糖苷酶分子改造的發展方向，為將來獲得符合特殊需求的糖苷合成酶突變體提供參考。

1 α-葡萄糖苷酶的異源表達

到目前為止，大量具有轉糖基化活性的α-葡萄糖苷酶已經被鑒定和表征，大多數商業上可用的α-葡萄糖苷酶，均通過黑曲霉(Aspergillusniger)發酵生產，如日本天野(Amano Enzymes Inc.)酶制劑公司生產的α-葡萄糖苷酶，占據了國內IMOs生產用酶的大部分市場，由于α-葡萄糖苷酶本體表達水平有限且需要純化回收，成本仍居高不下，所以學者對不同來源的α-葡萄糖苷酶進行了異源表達和酶學性質表征，如表1所示。

1.1 在大腸桿菌中的表達

大腸桿菌由于表達體系成熟完善、繁殖迅速、培養簡單、成本低廉等，是目前采用最多的原核表達體系。學者們先前已將嗜熱脂肪芽孢桿菌、爪洼毛霉、硫礦硫化葉菌、青春雙歧桿菌、釀酒酵母、阪崎腸桿菌、黑曲霉、白色念珠菌、巴西曲霉、腸膜明串珠菌等來源的α-葡萄糖苷酶在大腸桿菌(Escherichiacoli)中進行了重組表達[7]，結果表明其底物特異性、分子質量等因其來源不同而存在差異，學者們研究了該酶對硝基苯-α-D-葡萄糖苷(4-nitrophenyl α-D-glucopyranoside ，pNPG)和麥芽糖等底物的水解活性，而少數也對該酶的轉糖基化活性進行了檢測，因黑曲霉來源的α-葡萄糖苷酶活性高，因此已應用于制備IMOs等食品領域。CHAUDET等[8]報道了來自多形擬桿菌(Bacteroidesthetaiotaomicron)的兩種G31家族的糖苷水解酶(BT_0339 和BT_3299)，兩種α-葡萄糖苷酶通過pET-29a表達載體在E.coli中得到高水平的可溶性表達，研究表明這兩種酶在麥芽糖、異麥芽糖和麥芽低聚糖底物上均表現出水解活性，但對蔗糖和乳糖的水解活性較低。

此外，α-葡萄糖苷酶的工業應用需要在高溫下的穩定性以及對常見的變性劑的穩定性，因此目前已從不同極端微生物中發現并表征了許多耐熱的α-葡萄糖苷酶，以獲得穩定性好的酶源。ZHANG等[9]將來自地芽孢桿菌屬(Geobacillussp.) 的α-葡萄糖苷酶在E.coli中重組表達，酶水解的最適溫度為65 ℃, pH 7.0時水解活性最大，水解活性達107.9 U/mL，最終用300 g/L的麥芽糖漿合成IMOs的轉化率達到37%。LI等[10]從深海假單胞菌(Pseudoalteromonassp.)中克隆得到一種新型α-葡萄糖苷酶(Ⅱ型酶)，在E.coli中表達，結果表明在pH 8.5和30 ℃時表現出最佳活性(19.4 U/mg，麥芽糖)。CUEBAS-IRIZARRY等[11]報道了第一個來自極端嗜鹽菌(Halophileswalsbyi)的α-葡萄糖苷酶，通過表達載體pET28b(+)在E.coli中表達，表明在40 ℃和pH 6.0下檢測到水解α-pNPG的最佳活性，且在3 mol/L的NaCl或3～4 mol/L的KCl條件下，酶水解活性最高。ZHOU等[12]用E.coli表達來源于嗜熱棲熱菌(ThermusthermophilusTC11)的α-葡萄糖苷酶，該重組酶對pNPG、蔗糖、海藻糖和潘糖等都具有水解活性，并以蔗糖和海藻糖為底物時，顯示出糖基化活性，該酶在70 ℃下能穩定7 h以上，耐熱性好。PARK等[13]將超嗜熱泉古菌(Sulfolobustokodaii)來源的α-葡萄糖苷酶在E.coli中表達，該重組酶在95 ℃和pH 4.0時觀察到最大活性，顯示出穩定的耐酸和耐熱性能。綜上，目前已從極端嗜熱微生物中克隆出耐高溫的酶源，但其底物專一性仍需要更深入了解該酶的結構與功能，才能有助于指導酶分子進行定向改造，因此，從極端環境中獲取穩定性好的酶源，要求有強的轉糖基化活性和底物專一性，同時應結合同源建模和分子對接的方法對其進行改造，最終以異源表達方式進行高密度發酵提高產量，突破α-葡萄糖苷酶在工業應用上的限制。

表1 α-葡萄糖苷酶的重組表達及特征(近10年)Table 1 Recombinant expression and characteristic of α-glucosidase (nearly ten years)

1.2 在酵母中的表達

早前有學者以釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)為宿主，對α-葡萄糖苷酶進行了克隆表達。DHANAWANSA等[22]將S.cerevisiae中克隆的α-葡萄糖苷酶I基因(CWH41)過表達，其可溶性表達量增加了28倍，胞內酶的水解活性達306 U/g濕菌體，純化后該酶的比活力達8 550 U/mg蛋白。TANAKA等[23]將來源于蔥狀被孢霉(Mortierellaalliacea)的α-葡萄糖苷酶重組表達于S.cerevisiae，研究表明胞內和胞外的α-葡萄糖苷酶對麥芽糖和淀粉的水解能力均顯著增加。HOSTINOV等[24]從扣囊復膜酵母(Saccharomycesfibuligera)中克隆α-葡萄糖苷酶基因，在S.cerevisiae中表達，該酶為膜結合蛋白，分子質量為110 kDa，對麥芽糖和低聚麥芽糖均有活性，但不水解可溶性淀粉。CASA-VILLEGAS等[17]通過構建pSSP-aglA表達載體，在S.cerevisiae中表達來自A.niger的α-葡萄糖苷酶基因，該重組酶一半與細胞結合，一半分泌到胞外，當麥芽糖為底物時，主要的糖基化產物是潘糖和異麥芽糖。通過以上研究表明，釀酒酵母作為重組蛋白的表達宿主，對分子質量超過100 kDa的蛋白分泌水平不高，不便于分離純化。

由于釀酒酵母缺乏強有力的啟動子，且重組蛋白分泌水平不高，而巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)具備強啟動子、翻譯后修飾能力、分泌效率高、培養成本低、發酵工藝成熟和易放大等優點，是目前最為成功的真核蛋白表達系統之一。WU等[25]將自米曲霉(AspergillusoryzaeZL-1)來源的α-葡萄糖苷酶轉化P.pastoris進行表達，結果表明該酶的轉糖基化活性在pH 5.2和37 ℃下最高，純化后的酶比活力為83.5 U/mg，以麥芽糖為底物，主要產物為潘糖。SUTHANGKORNKUL等[16]從致倦庫蚊(Culexquinquefasciatus)的唾液中克隆α-葡萄糖苷酶基因，并在P.pastoris中重組表達，結果表明該酶可水解異質底物(Ⅱ型酶)，最適pH和溫度分別為5.5和35 ℃，且對麥芽三糖的催化效率高于蔗糖、麥芽糖、麥芽糖和pNPG。MUSLIN等[26]在P.pastoris中表達了來自大麥(Barley)的α-葡萄糖苷酶，證實了該酶可在體外水解完整的淀粉顆粒，屬Ⅲ型酶，分泌表達量為2 g/L，且水解麥芽糖的最佳pH值在3.5～4.5。此外，學者們還將黑曲霉[27]、印度蜜蜂[15]等來源的α-葡萄糖苷酶P.pastoris中進行了表達，研究證明真核生物來源的α-葡萄糖苷酶大都為糖基化蛋白，而畢赤酵母可對該酶進行糖基化并將其分泌到胞外，因此，畢赤酵母作為真核生物來源的α-葡萄糖苷酶的表達宿主，在保證其生物活性的同時還利于分離純化，而且可采用優化密碼子和共表達分子伴侶等策略提高表達水平[14, 19]，是工業化制備α-葡萄糖苷酶的理想宿主。

1.3 在其他宿主中的表達

α-葡萄糖苷酶在構巢曲霉(Aspergillusnidulans)、乳酸菌、枯草芽孢桿菌和黑曲霉中也進行了過表達，如NAKAMURA等[28]將來源于A.niger的α-葡萄糖苷酶在構巢曲霉中表達，結果表明α-葡萄糖苷酶受碳源調控，麥芽糖和淀粉均可誘導該酶的表達，而葡萄糖會抑制其表達，這與黑曲霉中α-淀粉酶和糖化酶的表達情況一致。GIULIANO等[29]以乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)為表達體系，重組表達來自硫礦硫化葉菌(Sulfolobussolfataricus)的α-葡萄糖苷酶，優化后α-葡萄糖苷酶的表達量比野生菌株高1 000倍。HUNG等[30]從馬里亞納海溝沉積物中分離出地芽孢桿菌(Geobacillus)HTA-462，將其α-葡萄糖苷酶在枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)中重組表達，低離子強度下，該酶以同源二聚體形式存在(130 kDa)，在15 mmol/L 的Gly-NaOH緩沖體系中，60 ℃和pH 9.0時具有最大水解活性，麥芽糖作為糖供體時，可將麥芽糖轉化為異麥芽糖。此外，張津浩等[31]通過農桿菌介導法，以pSZH10-6-1為表達載體，將來源于A.niger的α-葡萄糖苷酶整合到黑曲霉基因組，重組酶分子質量為97 kDa，最適反應溫度為40 ℃左右，最適pH值在6.0左右，胞外發酵液中的酶水解活性可達180 U/mL。綜上，學者們通過在構巢曲霉、乳酸菌、枯草芽孢桿菌和黑曲霉中過表達α-葡萄糖苷酶，研究表明總體表達水平較低，且轉糖基化活性不高，難以滿足工業化生產的需求，近年來相關研究已不多。

因此，α-葡萄糖苷酶的異源表達體系雖研究較多，但表達水平以大腸桿菌和畢赤酵母最高，且不同來源的α-葡萄糖苷酶的最適溫度、最適pH、底物偏好性等酶學性質存在較大的差異，如何將發掘的該酶的所有不同的生物學信息進行分析和整合，實現優勢位點組合，是亟待解決的的問題。目前已有通過隨機誘變、定點突變等方法對該酶進行分子改造的報道，雖在一定程度上提高了穩定性， 但要滿足工業化的需要，仍需要利用易錯PCR、DNA改組等分子定向進化策略，并借助計算機模擬分析，通過3D建模、分子對接和分子模擬等技術，將優勢位點組合，產生超級突變株，獲得比天然酶活力更高、穩定性更好的工業用酶。

2 α-葡萄糖苷酶的應用研究

2.1 合成低聚異麥芽糖

IMOs的工業化生產，一般是以淀粉為原料，首先經α-淀粉酶液化，進而被β-淀粉酶和普魯蘭酶等糖化酶糖化為麥芽糖漿，最后經α-葡萄糖苷酶的轉苷作用催化合成IMOs。α-淀粉酶，β-淀粉酶和普魯蘭酶等研究和工業應用已成熟，但α-葡萄糖苷酶催化的轉糖基化反應是制備IMOs的關鍵步驟，因此α-葡萄糖苷酶是工業化生產IMOs的關鍵酶制劑[32]。

KUMAR等[20]將曲霉變種(A.neoniger)來源的α-葡萄糖苷酶經P.pastoris重組表達后用于合成IMOs，最終產物中潘糖和異麥芽糖的比例分別達到61.29%和12.72%，而且對潘糖有較低速率的二次水解。GARCIA-GONZALEZ等[21]將梅奇酵母屬(Metschnikowiaspp.)來源的α-葡萄糖苷酶在E.coli中重組表達，研究表明該重組酶對蔗糖、麥芽糖和對硝基苯基-α-D-葡萄糖苷均具有水解活性，將其用于合成IMOs, 最終產量達到170 g/L，是迄今為止報道最高的產量。此外，學者通過對α-葡萄糖苷酶進行固定化或將表達α-葡萄糖苷酶的細胞進行固定化，以提高酶的穩定性和利用率。WANG等[33]將黑曲霉來源的α-葡萄糖苷酶固定于環氧樹脂上，在55 ℃和pH 4.5的乙酸丁酯緩沖體系下，IMOs的產率可達50.83%，完成反應后α-葡萄糖苷酶被分配到有機相，保持了良好的可重復使用性。OJHA等[34]報道了以海藻酸鈣包埋的微桿菌(Microbacteriumsp.)用于固定床全細胞催化合成IMOs，在400 g/L的麥芽糖初始濃度下反應24 h，產量達到85 g/L，與游離細胞相比，IMOs的生產效率提高4.2倍[達到4.0 g/(L·h)]，底物轉化率可達24%。

IMOs的工業化生產工藝中存在工序多、周期長、底物轉化率低、工藝參數控制困難等缺點[35]，且酶法轉化產品中重要功能性低聚糖的含量不高，制約著IMOs的應用，其核心技術問題之一是酶的合理組合與優化利用,IMOs的工業合成途徑及策略如圖1所示。CHEN等[36]將來自嗜熱脂肪地芽孢桿菌(G.stearothermophilus)純化的α-葡萄糖苷酶進行固定化，以淀粉作底物，采用殼聚糖膜固定化α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、普魯蘭酶等小規模制備IMOs，最終產物中IMOs的含量達到41.74%，該法簡化了IMOs的生產工序，顯示出以淀粉為原料一步法生產IMOs的潛力，但還需驗證在規模化反應器中的穩定性和重復操作能力。此外，學者還利用酵母細胞表面展示α-葡萄糖苷酶技術直接用于合成IMOs，展現出良好的應用潛力。CASA-VILLEGAS等[17]將A.niger來源的α-葡萄糖苷酶與酵母的糖基磷脂酰肌醇錨定序列融合表達，展示于S.cerevisiae細胞表面用于制備IMOs，其主要產物為潘糖和異麥芽糖，且通過調節底物中麥芽糖與葡萄糖的比例可控制產物IMOs中潘糖和異麥芽糖的產量，該法提供了一種使用酵母細胞表面展示α-葡萄糖苷酶來低成本制備IMOs的方法。此外，ZHAO等[37]將A.niger來源的α-葡萄糖苷酶展示于P.pastoris細胞表面用于制備IMOs，在0.5 L的催化體系中，反應2 h后轉化率約為44%。WANG等[38]利用醛基修飾磁性殼聚糖載體，將表面展示α-葡萄糖苷酶的P.pastoris細胞進行固定化，并用于催化麥芽糖，連續運行48 h后IMOs的產量達90 g/L。研究表明，α-葡萄糖苷酶展示于酵母細胞表面及細胞固定化后重復利用率高，轉化率穩定，系統穩定性強。目前，IMOs規模化生產的成本主要在于酶的生產和純化，而酵母細胞表面展示系統不需對α-葡萄糖苷酶進行純化，可提高該酶的反應效率和操作穩定性，且能多次重復利用，是規模化制備IMOs的最具前景的高效催化系統之一，但目前的研究仍停留在小試階段，要實現工業化生產還應進行生產模擬放大實驗，以及考慮可能存在的底物抑制、產物抑制及不同的反應條件對細胞表面展示合成系統穩定性的影響。

2.2 催化合成糖苷類生物活性物質

某些化合物由于被糖基化后可有效改善其水溶性、生物利用度、穩定性和藥效學反應等，從而使得其糖苷復合物廣泛應用于食品、醫藥和化妝品等行業。在天然植物體內，糖苷類活性物質一般由糖基轉移酶(glycosyltransferase，GT)催化合成，但GT在體外其穩定性較差，且需昂貴的糖基供體核苷酸二磷酸糖(NDP-sugars)[39]，限制了其在合成糖苷上的規模化應用，而α-葡萄糖苷酶，除能對糖苷鍵進行水解外，還能使用多種碳水化合物(葡萄糖、麥芽糖、木糖、甘露糖、半乳糖等)作為糖基供體，轉移糖基形成糖苷，因此在生產糖苷類生物活性物質方面有著巨大的應用潛力(圖2)。

類黃酮可通過糖基化增加其水溶性和生物利用度，是改善其藥代動力學和生物活性的一種有前景的方法[40]，臨床應用的黃酮類藥物多為糖苷類，如蕓香(槲皮素3-O-蕓香苷)膠囊給藥，葛根素(大豆黃酮8-C-葡萄糖苷)注射給藥等。LI等[41]利用硫磺礦硫化葉菌(Sulfolobussolfataricus)來源的耐熱α-葡萄糖苷酶衍生的O-α-糖苷連接酶，開發了一種高效合成類黃酮O-α-糖基化的方法，該酶底物譜寬，對黃酮、黃烷酮、黃烷酮醇、黃烷醇和異黃酮類均有較強的轉糖基化活性，產率均在90%以上，最終可合成7-O-α-葡萄糖苷類黃酮。CHEN等[18]將來自野油菜黃單胞菌(Xanthomonascampestris)的α-葡萄糖苷酶(Agl2)在E.coli中重組表達，該酶以麥芽糖為糖基供體，可對苯酚、香蘭素和乙基香蘭素等酚類底物進行糖基化，且其催化效率主要受糖基化/水解選擇性和催化環境中葡萄糖含量的影響。

L-抗壞血酸(ascorbic acid，AA)在維持皮膚彈性和修復受損皮膚方面有重要作用，可作為化妝品的主要護膚成分。研究發現α-葡萄糖苷酶可對L-抗壞血酸進行糖基化，一定條件下形成不同比例的6-O-α-D-葡萄糖基-L-抗壞血酸(AA-6G)和2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗壞血酸(AA-2G)，兩者的抗氧化活性均保持在AA的水平，但AA-2G的穩定性遠高于AA-6G，且AA-2G在體內容易被酶處理以釋放活性AA[42]。LI等[43]將來自A.niger的α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase，Agl)的截短版本AglA-t在P.pastoris中表達并純化后合成L-抗壞血酸-O-葡萄糖苷，主要產物為AA-2G，在pH 6.0和40 ℃時產量最高,為0.53 g/L，并分析猜測AglA的信號肽可能對糖基化位點的選擇起主要作用。來自水稻種子和哺乳動物等高等真核細胞的α-葡萄糖苷酶用于合成AA-2G，有副產物少的優點，如QI等[44]將亞洲稻(Oryzasativa)來源的Agl在P.pastoris中表達并純化，以麥芽糖為糖基供體，在37 ℃，pH 4.0的最適條件下可合成約8.7 g/L的AA-2G。以上研究表明不同來源的α-葡萄糖苷酶底物活性不同，糖基化位點不同，形成的糖基化產物的活性和穩定性會受到影響。熊果素可通過抑制酪氨酸酶的活性，減少黑色素的沉積，從而在美白等化妝品方面有重要的應用。PARK等[45]以嗜酸熱原體(Thermoplasmaacidophilum)來源的Agl為對象，提出了一種用AglA及其糖苷合成酶突變體合成熊果苷的新方法，通過用非親核的甘氨酸取代親核試劑構建α-糖苷合成酶AglA，研究表明AglA以麥芽糖為供體，熊果素為受體，合成主要產物C-3、C-4和C-6熊果苷，但其轉糖基化產物可再次被酶水解并最終降低產率，但AglA糖苷合成酶突變體只產生一種主要產物C-4熊果苷，其產量為38%，且沒有被進一步水解。綜上，α-葡萄糖苷酶對不同底物的偏好性，及對形成 C-糖苷和O-糖苷的區域和立體特異性的選擇，影響著糖苷類物質的生物活性及穩定性，而不同來源的α-葡萄糖苷酶的底物譜及催化特性，給揭示該酶及突變體的糖基化區域和立體選擇性的分子機制提供了結構信息，以便運用理性設計的方法構建α-葡萄糖苷酶突變體，最終可合成生物活性高且穩定性強的糖苷類物質。

目前，除α-葡萄糖苷酶外，研究發現糖苷磷酸化酶(glycoside phosphorylases)，也能以簡單的磷酸化糖作為供體合成糖苷，且產率較高，如蔗糖磷酸化酶(sucrose phosphorylase)[46]，此外，還有葡聚糖蔗糖酶(glucansucrases)[47]，環糊精糖基轉移酶(cyclodextrin glucanotransferase)[48]，淀粉蔗糖酶(amylosucrases)[49]等，它們在催化對苯二酚、抗壞血酸、槲皮素、白藜蘆醇和沒食子酸丙酯等α-糖基化反應方面有較大的應用潛力。目前雖已揭示了某些酶的三維構象及催化位點，但尚沒有明確的理論基礎用于指導“糖苷合成酶”的改造，它們之間的構效關系也掌握的并不徹底，我們需要更多的蛋白質方面的生物學信息，如來自嗜熱解糖熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacteriumthermosaccharolyticum)的蔗糖磷酸化酶由于活性部位精氨酸和Loop環的空間限制，當以蔗糖-6-磷酸為供體時，不能對白藜蘆醇進行糖基化，但研究發現其R134A突變體可高效合成白藜蘆醇-3-α-葡萄糖苷，原因在于R134A突變體引起了空間構象的變化[50]，因此，掌握涉及β/α-糖基化構型、立體選擇性及引起構象變化的結構信息，是未來半理性或理性設計糖基合成酶突變體的分子基礎，因此只有充分的掌握這些結構與功能信息，才能在轉糖基化效率、特異性和立體選擇性上進行更有效的工程設計。

2.3 其他方面

α-葡萄糖苷酶的應用研究，還體現在α-葡萄糖苷酶抑制劑、生物傳感器及代謝工程等方面(圖2)。由于α-葡萄糖苷酶抑制劑可有效降低餐后血糖水平，成為當前治療Ⅱ型糖尿病的研究熱點[51]，目前關于α-葡萄糖苷酶抑制劑主要集中在多糖、皂苷、生物堿、黃酮、多肽、萜類等天然活性成分的研究上。MOHIUDDIN等[52]將α-葡萄糖苷酶共價固定在氨基化的多壁碳納米管上，開發了一種用于測定藥用植物抗糖尿病潛力的生物傳感器，該傳感器靈敏度高，方法簡便，對于快速篩選α-葡萄糖苷酶抑制劑有顯著效果。此外，KOJIMA等[53]研究了敲除米曲霉α-葡萄糖苷酶基因(agdA)對釀造日本清酒轉糖基化產物的影響，agdA基因的敲除降低了清酒中α-乙基葡萄糖苷和α-甘油葡萄糖苷的含量，并通過核磁共振鑒定出新化合物乙基-α-麥芽糖苷和乙基-α-異麥芽糖苷是日本清酒中常見的苷類。YU[54]將自丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)克隆得到的α-葡萄糖苷酶(agluI和agluⅡ)過表達于酪丁酸梭菌(Clostridiumtyrobutyricumtyrobutyricum)，結果表明，突變株可利用麥芽糖和可溶性淀粉生產正丁醇，丁醇產量可達17.2 g/L，產率比原來提高了近1倍，且在間歇發酵時表現穩定，這種方法為以麥芽糖和淀粉為原料工業化生產正丁醇提供了新思路。

圖2 α-葡萄糖苷酶在不同領域的研究和應用Fig.2 Research and application of α-glucosidase in different fields

3 展望

糖基化的化合物在食品、制藥和個人護理行業有廣泛的應用，但它們的合成遠遠不能滿足需求。糖基化合物的化學合成法由于產量低和缺乏選擇性，使生物催化途徑作為有效的和“綠色”替代品受到了越來越多的關注。目前α-葡萄糖苷酶主要用于IMOs的合成，而要降低IMOs的工業生產成本，仍需通過半理性設計或理性設計策略，利用該酶突變體的序列信息，結構與功能信息，以及計算機預測算法等手段，對α-葡萄糖苷酶進行分子改造。天然的糖苷水解酶、糖苷磷酸化酶等，除能通過糖基化來改善某些化合物的水溶性和穩定性等性能外，在紅景天苷、人參皂苷的合成方面也有著巨大的應用潛力[55-56]。但由于轉移葡萄糖基、半乳糖基、木糖基、甘露糖基等殘基可能需要不同的糖苷合成酶突變體來完成，要求其底物特異性和立體選擇性專一性強，才能高效合成單一的目的產物，因此糖苷合成酶突變體的研究，是未來學者研究的重點方向之一。筆者認為，應鑒別出“高功能性”糖苷類化合物的關鍵糖基化位點及其構型，并建立生物信息學數據庫，進而結合酶的定向進化及高通量篩選技術，借助模型構建、計算機預測、信息整合、分析優化等手段，快速高效的篩選出活性高、穩定性強的符合特定需求的酶突變體。此外，自然界是糖苷合成酶的天然寶庫，應重視對生物資源中天然糖苷合成酶的開發和利用，分析其序列及結構信息，并通過蛋白質工程拓寬或改變底物特異性，這對于開發適合特定應用需要的新型酶突變體意義重大。