不同表面修飾納米硒在模擬胃腸消化中穩定性及抗氧化活性變化

王亞彬，黎志偉，李長江，戴雅琪，何芬芳，鄭國棟*，楊麗聰

1(江西農業大學 食品科學與工程學院，天然產物結構與分離重點實驗室，江西 南昌，330045)2(福州大學 生物科學與工程學院，福建 福州，350108)

多酚類物質是植物的次級代謝產物，包括黃酮、花色苷等，廣泛存在于水果、谷物和蔬菜中，具有多種生物活性。綠原酸和沒食子酸是常見的多酚化合物，具有抗氧化、抗菌、抗腫瘤、抗炎、保護神經和保護肝臟等生物活性[1-3]。維生素C是一種水溶性維生素，廣泛存在于水果和蔬菜中，具有抗氧化，抗衰老，清除有害自由基等生物活性[4]。食品中的多酚化合物及維生素類物質必需經過胃腸消化才能被人體吸收，參與到新陳代謝，才能發揮它們抗氧化作用，并促進人體健康[5-6]。但是多酚化合物水溶性低，導致其在生物體內的有效性較低，只有5%～10%的多酚可被小腸吸收。另一方面多酚及維生素C分子有多個羥基基團，容易被氧化。因此，增加這些活性物質的穩定性及促進其在生物體內利用十分必要。

納米硒(selenium nanparticles,SeNPs)是近年來備受人們關注的納米材料之一。納米硒作為藥物用于腫瘤治療已經得到越來越多的研究，其功能化和靶向修飾可增強抗腫瘤效果[7]。與無機硒相比，納米硒毒性更低，生物活性更高，更容易被機體吸收消化[8]。本課題組前期研究表明，利用納米硒負載綠原酸、沒食子酸[9]或維生素C[10]，可有效提高其體外生物活性。人體的消化環境和過程比較復雜，極易對不同表面修飾納米硒穩定性產生影響，不同表面修飾納米硒在生物體內的穩定性仍是未知的，因此研究不同表面修飾納米硒在胃腸液中的穩定性對于其在生物體內的應用十分必要。

本研究通過測定體外胃腸液消化前后不同表面修飾納米硒的粒徑、表面修飾劑的殘留量以及DPPH和ABTS陽離子自由基的清除能力，比較綠原酸納米硒(CGA@SeNPs)、沒食子酸納米硒(GA@SeNPs)和維生素C納米硒(VC@SeNPs)的穩定性和抗氧化活性。本研究可為納米硒在生物體內的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠原酸，畢得醫藥；硼氫化鈉，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；沒食子酸、維生素C，天津永大化學試劑廠；亞硒酸鈉，鄭州紅祥化工有限公司；聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone，PVP)、DPPH、NaHCO3、ABTS陽離子自由基，北京索萊寶科技有限公司；胃蛋白酶、胰蛋白酶，大連美侖生物技術有限公司；鹽酸，南昌鑫光精細化工廠；NaOH，上海國藥集團；KH2PO4、無水乙醇，西隴科學股份有限公司。

1.2 儀器與設備

Moecular devices多功能酶標儀、UV-5200型UV-可見分光光度計、恒溫水浴鍋，上海元析儀器有限公司；AUY120型電子天平，島津公司；CL-3型磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責任公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 納米材料的制備

參考文獻[11]制備CGA@SeNPs。調節亞硒酸鈉溶液pH值至5～6。先將100 μL 0.1 mmol/L的亞硒酸鈉溶液與1.6 mL 50 mmol/L綠原酸溶液混合均勻，滴加200 μL 0.1 mmol/L硼氫化鈉溶液，400 r/min攪拌30 min，直到溶液顏色變為磚紅色，離心，即獲得CGA@SeNPs。

參照文獻[9]改進GA@SeNPs的合成方法，將2 mL 0.1 mmol/L亞硒酸鈉溶液與2 mL 0.6 mmol/L沒食子酸溶液等體積混合后，用稀鹽酸將pH值調至3.0，加熱揮干后得橙紅色固相樣品，將此樣品加超純水溶解，定容至10 mL得GA@SeNPs。

依據軟模板法[12-13]制備VC@SeNPs并適當調整。以PVP為模板劑，維生素C為還原劑。將2 mL 0.2 mol/L維生素C溶液加入小燒杯中，并用磁力攪拌器以300 r/min的轉速輕輕攪拌，然后將1 mL 0.1 mol/L亞硒酸鈉溶液和3 mL 5.0 g/L PVP溶液滴入維生素C溶液中，攪拌至顏色由無色變至磚紅色，將所得溶液取400 μL定容至10 mL得VC@SeNPs。

1.3.2 不同表面修飾納米硒在不同pH中的穩定性

取pH值為2、4、6、8、10 PBS緩沖液1 mL和0.5 mL 250 μg不同表面修飾劑納米硒混合，搖勻，置于37 ℃恒溫培養箱中保溫2 h，觀察有無聚集或沉降。各取100 μL加入酶標板，各梯度設置3組平行測定吸光度，讀出410和490 nm處的吸光度數值，A410/A490比值的變化用于表征粒徑變化[14]。

1.3.3 體外模擬胃腸道消化

1.3.3.1 體外模擬胃消化

消化過程中，藥物在胃中的停留時間與藥物種類有關，一般在胃部的停留時間為1～3 h，最多不超過4 h[15]。根據鄒青飛等[16]的研究方法，取100 μL CGA@SeNPs、GA@SeNPs和VC@SeNPs溶液置于50 mL的離心管中，加入25 mL人工胃液，水浴4 h。分別取2 mL消化1、2、3、4 h的樣品溶液。測定納米粒子的粒徑，抗氧化能力及表面修飾劑CGA、GA和維生素C含量變化。

1.3.3.2 體外模擬腸消化

基于模擬胃消化的實驗結果，在消化2 h后，不同表面修飾納米硒的粒徑基本保持不變，因此在胃消化2 h后，進入模擬腸消化階段。根據鄒青飛等[16]的研究方法，取10 mL經胃消化2 h后的樣品溶液于50 mL離心管中，再加入5 mL人工腸液，調pH值至7.0左右，水浴消化4 h。取2 mL消化1、2、3、4 h的樣品溶液，測抗氧化能力及表面修飾劑CGA、GA和維生素C含量變化。

1.3.4 體外模擬胃腸道消化時不同表面修飾納米硒粒徑的測量

分別在胃、腸消化 1、2、3、4 h，取200 μL胃液或胃腸液于96孔酶標板中，每個時間段取3個孔作為平行樣。根據雙波長法，A410/A490作為納米粒徑的衡量標準[17]。

1.3.5 體外抗氧化活性的測定

1.3.5.1 DPPH自由基清除能力的測定

DPPH清除率的測定[18]，分別取1、2、3和4 h的胃液和腸液消化樣品，實驗分組如下：空白組，每孔加入 180 μL DPPH工作液和 20 μL無水乙醇；對照組，每孔加入 180 μL無水乙醇和 20 μL含納米粒子的胃液(胃腸液)消化液；實驗組，每孔加入 180 μL DPPH工作液和 20 μL含納米粒子的胃液(胃腸液)消化液。室溫避光孵育20 min，測定其吸光度值，試驗平行測定3次。按公式(1)計算清除率：

(1)

式中：E,清除率，%；AX,樣品吸光值；A1,對照組吸光值；A0,空白組吸光值。

1.3.5.2 ABTS陽離子自由基清除能力測定

ABTS陽離子自由基清除率的測定[18]，分別取1、2、3和4 h的胃液和腸液消化樣品，實驗分組如下：空白組，每孔加入180 μL ABTS陽離子自由基工作液和 20 μL無水乙醇；對照組，每孔加入180 μL無水乙醇和 20 μL含納米粒子的胃液(胃腸液)消化液；實驗組，每孔加入 180 μL ABTS陽離子自由基工作液和20 μL含納米粒子的胃液(胃腸液)消化液。室溫避光孵育20 min，測定其吸光度值，試驗平行測定3次。根據1.3.5.1中公式(1)計算清除率。

1.3.6 表面修飾劑含量的測定

綠原酸，維生素C和沒食子酸以二倍法稀釋成不同的濃度，用紫外分光光度計測其吸光度，作標準曲線[19]。在胃腸消化的1、2、3和4 h取樣，測其吸光度，修飾物的含量用標準曲線計算。

1.3.7 數據處理與分析

采用SPSS 18.0軟件分析實驗數據，結果用平均值±標準差表示，通過單因素方差分析和多重比較方法對數據進行顯著性差異分析，P<0.05表示差異具有顯著性。

2 結果與分析

2.1 不同表面修飾納米硒在不同pH中粒徑的變化

根據雙波長法[19]，當吸光度比值A410/A490不變時納米粒子粒徑不變，處于穩定狀態，且比值越大，納米硒的粒徑越小，形貌越穩定。由圖1可以看出pH值為2～6時，A410/A490的比值沒有顯著性變化，說明3種不同表面修飾納米硒顆粒結構穩定。然而在pH值為8～10時，CGA@SeNPs的A410/A490的比值變為7.5，說明CGA@SeNPs納米粒子不穩定。CGA在pH值為8～10時會發生降解[20]，因此，CGA@SeNPs與CGA性質一致，堿性條件下會發生降解。同理在pH值為8～10時，GA@SeNPs的A410/A490的比值變化了1.0，這與吳雪釵等[21]的研究結果一致，GA在pH值為2～6時穩定，pH值為8～10時不穩定，堿性條件下會發生降解，所以GA@SeNPs與GA的性質一樣。VC@SeNPs的A410/A490的比值變化了0.8，納米顆粒發生了降解，這與王樂等[22]的研究結果一致，維生素C是一種強酸性物質，在pH值為2～6時穩定，在pH值為8～10時不穩定，VC@SeNPs與維生素C的性質一樣。因此3種不同表面修飾納米硒在酸性條件下穩定，堿性條件下不穩定。

圖1 不同表面修飾納米硒在不同pH中粒徑變化Fig.1 Particle size changes of different surface modified nano selenium at different pH

2.2 不同表面修飾納米硒在模擬胃消化中粒徑的變化

3種不同表面修飾納米硒經胃消化后不同時間段粒徑的變化如圖2所示，A410/A490的比值有所波動，但變化不顯著，說明3種不同修飾納米硒經胃消化后粒徑基本維持穩定，結構未受到破壞，這與王樂等[22]的研究結果相一致。但1～2 h時，GA@SeNPs的A410/A490的比值波動較大，相比之下，CGA@SeNPs的結構更穩定。

圖2 不同表面修飾納米硒在模擬胃消化中粒徑變化Fig.2 Particle size changes of different surface modified nano selenium in simulated gastric digestion

2.3 不同表面修飾納米硒在模擬腸消化中粒徑的變化

3種不同表面修飾納米硒在模擬腸消化的不同時間段的粒徑變化如圖3所示，CGA@SeNPs的A410/A490的比值在4 h內幾乎沒有變化，說明納米粒子在腸液中結構穩定。GA@SeNPs和VC@SeNPs在3 h內粒徑基本沒有變化，4 h時A410/A490的比值有所波動，但變化不顯著，說明3種不同修飾納米硒經腸消化后粒徑基本維持穩定，結構未受到破壞，這與王樂等[22]的研究結果相一致。在3～4 h時VC@SeNPs的A410/A490比值波動較大，其次是GA@SeNPs，CGA@SeNPs的穩定性最好。

圖3 不同表面修飾納米硒在模擬腸消化中粒徑變化Fig.3 Particle size changes of different surface modified nano selenium in simulated intestinal digestion

2.4 不同表面修飾納米硒在模擬胃腸消化后抗氧化能力的測定

2.4.1 不同表面修飾劑納米硒未消化前對DPPH的清除力

CGA@SeNPs、GA@SeNPs和VC@SeNPs在未消化前不同時間段對DPPH的清除率如圖4所示，在2 h時，3種不同修飾納米硒的抗氧化能力具有顯著性差異(P<0.05)，可看出清除率最高的是GA@SeNPs，其次是VC@SeNPs，CGA@SeNPs最低。隨著消化時間的延長，GA@SeNPs和VC@SeNPs的清除率有所提高，3 h達到最高值，CGA@SeNPs基本保持不變。

圖4 未消化前不同表面修飾納米硒的不同時間段對DPPH的清除率Fig.4 Clearance of DPPH by different surface modified nano selenium in different periods before digestion

2.4.2 不同表面修飾納米硒模擬胃消化后對DPPH自由基的清除力

CGA@SeNPs、GA@SeNPs和VC@SeNPs在模擬胃消化不同時間段對DPPH清除率的影響如圖5所示。

圖5 不同表面修飾納米硒在胃消化的不同時間段對DPPH的清除率Fig.5 Clearance of DPPH by different surface modified nano selenium in different periods of gastric digestion

3種不同表面修飾納米硒對DPPH自由基清除率具有顯著性差異(P<0.05)，可看出清除率最高的是GA@SeNPs，其次是CGA@SeNPs，VC@SeNPs最低，但相較于未消化前3種不同表面修飾納米硒的清除率有所降低，這進一步證實在模擬胃消化過程中CGA、GA和維生素C都略有降解，這與李貽等[23]的研究結果相一致。與未消化樣品相比，VC@SeNPs對DPPH自由基清除率的下降幅度最大，在3 h時下降了36.06%，其次是GA@SeNPs，下降了11.08%，CGA@SeNPs下降了1.69%，因此CGA@SeNPs經胃消化后具有較強的抗氧化活性。

2.4.3 不同表面修飾納米硒模擬腸消化后對DPPH自由基的清除力

CGA@SeNPs、GA@SeNPs和VC@SeNPs在模擬腸消化時對DPPH的清除率如圖6所示，3種不同表面修飾納米硒對DPPH清除率具有顯著性差異(P<0.05)，1和3 h時清除率最高的是VC@SeNPs，其次是CGA@SeNPs，GA@SeNPs最低，4 h時GA@SeNPs的清除率比CGA@SeNPs高，與模擬胃消化不同，GA@SeNPs在模擬腸消化的1和3 h時清除率最低，說明GA@SeNPs的結構較胃消化過程的穩定性差。然而VC@SeNPs的清除率最高，說明相對于GA@SeNPs和CGA@SeNPs，VC@SeNPs在模擬腸消化中結構更穩定。與未消化的樣品相比，清除率下降幅度最大的是GA@SeNPs，在腸消化1 h時，下降了30.71%，其次是CGA@SeNPs，下降了2%，然而VC@SeNPs升高了8.57%，因此VC@SeNPs在腸消化后具有較強的抗氧活性。

圖6 不同表面修飾納米硒在腸消化的不同時間段對DPPH的清除率Fig.6 Clearance of DPPH by different surface modified nano selenium in different periods of intestinal digestion

2.4.4 不同表面修飾納米硒未消化前對ABTS陽離子自由基的清除力

CGA@SeNPs、GA@SeNPs和VC@SeNPs在未消化時對ABTS陽離子自由基的清除率如圖7所示。1和3 h時，不同表面修飾納米硒對ABTS陽離子自由基的清除率具有顯著性差異(P<0.05)，清除率最高的是GA@SeNPs,其次是CGA@SeNPs，VC@SeNPs最低。2和4 h時，GA@SeNPs清除率最高，CGA@SeNPs和VC@SeNPs的清除率接近。

圖7 未消化前不同表面修飾納米硒的不同時間段對ABTS陽離子自由基的清除率Fig.7 Clearance of ABTS cationic radical by different surface modified nano selenium in different time periods before digestion

2.4.5 不同表面修飾納米硒模擬胃消化后對ABTS陽離子自由基的清除力

CGA@SeNPs、GA@SeNPs和VC@SeNPs在模擬胃消化時對ABTS陽離子自由基的清除率如圖8所示，相對于DPPH自由基，這3種不同表面修飾納米硒對ABTS陽離子自由基的清除率力較高。1～3 h內CGA@SeNPs、GA@SeNPs和VC@SeNPs對ABTS陽離子自由基的清除率具有顯著性差異(P<0.05)，清除率最高的是GA@SeNPs，其次是CGA@SeNPs，VC@SeNPs最低。CGA@SeNPs和GA@SeNPs在胃消化過程中對自由基的清除力基本保持不變，無顯著性變化，說明在胃消化過程中納米粒子的結構保持穩定，但VC@SeNPs對ABTS陽離子自由基清除率在3和4 h顯著上升，可能是實驗誤差造成的。相較于未消化的樣品，CGA@SeNPs和GA@SeNPs都有所提高，GA@SeNPs在1 h時提高了23.55%，CGA@SeNPs提高了9.15%，但VC@SeNPs降低了11.84%。綜上所述，GA@SeNPs在模擬胃消化中對ABTS陽離子自由基抗氧化活性最高，其次是CGA@SeNPs。

圖8 不同表面修飾納米硒在胃消化的不同時間段對ABTS陽離子自由基的清除率Fig.8 Clearance of ABTS cationic radical by different surface modified nano selenium in different periods of gastric digestion

2.4.6 不同表面修飾納米硒模擬腸消化后對ABTS陽離子自由基的清除力

CGA@SeNPs、GA@SeNPs和VC@SeNPs在模擬腸消化時對ABTS陽離子自由基的清除率如圖9所示，3 h時CGA@SeNPs、GA@SeNPs和VC@SeNPs對ABTS+清除率具有顯著性差異(P<0.05)，清除率最高的是GA@SeNPs，其次是VC@SeNPs，CGA@SeNPs最低。3種不同表面修飾納米硒在模擬腸消化過程對ABTS陽離子自由基的清除率比模擬胃消化過程要高，這與孟天夢等[24]的研究結果相一致，這是由于腸消化后負載在CGA@SeNPs、GA@SeNPs和VC@SeNPs上CGA、GA和維生素C發生了輕微的解離使得腸液中修飾劑含量增多，從而清除率上升。與未消化的樣品相比，GA@SeNPs的清除率在1 h時提高了29.48%，其次是CGA@SeNPs在2 h時提高了32%，與GA@SeNPs相近，但VC@SeNPs在4 h時則降低了30.50%。因此，CGA@SeNPs經腸消化后抗氧化活性較好。

圖9 不同表面修飾納米硒在腸消化的不同時間段對ABTS陽離子自由基的清除率Fig.9 Clearance of ABTS cationic radical by different surface modified nano selenium in different periods of intestinal digestion

2.5 不同表面修飾納米硒在模擬胃腸消化后含量的變化

2.5.1 不同表面修飾納米硒經胃消化后含量的變化

CGA@SeNPs、GA@SeNPs和VC@SeNPs經胃消化后CGA、GA和維生素C含量的變化如圖10所示。CGA@SeNPs和VC@SeNPs經胃消化后CGA和維生素C含量無明顯變化，表明CGA和維生素C在胃液中穩定存在。然而GA@SeNPs中GA的含量有所降低，表明隨著胃消化時間的延長GA發生了一定程度的降解。其中CGA@SeNPs在1～4 h時幾乎無變化，因此，CGA@SeNPs經胃消化后可穩定存在。

圖10 模擬胃消化過程不同時間段表面修飾劑的濃度Fig.10 Concentration of surface modifier in different periods during simulated gastric digestion

2.5.2 不同表面修飾納米硒在腸消化后含量的變化

CGA@SeNPs、GA@SeNPs和VC@SeNPs經腸消化后CGA、GA和維生素C含量變化如圖11所示。由圖可知在模擬腸消化的1～4 h內3種表面修飾納米硒中CGA、GA和維生素C含量無顯著性變化，但在3～4 h時GA@SeNPs和VC@SeNPs都有所下降，VC@SeNPs下降最明顯，因此，CGA@SeNPs經腸消化后可穩定存在。

圖11 模擬腸消化過程不同時間段表面修飾劑的濃度Fig.11 Concentration of surface modifier in different periods of simulated intestinal digestion process

3 結論

本文利用體外胃腸道消化模型，比較3種不同表面修飾納米硒的穩定性和抗氧化活性變化，得出CGA@SeNPs經胃腸消化后，CGA@SeNPs結構和含量最穩定，與未消化的樣品相比，CGA@SeNPs在胃腸消化中抗氧化活性最好。本研究可進一步為納米硒在生物體內的研究提供理論依據。