響應面-主成分分析法優化大曲發酵藤茶工藝

徐靜宜，陳勝，譚燁，屈廷啟*

1(湖北工業大學 工程技術學院，湖北 武漢，430068)2(武漢黃鶴樓香精香料有限公司，湖北 武漢，430040)

藤茶是一種葡萄科植物的枝葉嫩芽，俗稱莓茶，主要分布于我國長江流域地區[1]。研究表明，藤茶富含黃酮、多糖、多酚、氨基酸等物質[2]以及多種香氣成分?，F代藥理學研究表明，藤茶具有調節肝臟、促進血液循環等功效，在抗氧化、抗菌[3]等方面具有顯著的藥理活性[4-5]，是近年來保健產品的新寵[6]。目前市場上用于飲用的藤茶，多為初加工后的藤茶物料，這類飲品“青氣”重，湯色渾濁，味道粗澀[7]，研究者們試圖通過改變發酵工藝，改善藤茶品質。潘利華等[8]通過改變新老葉莖比例來改善藤茶苦味重及回甘不明顯的問題。陳加勇等[9]將紅茶和綠茶與藤茶進行配比，改善了藤茶的風味。李翠朵[10]通過黑曲霉發酵藤茶，使其提取物中黃酮和多酚的含量增加。綜上，為進一步改善藤茶飲用的口感、增加風味，提高發酵藤茶中的黃酮、總酚、氨基酸等有益物質，本研究選取濃香型大曲對藤茶進行發酵。大曲作為中國高品質酒類常見的糖化發酵劑[11]，其代謝產物可生成風味物質及其前體，且在發酵過程中生成多種酸、醇類物質，對發酵產物口感的形成起著重要作用[12]。但是少有人將大曲應用于藤茶的發酵研究中，故探究大曲菌種在藤茶發酵中的應用很有必要，可為藤茶發酵后風味的改善提供參考。本試驗通過響應面-主成分分析法確定最佳發酵工藝的條件，以期為人們提供健康茶品。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藤茶(產地：湖北恩施地區)，黃鶴樓香精香料有限公司；中高溫大曲，黃鶴樓酒業有限公司。

55 mm 0.22 μ混合纖維素脂(水系)微孔濾膜，上海興亞凈化材料廠；80目篩、UPT-Ⅱ-20T超純水制備設備，成都超純科技有限公司；DK-S22型恒溫水浴箱、DUG-9246A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司；CP213型電子天平，國象斯儀器上海有限公司；STARTER3100型pH計，OHAUS；100 μL、200 μL、1 000 μL移液槍，邁德飛；752N型紫外分光光度計，上海佑科儀器儀表有限公司；超聲波清洗器，上海生析超聲儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 藤茶發酵工藝流程

藤茶→鹽漬→醋蒸→放涼→揉捻→變溫發酵→中溫烘焙

原料：黃鶴樓香精香料有限公司提供的來自于湖北恩施地區的優質藤茶。鹽漬：將藤茶放入質量濃度為2.0 g/L的鹽水中[13]，浸泡10 min。醋蒸：向蒸鍋中加入6 mL/L的陳醋，沸騰后將藤茶均勻分散于隔板上，持續加熱到大部分藤茶變為茶綠色時停止加熱，不開蓋悶至全部藤茶變色后放涼。揉捻：將放涼的藤茶放入捻茶機揉捻至茶條柔軟并保持其完整形態。變溫發酵：按照一定質量比例向藤茶中加入特制大曲及蔗糖，用適量水調配蔗糖溶液，使大曲活化，過濾后均勻混合于藤茶中，在合適的溫度和濕度下發酵36 h，為使系統中的大多數酶發揮作用，再將溫度調至60 ℃發酵12 h。中溫烘焙：將藤茶均勻鋪在烘箱中烘焙，待藤茶含水量為10%左右，散發清香揉搓可碎裂時，即烘焙完成。待藤茶回潮后密封保存。

1.2.2 評價過程

根據預試驗發現在該工藝操作中，烘焙溫度對藤茶品質的影響不可忽略，最終確定單因素試驗基本條件為：發酵濕度50%(以10%為梯度)，大曲接種量為3%(以1%為梯度)，初始糖度(質量分數)為5%(以1%為梯度)，烘焙溫度80 ℃(以5 ℃為梯度)，發酵溫度35 ℃(以5 ℃為梯度)；測定并記錄藤茶中總黃酮、總酚、還原糖、氨基酸、pH值及感官評價。經客觀權重賦權法(criteria importance though intercrieria correlation,CRITIC)對衡量各單因素的指標進行客觀賦權確定最優解，由響應面軟件的中心組合原理設計試驗，其中自變量為A(發酵溫度)、B(大曲接種量)、C(初始糖度)、D(發酵濕度)、E(烘焙溫度)，響應面的響應值為規范化綜合得分，根據理論最佳工藝確定實際最佳發酵參數。

1.3 品質評價的測定方法

1.3.1 總黃酮的測定

根據蘆丁濃度的變化繪制標準曲線，取過篩烘至恒重的藤茶粉1.000 g，參照亞硝酸鈉-硝酸鋁法[14]，利用超聲波清洗儀超聲輔助提取后進行測定。

1.3.2 總酚的測定

根據沒食子酸濃度的變化繪制標準曲線，按照Folin-Ciocalteu法[15]測定。

1.3.3 氨基酸的測定

參考GB/T 8314—2013《茶 游離氨基酸總量的測定》。

1.3.4 還原糖的測定

按照二硝基水楊酸法[16]進行測定。

1.3.5 pH的測定

利用pH計[17]進行測定。

1.3.6 藤茶感官評價

向湖北圣水茶廠有限責任公司送樣，參考GB/T 23776—2018《茶葉感官評審方法》進行評價。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果及分析

根據電子增強出版附圖1～附圖5(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.033290)的數據可知，以發酵參數為變量的指標測定結果與參考文獻研究結果相近。王嵐等[18]測定藤茶多酚含量為23.64 mg/g，李佳川等[19]發現藤茶中黃酮含量達40%，郭桂義等[17]測定一般優質茶葉的pH在6.2以上。

根據DIAKOULAKI等[20]提出的CRITIC法進行單因素結果分析。

(1)

(2)

(3)

(4)

(5)

式中：zij,無量綱處理后的樣本指標值；ci,綜合權重；m,指標個數；ωi,權重；zi,第i個指標的樣本均值；si,對比強度；n,樣本個數；dj,樣本綜合評價值；rij,指標i和j之間的相關系數；δi,沖突性。

根據表1和表2確定單因素最佳條件為發酵溫度37.5 ℃、大曲接種量3%、初始糖度5%、發酵濕度40%、烘焙溫度85 ℃。

表1 各單因素對發酵藤茶影響的各組權重Table 1 Weight fractions of each single factor affecting the fermentation of vine tea

表2 各單因素對發酵藤茶影響的各組權重后分數(di)Table 2 Weight fractions of each single factor affecting the fermentation of vine tea

2.2 響應面試驗結果及分析

2.2.1 響應面試驗結果

按照表3設計的變量因素水平完成Box-Behnken(Design-Expert 8.0.6)，共46個試驗點，根據自動生成的隨機順序進行試驗，探究5個變量對發酵藤茶中氨基酸、還原糖、黃酮、總酚、pH和感官評價的影響(表4)。

表3 響應面試驗因素水平表Table 3 Factors and levels table of response surface methodology

2.2.2 響應面試驗結果及分析

2.2.2.1 發酵藤茶主成分分析

對預先設定的6個評分指標，即感官評價、總酚、還原糖、pH、氨基酸和黃酮在SPSS 25中進行主成分分析，結果見表5。為滿足累計貢獻率>80%的原則[21]，提取前3個主成分，此時累計貢獻率達到81.999%，這3個主成分足以表征發酵藤茶的品質信息。

表5 藤茶發酵茶主成分的貢獻率及特征值Table 5 Contribution rate and characteristic value of principal components of fermentation vine tea

由表6可知，根據特征向量值的絕對值大小分析，感官品質評價、黃酮含量對第1主成分的影響相對較大，pH值、總酚含量對第2主成分的影響相對較大，還原糖含量、黃酮含量對第3主成分的影響較大。

表6 藤茶發酵茶的指標特征向量值Table 6 Index characteristic vectorial values of fermentation vine tea

為使響應面結果更加規范，需要將綜合得分Y進行規范化處理，按公式(6)計算，以解決6個指標之間存在的量級和單位上的差異。規范化綜合得分Z參考公式(7)，見表7。

表7 主成分得分及規范化綜合得分Table 7 Principal component score and standardized comprehensive score

(6)

(7)

式中：C,主成分的累積特征值；Fi,發酵藤茶各指標的規范化得分；Yi,主成分特征值；Ymin,Y的最小值；Ymax,Y的最大值。

2.2.2.2 規范化綜合得分的響應面分析

對6個因素及其對應的規范化綜合得分進行響應面模擬，多元回歸擬合模型方程如下。

Z=0.89+0.26A-0.050B+0.066C-0.014D+9.356E-003E+0.022AB-0.073AC+0.20AD-0.046AE+0.037BC+0.079BD-0.076BE+0.015CD-0.011CE-0.016DE-0.29A2-0.16B2-0.12C2-0.033D2-0.23E2

表8 回歸模型方差分析Table 8 Analysis of variance of regression model

2.2.3 驗證實驗

根據響應面分析軟件得出的理論工藝參數及指標為：發酵溫度39.57 ℃，初始糖度5.17%，大曲接種量3.21%，烘焙溫度79.32 ℃，發酵濕度50%，黃酮含量423.363 mg/g，總酚含量28.408 9 mg/g，氨基酸含量20.100 9 mg/g，還原糖含量111.303 mg/g，pH值為6.356 44，感官評價為85.905 5，規范化綜合得分1.024 2。經實際驗證得，該條件下發酵藤茶中黃酮含量為435.303 mg/g，總酚含量27.68 mg/g，氨基酸含量21.092 5 mg/g，還原糖含量110.875 mg/g，pH 6.32，感官評分90.50，與軟件預測的理論值基本一致，因此該模型的可以用于一定規模下的藤茶發酵。

3 結論

以常見酒類發酵劑濃香型大曲為菌種，湖北恩施的藤茶為原料，通過響應面主成分分析的方法優化發酵藤茶的工藝參數。為使經過驗證實驗的工藝參數可以應用于工業化生產，將參數調整為：發酵溫度39.6 ℃，大曲接種量3.2%，初始糖度5.2%，發酵濕度50%，烘焙溫度80 ℃。通過發酵參數的優化，增加了藤茶的風味物質，有效地保留藤茶中的活性成分，改善藤茶原本苦澀、回甘不明顯的弊端。優化后的藤茶，茶葉勻整凈度好，茶湯嫩黃明亮且伴有清香，回甘速度快且滋味甘鮮，葉底軟嫩、灰綠明亮。高于優質茶葉的感官評判標準。

利用大曲菌種對藤茶進行發酵的研究鮮有報道，該研究為改善藤茶飲品的風味、為藤茶的開發和利用提供參考。同時本文將CRITIC法與單因素分析結合起來，為單因素分析提供了更加規范的分析方法。