亞麻籽膠-乳清蛋白改性物的制備及抗氧化性

張志穎，張琳璐，白英*，王麗芳

1(內蒙古農業大學 食品科學與工程學院，內蒙古 呼和浩特，010018)2(內蒙古自治區農牧業科學院，內蒙古 呼和浩特，010031)

近來亞麻籽膠引起了人們的廣泛研究，亞麻籽膠(flaxseed gum, FSG)是一種親水膠體，具有良好的乳化性、凝膠性和抗氧化性等功能特性，還具有降血糖、降膽固醇和調節腸道菌群等生理功能，常作為食品配料添加到乳制品、肉制品和果凍制品等食品中來改善食品品質[1-2]。而傳統上亞麻子主要用作榨油，榨油副產物亞麻籽餅粕一般用作動物飼料或作為廢物處理，造成了很大的資源浪費。

乳清蛋白(whey protein, WP)是干酪加工過程中的副產品，廉價易得，具有良好的生物活性和功能特性，營養價值和安全性很高[3]。然而，其穩定性容易受到外部環境(pH值、鹽分、加熱等)的影響，為了解決這些問題，目前已有幾種提高穩定性的方法，其中糖基化改性法相比其他方法具有綠色、溫和、安全等優勢[4]。

糖基化反應是指碳水化合物通過共價鍵的形式與蛋白質結構中的α-或ε-氨基相結合的非酶促反應。反應中會產生還原酮、類黑精等產物，具有較顯著的抗氧化性[5]。近期研究顯示，此種改性方法可以提高WP抗氧化活性[6-7]，除此之外，還具有免疫調節能力、抗過敏及降血壓作用等[8]生物活性，對人體健康有一定積極意義。

目前，雖然關于WP的改性研究較多，如FAN等[9]將不同分子質量的葡聚糖與乳清分離蛋白進行糖基化并研究其理化性質；WANG等[10]分別將葡萄糖和果糖與WP進行美拉德反應并研究溫度和pH對其凝膠性、流變性等的影響，但與FSG結合的相關研究很少。本研究以FSG與WP為原料，采用濕法糖基化改性法制備亞麻籽膠-乳清蛋白產物(FSG-WP)，在單因素及正交試驗基礎上得出最佳制備條件，并探究FSG蛋白的脫除及不同FSG添加量對FSG-WP抗氧化能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

亞麻籽餅粕(冷榨)，內蒙古益善園生物科技有限責任公司；WP，恒天然合作社集團有限公司。

抗壞血酸，深圳樂芙生物科技有限公司；DPPH，上海源葉生物科技有限公司；ABTS，上海翌圣生物科技有限公司；2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid, TNBS)，北京偶和科技有限公司；十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate, SDS)、無水亞硫酸鈉、KBr(光譜純)等其他所用試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

Scientz-IID觸摸式超聲波細胞粉碎機，寧波新芝生物科技股份有限公司；T6-新悅可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；K9860全自動凱氏定氮儀，海能未來技術集團股份有限公司；TM4000掃描電鏡，日本株式會社日立高新技術那珂事業所；IRAffinity-1傅里葉變換紅外光譜儀，日本島津公司；熒光分光光度計，上海天美科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 FSG制備的操作要點

向原料中以料液比1∶175(g∶mL)加入蒸餾水，250 W超聲50 min,過300目濾布取上清液,旋轉蒸發進行濃縮然后加入4倍體積乙醇，醇沉12 h后6 000 r/min離心10 min取沉淀，沉淀復溶于5倍體積蒸餾水中，Sevag法除蛋白然后旋蒸除有機溶劑,透析12 h后冷凍干燥。

1.3.2 FSG-WP制備的操作要點[11]

稱取0.15 g WP與0.075 g FSG于45 mL蒸餾水中，調節反應pH、溫度與時間進行糖基化反應，反應完成后立刻置于冰水中以中斷反應并冷卻至室溫，10 000 r/min離心5 min，取上清液，抽濾后冷凍干燥。

1.3.3 接枝度測定[12]

取0.25 mL樣品于2 mL磷酸鹽緩沖液(pH 8.2，0.212 5 mol/L)中，混勻后加入1 mL質量分數0.01% TNBS溶液，于50 ℃水浴避光加熱反應30 min，加入2 mL的0.1 mol/L無水亞硫酸鈉終止反應，室溫下靜置15 min后，測定波長420 nm下的吸光值，接枝度根據公式(1)計算。

(1)

式中：A0，未反應時TNBS所測蛋白的自由氨基數；A，反應完成后TNBS所測蛋白的自由氨基數。

1.3.4 褐變指數測定

取2 mL亞麻籽膠溶液，加入2 mL混合試劑(含質量分數10%的SDS及0.05 mol/L硼砂)，在420 nm下測定吸光值，A420即為其褐變指數。

1.3.5 單因素試驗

當蛋白質分子中的游離氨基與多糖的羰基縮合時，游離態的氨基轉變為結合態，通過測定反應前后體系中游離氨基的含量，可以計算出游離氨基的變化，以反映糖基化反應的程度，故選擇接枝度作為指標以進行單因素及正交試驗。

以FSG-WP的接枝度為指標，分別調節反應pH值為8、9、10、11、12、13；反應溫度為90、100、110、120、130 ℃；反應時間為30、60、90、120、150、180 min進行糖基化反應。

1.3.6 正交試驗

以單因素試驗結果為基礎，選擇反應pH值、反應溫度、反應時間為3個因素，以FSG-WP的接枝度為指標，進行L9(33)正交試驗。

1.3.7 掃描電鏡(scanning electron microscopy, SEM)

樣品用導電雙面膠帶固定在樣品臺上，吹掉多余的粉末，觀察其表面微觀結構，掃描功率為10 kV。

1.3.8 傅里葉紅外光譜(Fourier transform infrared, FT-IR)

稱取1 mg樣品與100 mg KBr，研磨使其充分混合并壓片，在4 000～400 cm-1進行掃描，掃描64次，測定樣品前先進行KBr背景的紅外光譜測定。

1.3.9 熒光光譜

配制1 mg/mL樣品，對于熒光激發光譜，發射波長設定為420 nm，激發波長250～400 nm。對于熒光發射光譜，激發波長設定為280 nm，發射波長300～420 nm，狹縫為2.5 nm，掃描速度為240 nm/min[13-14]。

1.3.10 抗氧化能力測定

·OH清除能力參照王德才等[15]的方法測定；DPPH自由基清除能力參照VON等[16]的方法測定；總還原力參照軒滋等[17]的方法測定；ABTS陽離子自由基清除能力參照THAIPONG等[18]的方法測定。

1.4 數據處理及分析

用Excel 2010、Origin 2019b和SPSS 26進行作圖與數據分析。實驗結果均以平均值±標準差表示，采用單因素方差分析法進行顯著性差異分析，當P<0.05時，表示差異顯著。

2 結果與討論

2.1 亞麻籽膠基礎指標含量

原料亞麻籽餅粕水分含量(0.92±0.01)%、蛋白質含量(34.28±0.52)%、灰分含量(5.12±0.17)%、脂肪含量(0.61±0.04)%、膳食纖維含量(59.07±0.72)%。FSG蛋白含量32.44%，多糖含量57.01%。Sevag法脫除蛋白后的FSG蛋白含量26.03%，多糖含量64.50%。

2.2 糖基化反應的單因素及正交試驗

2.2.1 pH值對反應接枝度的影響

由圖1所示，pH值對反應的接枝度有顯著影響(P<0.05)。隨著pH值的增加，接枝度呈現先增加后降低的趨勢。可能原因是糖基化反應本質上為堿催化反應，故選取堿性環境有利于反應進行，但堿性過強會導致蛋白質的結構發生改變。因此本試驗選取pH 11進行反應。

圖1 pH值對FSG-WP接枝度的影響Fig.1 The influence of pH on the grafting degree of FSG-WP

2.2.2 反應溫度對反應接枝度的影響

如圖2所示，反應溫度對FSG-WP接枝度的影響顯著(P<0.05)，且隨反應溫度的增加先增高后降低，當溫度為100 ℃時，反應接枝度達到最大值，這可能是一定的熱處理使蛋白質分子中的ε-氨基基團暴露于表面，有利于FSG與其進行反應[19]，而溫度過高導致蛋白質分子之間發生聚集，不利于反應的進行，故接枝度降低。因此選取反應溫度為100 ℃進行試驗。

圖2 反應溫度對FSG-WP接枝度的影響Fig.2 The effect of reaction temperature on the grafting degree of FSG-WP

2.2.3 反應時間對反應接枝度的影響

由圖3可以看到，反應時間對FSG-WP接枝度的影響顯著(P<0.05)，接枝度隨著反應時間的增加先增高后降低，在反應時間為60～90 min，反應接枝度達到最大(P>0.05)。這可能是由于反應初期適當的加熱導致蛋白質分子結構伸展，FSG與WP逐漸結合，接枝度升高，但隨著受熱時間的增加，可能會導致色氨酸被破壞[20]，另外反應時間過長部分已接枝的結合物可能發生降解，導致接枝度降低。因此本試驗選取反應時間為60 min為宜。

圖3 反應時間對FSG-WP接枝度的影響Fig.3 Effect of reaction time on the grafting degree of FSG-WP

2.2.4 正交試驗結果

表1為各個因素的水平設定。由表2可知，空列(D因素)的極差值為4.44，A，B，C各因素的極差Rj值均大于空列極差值，可以看出A、B、C各因素的水平效應是存在差異的，說明試驗具有可靠性。3個因素主次關系為B(反應溫度)>C(反應時間)>A(pH值)，從9個處理組中可以直觀地找出最優水平組合為6組，即A2B3C1，接枝度為25.07%，而正交優化最佳水平組合也為A2B3C1，故得出最佳條件為pH 11、110 ℃、60 min。

表1 L9(33)正交設計因素水平表Table 1 Factors and levels table of orthogonal test

表2 正交試驗結果Table 2 Results of orthogonal experiment

2.3 掃描電鏡測定結果

圖4-a和4-b分別為WP與熱處理WP的微觀結構圖，其中熱處理WP是在與FSG-WP同等制備條件下處理制備得到的，可以看到WP為球狀，表面凹凸不平，而高溫使WP發生自凝聚，凝聚后的WP呈現片狀，表面相對平整光滑。由圖4-c可以看到，FSG呈立體的多網孔片狀結構，其孔洞的產生歸因于高超聲波能量及超聲處理可能會導致大量的空化氣泡，將大聚集體碎裂成小的顆粒，故FSG呈碎片狀。從圖4-d可以看到FSG-WP呈現出有嵌入、結合的結構狀態，且可以明顯觀察到FSG-WP的微觀表面結構較高溫后的WP呈更立體、有序排列的片型結構，這可能是WP與FSG反應后，結構發生改變，反應后的FSG-WP具有了部分FSG微觀表面的特征。

a-WP；b-熱處理WP；c-FSG；d-FSG-WP圖4 WP、熱處理WP、FSG、FSG-WP的微觀表面結構圖Fig.4 Scanning electron microscopy data of WP, heated WP, FSG, FSG-WP

2.4 紅外光譜測定結果

圖5 WP、FSG與WP的物理混合物、FSG-WP的紅外光譜圖Fig.5 FT-IR spectra of native WP,mixture,and FSG-WP conjugate

2.5 熒光光譜測定結果

已有研究表明，當蛋白質與多糖發生糖基化反應時會產生熒光物質，這些帶有熒光發色基團的產物是通過席夫堿和給電子基團之間的共軛反應形成的，可以作為糖基化反應發生的指標[22]。糖基化反應中產生的熒光物質的最大激發波長在340～370 nm，最大發射波長在420～450 nm。內源性熒光光譜可以用來反映芳香族氨基酸熒光強度的變化，通常是色氨酸的熒光發射被用作蛋白質構象變化的指示劑[23]，以此間接反映蛋白質三級結構的變化，進而反映糖基化反應的進行，天然蛋白質熒光的最大激發波長和最大發射波長分別為290和336 nm[13,22]。

由圖6-a可以觀察到，它們的熒光發射最大值(λmax)分別在328、334、340 nm。

a-熒光發射光譜；b-熒光激發光譜圖6 WP、熱處理WP、FSG-WP的熒光發射光譜與WP、FSG、FSG-WP的熒光激發光譜Fig.6 Fluorescence emission spectra of WP, heated WP, FSG-WP，and fluorescence excitation spectra of WP, FSG, FSG-WP

與WP相比，加熱后WP的最大熒光強度增加，這表明內部的色氨酸殘基在加熱處理后逐漸暴露在分子表面上。與WP相比FSG-WP的熒光強度降低，以前的研究也出現了類似的結果[7]，且其λmax向更高波長輕微偏移，這可能歸因于多糖鏈的屏蔽效應[24]。從圖6-b可以看出，所有樣品在290 nm左右具有最大激發波長，而FSG-WP在341 nm處具有另一個高峰，這表明FSG和WP之間形成了共價結合[25]。

2.6 FSG添加量及蛋白的脫除對產物接枝度及褐變指數的影響

考慮到FSG蛋白的脫除可能會對FSG-WP的形成有影響，故分別制備產物并進行比較。由圖7-a可以看到，隨著2種FSG添加量的增加其接枝度亦有不同程度增加。可能原因是當反應體系中FSG濃度增大，其與蛋白之間碰撞的幾率大大增加，促進反應的進行。當FSG和脫蛋白后的FSG與WP質量比為3∶1時，接枝度分別達到(40.56±0.51)%、(45.95±2.01)%，可能的原因是FSG脫除自身結合的蛋白分子后，暴露出更多的結合位點，有利于反應的進行。

a-接枝度；b-褐變指數圖7 不同FSG與WP質量比下FSG-WP的接枝度及褐變指數Fig.7 Grafting degree and browning degree of FSG-WP at different FSG and WP mass ratios

根據圖7-b所示，隨著2種FSG添加量的增加，其褐變指數均有不同程度增加，褐變指數升高的主要原因是底物濃度提高導致體系黏度增大、水分含量降低，這種情況下長時間受熱可能使焦糖化反應更加劇烈，顏色加深[20]。FSG-WP的褐變程度高于脫蛋白后的FSG-WP，蛋白的脫除減少了FSG-WP產物中褐色物質的產生，這種褐色物質為反應末期的產物類黑精，類黑精具有很強的抗氧化性[26]，故推測未脫蛋白的FSG-WP抗氧化能力更強。

2.7 FSG-WP抗氧化能力的測定與比較分析

2.7.1 FSG-WP抗氧化能力的測定

由圖8可以看出，隨著FSG添加量的增加，其3種自由基清除能力亦有不同程度增加，且皆在m(FSG)∶m(WP)=1∶1后增加趨勢減慢。FSG-WP清除·OH能力與清除DPPH自由基能力均高于脫蛋白后的FSG-WP，而清除ABTS陽離子自由基的能力基本一致。如圖9所示，FSG添加量對FSG-WP的總還原力有影響，且存在量效關系，總還原力隨FSG添加量增加而增加，其中脫除蛋白后的FSG-WP在FSG添加量達到200%后增加趨勢減緩，而未脫蛋白的FSG-WP在最高添加量為300%的范圍內均呈現較高的上升趨勢，可以看出FSG-WP的總還原力高于脫蛋白后的FSG-WP。

a-·OH清除活性；b-DPPH自由基清除活性；c-ABTS陽離子自由基清除活性圖8 FSG-WP的·OH、DPPH自由基、ABTS陽離子自由基的清除能力Fig.8 ·OH radical, DPPH radical, and ABTS cation radical scavenging ability of FSG-WP

圖9 FSG-WP的總還原力Fig.9 Reducing power of FSG-WP

2.7.2 抗氧化能力的比較分析

對WP、熱處理WP、脫蛋白前后的FSG和FSG-WP的抗氧化能力比較分析如圖10所示。

圖10 抗氧化能力比較Fig.10 Comparison of antioxidant capacity

對比WP與熱處理WP的抗氧化能力可知，熱處理WP的·OH、DPPH自由基、ABTS陽離子自由基清除率均高于WP，而總還原力低于WP。因熱處理后WP結構發生改變，形成聚合乳清蛋白，而聚合乳清蛋白已有研究證明其具有良好的持水力和穩定性等一系列性能[27]，FSG-WP的制備也是在高溫下進行，故將其與WP及FSG-WP改性物做對比，比較其抗氧化性能。熱處理的WP總還原力較WP低，FSG-WP的總還原力較FSG降低，脫蛋白后的FSG-WP總還原力較脫蛋白后的FSG降低，其原因可能是產物中的還原酮類物質因長時間的加熱被分解，導致產物總還原力下降，這與TAN等[28]研究結果相似。

分別對比脫除蛋白前后的FSG-WP與熱處理WP的抗氧化能力發現，2種FSG-WP的抗氧化能力均高于高溫處理WP，由此可見，脫蛋白前后FSG-WP抗氧化能力的升高是FSG與WP相互作用的結果，并非是WP或高溫處理下形成的聚合乳清蛋白單獨起作用。

對脫蛋白前后的FSG-WP的抗氧化能力進行分析，可以看到FSG-WP的·OH、DPPH自由基清除率、總還原力均高于脫蛋白的FSG-WP，ABTS陽離子自由基清除率低于脫蛋白FSG-WP，對脫蛋白前后FSG的抗氧化能力進行分析也得到同樣的結果。由此可以看出，產物與反應底物間的抗氧化能力有一定的聯系，底物的抗氧化能力可能決定了產物的抗氧化能力。這一結果也證實了上述推測。

對比FSG與脫蛋白FSG-WP的抗氧化能力發現，FSG的·OH、DPPH自由基清除率及總還原力均高于脫蛋白FSG-WP，ABTS陽離子自由基清除率低于脫蛋白FSG-WP。由此分析得出，將FSG進行脫蛋白后又通過糖基化反應引入外源蛋白質(WP)，所得產物抗氧化能力不及FSG，這可能與蛋白脫除過程中對膠體造成的某些破壞有關，也可能與引入蛋白質的種類有關，具體原因有待進一步研究。

綜合來看，本試驗制備的FSG-WP較反應底物FSG和WP而言，具有更好的抗氧化能力。與辛小麗等[11]制備的FSG-WP產物相比，本實驗制備的FSG-WP和脫蛋白后FSG-WP具有更好的清除DPPH自由基能力，這可能是由FSG原料來源、提取工藝或產物制備方法不同所導致的。

2.7.3 相關性分析

如表3所示，FSG添加量與FSG-WP接枝度、褐變程度和總還原力均呈極顯著正相關(P<0.01)，FSG添加量與清除·OH、DPPH自由基、ABTS陽離子自由基能力均呈顯著正相關(P<0.05)；FSG-WP接枝度與其褐變指數、總還原力、清除ABTS陽離子自由基能力呈極顯著正相關(P<0.01)。

表3 相關性分析Table 3 Correlation analysis

如表4所示，脫蛋白后FSG添加量與脫蛋白后FSG-WP接枝度、褐變程度、清除·OH能力、總還原力和清除DPPH自由基能力均呈極顯著正相關(P<0.01)，與清除ABTS陽離子自由基能力呈顯著正相關(P<0.05)；脫蛋白后FSG-WP接枝度與其褐變指數、清除·OH能力、總還原力和清除DPPH自由基能力均呈極顯著正相關(P<0.01)，與清除ABTS陽離子自由基能力呈顯著正相關(P<0.05)。以上結果進一步證實了2.7.2中的比較分析結果。

表4 相關性分析Table 4 Correlation analysis

3 結論

本研究旨在探討糖基化反應生成的FSG-WP的功能特性，以探索FSG與WP在食品工業中的潛在應用。在單因素及正交試驗的基礎上制備了FSG-WP產物，采用掃描電鏡、傅里葉紅外光譜與熒光分析結合接枝度測定證實了FSG-WP結合物的形成。抗氧化性比較分析可得，FSG抗氧化性高于脫蛋白后的FSG，與此相應，FSG-WP抗氧化性高于脫蛋白后的FSG-WP；FSG-WP較單一FSG和WP而言具有更好的抗氧化能力，這說明FSG與WP的成功結合增強了兩者的功能性質。進行相關性分析得到脫蛋白前后的FSG添加量與其產物的接枝度、抗氧化能力均呈正相關。本研究為開發擴大FSG和WP在食品中的應用提供了參考。