氧化應激對宰后初期牛肉嫩度的影響研究：基于蛋白質氧化和細胞凋亡途徑

黃琳琳，張一敏，董鵬程，梁榮蓉，王新怡，齊婷婷，羅欣，張新軍，郝劍剛，毛衍偉*

1(山東農業大學 食品科學與工程學院，山東 泰安，271018)2(國家肉牛牦牛產業技術體系中衛實驗站，寧夏 中衛，755000)3(國家肉牛牦牛產業技術體系烏拉蓋站，內蒙古 烏拉蓋，026321)

活性氧(reactive oxygen species，ROS)是細胞中廣泛分布的具有生理活性的代謝產物。正常情況下，動物體內的ROS處于動態平衡狀態，抗氧化防御系統調節體內ROS的產生和代謝[1]。動物屠宰后，由于機體內氧化還原穩態被破壞，ROS不斷積累，產生氧化應激，導致蛋白質氧化、細胞凋亡等一系列反應，影響肉的嫩度。有研究發現，氧化應激造成的蛋白質氧化可以通過增加蛋白質分子的交聯聚合，減弱鈣蛋白酶(calpain)活性等途經，影響骨架蛋白的降解，從而降低肉的嫩度[2]。CHEN等[3]發現高氧氣調包裝會導致豬背最長肌中發生氧化應激，蛋白質氧化程度增加，抑制μ-calpain的活性從而影響肌原纖維蛋白的降解，導致豬肉的嫩度降低。但同時有研究發現，高強度宰前應激導致羅非魚體內產生氧化應激，使魚肉的嫩度提高[4]。李孟孟[5]也發現氧化應激處理后的羊肉中細胞凋亡酶(caspase)活性和肌原纖維小片化指數顯著增加。CHEN等[6]通過體外實驗證明，氧化應激處理后的肌間線蛋白(desmin)的構象改變，更易被caspases降解。

目前氧化應激對肉嫩度的影響暫不明確，且多從蛋白質氧化或細胞凋亡等途徑單方面進行解釋。因此本實驗采用H2O2浸泡處理牛背最長肌，人為創造氧化應激條件，探究在牛肉宰后初期氧化應激途徑中蛋白質氧化和細胞凋亡的變化，并闡述其調控牛肉嫩度的機制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

本實驗隨機選取6頭20月齡飼養方式、生長環境一致的西門塔爾雜交閹割公牛(山東菏澤曹縣商都恒昌清真肉類有限公司，胴體質量約為360 kg，pH24為5.4～5.8)作為實驗樣本。

H2O2、三氯乙酸、2,4-二硝基苯肼(dinitrophenylhydrazine，DNPH)，天津凱通化學試劑有限公司；N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC)，上海麥克林生化科技有限公司；生理鹽水，辰欣藥業股份有限公司；BCA試劑盒，北京康為世紀生物科技有限公司；2,7-二氯二氫熒光素二乙酸酯(2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA)、desmin一抗，Sigma-Aldrich；EDTA、SDS、鹽酸胍、溴酚藍(bromophenol blue，BPB)，北京索萊寶科技有限公司；鈣測試盒(C004-2-1)，南京建成生物工程研究所有限公司；TUNEL檢測試劑盒、蛋白免疫印跡二抗，武漢賽維爾生物科技有限公司。

HH-4型數顯恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司；TA-XT2i型質構儀，英國Stable Micro System公司；JXFSTPRP-Ⅱ型冷凍研磨儀，中國凈信實業發展有限公司；5804R型高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；SpectraMax M5型酶標儀，美國Molecular Devices公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理

肉牛經商業流程屠宰后，在放血30 min內取左半胴體背最長肌，立即使用液氮冷凍約30 g肉樣作為0 h樣本，并將剩余肉樣迅速切分為2.5 cm厚的牛排(用于剪切力的測定)和1 cm×1 cm×0.5 cm大小均勻的肉塊，隨機分為3組。按照肉液比1∶1(g∶mL)，將肉樣分別浸泡在20 mmol/L H2O2(氧化應激組)、20 mmol/L NAC(ROS清除劑，抑制應激組)和0.9%的生理鹽水(對照組)中，在16 ℃下孵育至6 h后(避免冷收縮)，繼續在4 ℃下孵育至12、24、72和168 h。在相應時間點測定剪切力，將部分肉樣在質量分數4%多聚甲醛中固定，用于末端脫氧核苷酸轉移酶介導的缺口末端標記法(terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling，TUNEL)的測定，并留取約30 g肉樣在液氮冷凍后于-80 ℃保存，用于后續肌原纖維蛋白降解、蛋白質氧化等指標的測定。

1.2.2 ROS相對含量的測定

參考張玉林[7]的方法并稍作修改。將0.5 g肉樣加入5 mL Tris-HCl緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl，0.1 mmol/L EDTA-2Na，0.008 g/mL NaCl，10 mmol/L 蔗糖，pH 7.4)中，使用冷凍研磨儀研磨3次(4 ℃，45 Hz，每次45 s)，于4 ℃下4 000×g離心15 min收集上清液，并用BCA試劑盒測定蛋白濃度。將100 μL上清液與100 μL反應緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl，0.1 mmol/L EDTA-2Na，0.008 g/mL NaCl，10 mmol/L 蔗糖，15 μmol/L DCFH-DA，pH 7.4)混合，迅速用酶標儀測定0 min的熒光值。在37 ℃下孵育30 min后再次測定熒光值。ROS的相對含量按照公式(1)計算：

ROS相對含量/[熒光強度·(mg protein)-1]=

(1)

1.2.3 剪切力的測定

參考HOU等[8]的方法，將宰后0、1、3、7 d的牛排置于真空包裝袋中，牛排的中心部位插入溫度計，于80 ℃水浴加熱至中心溫度70 ℃，牛排在室溫下冷卻后放置于4 ℃過夜。用直徑為1.27 cm的空心取樣器沿著肌纖維方向取出肉柱(避開脂肪和筋腱)，使用質構儀測定肉柱的剪切力(測前速度2.0 mm/s；測中速度1.0 mm/s；測后速度5.0 mm/s；觸發力0.098 N；下壓距離23.0 mm；探頭類型：HDP/BSW)，牛排的剪切力值(N)為該牛排各個肉柱測定結果的平均值。

1.2.4 全蛋白質的提取

將0.5 g肉樣加入5 mL 10 mmol/L磷酸鹽緩沖液(含2% SDS，pH 7.0)中，使用冷凍研磨儀研磨3次(4 ℃，45 Hz，每次45 s)，于4 ℃下12 000×g離心20 min，上清液即為全蛋白提取物。用BCA試劑盒測定蛋白濃度后，用上述磷酸鹽緩沖液調整蛋白質濃度至10 mg/mL。將蛋白質溶液與等體積的上樣緩沖液(100 mmol/L Tris-base，4% SDS，20% 甘油，5 mmol/L EDTA，體積分數0.8% β-巰基乙醇，質量分數0.005% BPB，pH 7.0)充分混合，95 ℃金屬浴5 min，室溫冷卻后分裝樣品，-80 ℃儲存用于蛋白質免疫印跡的測定。

1.2.5 蛋白質免疫印跡

采用5%的濃縮膠和10%的分離膠進行電泳。濃縮膠恒壓90 V電泳30 min，分離膠恒壓120 V電泳至BPB跑至分離膠底部。凝膠在恒壓90 V冰浴轉印90 min，將目的蛋白轉印至聚偏氟乙烯(poly vinylidene fluoride，PVDF)膜上。轉印后將PVDF膜在含有5%脫脂奶粉的洗膜緩沖液(tris buffered saline tween,TBST)(20 mmol/L Tris-base，137 mmol/L NaCl，5 mmol/L KCl和0.1% 吐溫-20)中室溫封閉1.5 h。desmin一抗按體積比1∶500用TBST稀釋，將封閉后的膜置于一抗溶液中，在搖床上4 ℃孵育過夜。孵育結束后用TBST溶液洗膜3次，每次10 min。之后將膜放入用TBST稀釋的二抗溶液(1∶5 000)中室溫孵育1.5 h，再用TBST溶液洗膜3次，每次10 min。將ECL顯影液避光與膜反應2 min，用凝膠成像儀拍照觀察。

1.2.6 蛋白質羰基含量及表面疏水性的測定

將0.5 g肉樣加入5 mL試劑Ⅰ(100 mmol/L Tris-base，10 mmol/L EDTA，pH 8.3)中，使用冷凍研磨儀研磨3次(4 ℃，45 Hz，每次45 s)，于4 ℃下13 000×g離心40 min后倒掉上清液。向沉淀中加入5 mL試劑Ⅱ(20 mmol/L 磷酸鹽緩沖液，0.6 mol/L NaCl，pH 6.5)，研磨2次(4 ℃，35 Hz，每次30 s)，于4 000×g下離心10 min，上清液即為肌原纖維蛋白提取物，并用BCA試劑盒測定蛋白濃度。

蛋白質羰基含量的測定參考SOYER等[9]的方法并稍作修改。取3份肌原纖維蛋白各30 μL，2份作為實驗組各加入1 mL 10 mmol/L DNPH溶液(2 mol/L HCl溶液溶解)，1份作為對照組加入1 mL 2 mol/L的HCl溶液。混勻后置于37 ℃避光反應1 h，反應期間每隔20 min取出樣品振蕩混勻。反應結束后，實驗組和對照組各加入0.5 mL質量分數20%的三氯乙酸溶液，混勻后于4 ℃下10 000×g離心15 min。沉淀用1 mL無水乙醇和乙酸乙酯的混合液(1∶1，mL∶mL)于4 ℃下12 000×g離心洗滌10 min，重復洗滌步驟3次并吹干。將洗滌后的沉淀溶解在1.5 mL 6 mol/L的鹽酸胍溶液(試劑Ⅱ溶解)中，于370 nm處測定吸光度。蛋白質羰基含量(nmol/mg protein)使用摩爾吸光系數22 000 M-1cm-1計算。

蛋白質表面疏水性的測定參考CHELH等[10]的方法并稍作修改。用試劑Ⅱ調整肌原纖維蛋白的濃度至3 mg/mL，取2份1 mL肌原纖維蛋白溶液作為實驗組，并以試劑Ⅱ作為對照組，各加入200 μL 1 mg/mL的BPB溶液，混勻后室溫反應15 min。反應結束后，于4 ℃下5 000×g離心15 min。用試劑Ⅱ將上清液稀釋10倍后于595 nm處測定吸光值，以結合態BPB作為蛋白質表面疏水性指數，結合態BPB按照公式(2)計算：

(2)

1.2.7 肌漿內Ca2+濃度的測定

參考POMPONIO等[11]的方法并稍作修改。稱取2 g肉樣，切碎后在冰上孵育20 min，于4 ℃下13 000×g離心30 min收集肌漿上清液，并用雙縮脲法測定蛋白濃度。用鈣測試盒(C004-2-1)檢測肌漿內Ca2+濃度。取10 μL肌漿上清液與250 μL檢測工作液混勻，靜置5 min后立即在610 nm處測定吸光值，同時以1 mmol/L的鈣標準液作為標準(C標準)，以去離子水作為空白。肌漿內Ca2+濃度按照公式(3)計算：

肌漿內Ca2+濃度/(mmol·g-1)=

(3)

1.2.8 細胞凋亡率的測定

根據TUNEL檢測試劑盒方法進行測定。對4%多聚甲醛溶液中固定的肉樣進行石蠟包埋、切片、脫蠟處理。將切片浸于1×PBS緩沖液(pH 7.4)中漂洗3次，每次5 min。向切片上滴加蛋白酶K工作液覆蓋組織，37 ℃反應20 min；使用1×PBS浸洗。向每個切片上滴加破膜液(0.1% triton)覆蓋組織，常溫下孵育20 min；使用1×PBS浸洗。切片稍甩干后滴加緩沖液覆蓋組織，常溫下孵育10 min。根據組織切片大小滴加適量反應液至覆蓋組織，切片于濕盒內37 ℃孵育2 h；孵育結束后再次浸洗。切片稍甩干后滴加4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染液，避光室溫孵育10 min；再次浸洗。用抗熒光淬滅封片劑封片，切片于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.3 數據處理

使用Quantity One 4.6.2軟件對蛋白質免疫印跡條帶進行分析，使用Image-Pro Plus 6.0軟件對TUNEL結果中的熒光細胞進行計數，使用SAS 9.0軟件中的混合模型對數據進行方差分析，使用Origin 2018軟件進行繪圖。試驗結果采用平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 氧化應激處理對牛肉宰后初期ROS相對含量的影響

ROS作為細胞內重要的信號因子，廣泛參與細胞凋亡信號傳遞等生理生化過程。動物屠宰后，機體內抗氧化防御系統的能力逐漸降低，機體不能及時清除ROS而造成其不斷積累，導致氧化應激水平增加。

如圖1所示，在整個實驗過程中，與對照組相比，氧化應激組的ROS相對含量顯著升高(P<0.05)，抑制應激組的ROS相對含量顯著降低(P<0.05)，說明H2O2處理顯著提高了宰后牛肉細胞內的氧化應激水平，而ROS清除劑NAC處理顯著抑制了細胞內的氧化應激水平。氧化應激組的ROS相對含量隨著宰后時間的延長而不斷增加，在宰后6～24 h增長趨勢較為平緩；抑制應激組的ROS相對含量在宰后6 h顯著下降(P<0.05)，在宰后12～24 h內變化不顯著(P>0.05)；同樣，對照組的ROS相對含量在宰后6～24 h內變化不顯著(P>0.05)。與本研究結果相似，張玉林[7]也發現在鵝肉早期成熟過程中ROS相對含量變化不顯著，NAC處理導致鵝肉早期成熟過程中ROS相對含量顯著下降。這可能是由于宰后早期，肌肉細胞中的抗氧化物質仍在發揮作用，清除了部分ROS，在一定程度上減緩了氧化應激的進程，而隨著宰后成熟時間的延長，機體抗氧化防御系統被耗盡，氧化應激程度顯著增加。

圖1 氧化應激處理對牛肉宰后初期ROS相對含量的影響Fig.1 Effect of oxidative stress on ROS relative content of beef in early postmortem注：a～e表示同一處理方式不同貯藏時間差異達到顯著水平(P<0.05)；x～z表示同一貯藏時間不同處理方式差異達到顯著水平(P<0.05)

2.2 氧化應激處理對牛肉宰后初期剪切力的影響

由表1可以看出，貯藏時間與處理方式對剪切力無交互作用(P>0.05)，但處理方式與貯藏時間的主效應分別影響顯著(P<0.05)。牛肉剪切力值呈現先上升后下降的趨勢，在宰后1 d達到最大值(107.31 N)。氧化應激組的剪切力值顯著低于抑制應激組(P<0.05)，在宰后成熟第3天和第7天，氧化應激組的剪切力值分別是抑制應激組的83.32%和87.97%，說明H2O2處理引起的氧化應激顯著加快了牛肉宰后成熟過程中的嫩化速度。與本研究結果相似，WANG等[12]也發現H2O2處理后的牦牛肉剪切力值顯著降低，并證明氧化應激可以通過激活細胞線粒體凋亡通路，增強caspase的活性，進而提高嫩度。

表1 氧化應激處理對牛肉宰后初期剪切力的影響Table 1 Effect of oxidative stress on Warner-Bratzler shear force of beef in early postmortem

2.3 氧化應激處理對牛肉宰后初期desmin降解程度的影響

Desmin作為重要的肌原纖維蛋白，是嫩度的標志蛋白之一，其降解是肉宰后成熟過程中嫩化的必要條件[13]。SMUDER等[14]研究發現，肌原纖維蛋白暴露在不同程度的H2O2氧化條件下，都不會自發的降解，表明肌原纖維蛋白的降解程度并不依賴于H2O2處理的直接作用。從圖2和表2中可以看出，desmin在宰后前6 h的降解程度變化不顯著(P>0.05)，而后降解程度隨著成熟時間的延長而不斷增加。

圖2 氧化應激處理對牛肉宰后初期desmin降解程度的影響Fig.2 Effect of oxidative stress on the degradation of desmin of beef in early postmortem注：H2O2表示氧化應激組，NAC表示抑制應激組，Control表示對照組(下同)

表2 氧化應激處理對牛肉宰后初期desmin降解程度的影響Table 2 Effect of oxidative stress on the degradation of desmin of beef in early postmortem

與抑制應激組相比，氧化應激組desmin的降解程度顯著增加(P<0.05)，表明氧化應激處理導致肌原纖維蛋白降解程度增加，從而加速了牛肉的嫩化進程。與剪切力值結果相一致，這也表明氧化應激處理加速肌原纖維降解是牛肉嫩化加速的主要原因。

2.4 氧化應激處理對牛肉宰后初期蛋白質羰基含量及表面疏水性的影響

羰基含量的增加是蛋白質氧化最顯著的變化之一，是檢測蛋白質氧化最常用的指標。蛋白質表面疏水性在維持蛋白質三級結構方面起著重要作用，當蛋白質被氧化時，其構象發生改變，蛋白質分子內被包埋的疏水基團暴露，導致表面疏水性增加[15]。

如表3所示，3個處理組的蛋白質羰基含量和表面疏水性均隨著成熟時間的延長而不斷增加，但在宰后6～12 h變化不顯著(P>0.05)，與ROS相對含量相對應。氧化應激組與其他2組相比，蛋白質羰基含量和表面疏水性顯著升高(P<0.05)，表明氧化應激處理顯著提高了牛肉宰后成熟過程中蛋白質氧化水平，導致蛋白質構象改變。與本研究結果相似，崔文斌等[16]發現隨著H2O2處理濃度的增加，牦牛肉肌原纖維蛋白氧化應激水平增加，蛋白質羰基含量也隨之增加。張玉林等[17]研究發現色氨酸殘基具有很強的疏水性，H2O2處理會促使色氨酸殘基從被包埋狀態中暴露出來，從而增加蛋白質的表面疏水性。

表3 氧化應激處理對牛肉宰后初期蛋白質羰基含量及表面疏水性的影響Table 3 Effect of oxidative stress on protein carbonyl content and surface hydrophobicity of beef in early postmortem

MALHEIROS等[18]研究發現安格斯雜交牛的嫩度與氧化應激造成的蛋白質氧化程度呈正相關關系，推測ROS導致的氧化應激會在細胞凋亡過程中誘導產生caspase，caspase與calpain協同降解肌原纖維蛋白，且蛋白質氧化修飾會使肌原纖維蛋白更易被蛋白酶識別降解。FU等[19]也研究發現，體外氧化后的肌球蛋白氧化位點暴露，更容易被μ-calpain和caspase-3降解。因此，氧化應激引起的氧化修飾，以及構象改變導致蛋白質分子部分展開、酶解位點暴露，可能會使肌原纖維蛋白的酶水解敏感性更高，從而加速嫩化過程。

2.5 氧化應激處理對牛肉宰后初期肌漿內Ca2+濃度及細胞凋亡率的影響

Ca2+是細胞凋亡的始動信號分子，其濃度的變化與細胞凋亡密切相關。ROS造成的氧化應激能夠破壞細胞膜、線粒體膜以及內質網等細胞器，使細胞外Ca2+內流，肌漿內Ca2+濃度增加，導致線粒體鈣超載，線粒體膜通透性增加，進而釋放細胞色素c和凋亡因子，誘導caspase級聯反應，最終導致細胞凋亡[20]。

圖3中，藍色熒光和綠色熒光總數為總細胞數，綠色熒光為凋亡細胞數，細胞凋亡率即為凋亡細胞數/總細胞數。如表4所示，隨著成熟時間的延長，肌漿內Ca2+濃度及細胞凋亡率顯著增加(P<0.05)，在宰后168 h，細胞凋亡率達到44.02%。與對照組相比，氧化應激組的肌漿內Ca2+濃度及細胞凋亡率顯著增加(P<0.05)，而抑制應激組的肌漿內Ca2+濃度及細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。在宰后成熟過程中，氧化應激組的細胞凋亡率相比于抑制應激組增加了29.10%，相比于對照組增加了15.62%，表明氧化應激處理顯著提高了牛肉宰后成熟過程中細胞凋亡程度。與本研究結果相似，趙培等[21]研究發現，H2O2處理會使小鼠胚胎細胞內Ca2+濃度顯著增加，H2O2可通過Ca2+穩態失調誘導細胞凋亡。

表4 氧化應激處理對牛肉宰后初期肌漿內Ca2+濃度及細胞凋亡率的影響Table 4 Effect of oxidative stress on Ca2+ concentration in sarcoplasm and apoptosis rate of beef in early postmortem

圖3 氧化應激處理對牛肉宰后初期細胞凋亡率的影響Fig.3 Effect of oxidative stress on cell apoptosis rate of beef in early postmortem

通常認為，細胞凋亡可從Ca2+信號傳導、caspase激活等方面高度參與宰后初期肌肉的嫩化過程[22]。研究發現，牦牛的3個部位肉在宰后成熟過程中剪切力值與細胞凋亡率均呈極顯著相關關系(P<0.001)，隨著細胞凋亡率的增加，剪切力值不斷下降，牦牛肉的嫩度提高[23]。DANG等[24]抑制僵直前牛背最長肌中線粒體對鈣的攝取，導致肌漿內Ca2+濃度升高，細胞凋亡增加，牛肉嫩度提高。周昌瑜等[25]向宰后鵝胸肉中注射CaCl2，發現處理組中的caspase-3以及calpain活性顯著升高，同時肌原纖維蛋白降解程度顯著增加，剪切力值顯著降低，推測CaCl2注射增加了肌漿內Ca2+濃度，激活了內源酶活性，促進肌原纖維蛋白的降解，進而提高了嫩度。

3 結論

蛋白質氧化和細胞凋亡是牛肉宰后氧化應激過程中不可避免的變化，且都與嫩度相關。本研究結果表明，在宰后早期階段，牛肉細胞內留存的抗氧化物質仍會發揮一定作用，清除了部分ROS，進而延緩了蛋白質羰基含量、表面疏水性和肌漿內Ca2+濃度的升高。與對照組和抑制氧化應激處理組相比，氧化應激處理使蛋白質羰基含量與表面疏水性顯著增加，表明蛋白質氧化程度增加；肌漿內Ca2+濃度顯著上升，造成鈣穩態失衡，細胞凋亡率顯著升高，表明細胞凋亡程度增加；同時desmin降解程度增大，剪切力值降低，牛肉的嫩度增加。因此，相比于蛋白質氧化對嫩度造成的不利影響，氧化應激對肌原纖維蛋白的氧化修飾和對蛋白質構象的改變可能會暴露更多的酶切位點，而氧化應激造成Ca2+穩態失衡導致細胞凋亡，可能會誘導caspase級聯反應并通過與calpain協同作用等途徑，促使肌原纖維蛋白降解，進而加速了牛肉宰后成熟過程中嫩化的進程。然而蛋白質氧化和細胞凋亡通路錯綜復雜，蛋白質氧化和細胞凋亡共同影響嫩度的具體通路還需要進一步研究。