穩定同位素內標的液相色譜串聯質譜法測定乳制品中唾液酸的含量

何姝，曹晶

(上海師范大學 化學與材料科學學院，上海，200234)

唾液酸(sialic acid, SA)是指一類含9個碳原子的羧基化單糖酰化衍生物(圖1)。由于在大部分哺乳動物組織中N-乙酰神經氨酸(N-acetylneuraminic acid, Neu5Ac)是SA的主要存在形式，因此通常將SA稱為Neu5Ac[1-3]。研究表明SA具有抗炎、抗病毒、抗菌和抗腫瘤等生物學作用[4]，也有研究表明SA是一種腦部營養素，能促進嬰幼兒大腦發育、增強學習和發育能力[5]。母乳是嬰兒營養的主要來源，其中含量豐富的SA和幼兒早期的神經系統發育、抵抗力密切相關。目前，多以牛乳和羊乳為基礎的嬰幼兒奶粉來作為母乳的替代品，然而有研究表明牛乳和羊乳中含有的SA遠遠不如母乳[6-7]，所以國內外市場已將奶粉中SA的含量作為接近母乳的一個重要參數，通過在奶粉或者牛奶中添加SA，使其更接近母乳SA含量，有利于促進嬰兒早期的認知發育。因此，定量奶制品尤其是嬰幼兒奶粉中SA的含量可以為乳制品的生產質量把控和質量鑒定提供技術支持。

圖1 唾液酸的基本結構Fig.1 Basic structure of sialic acid*表示主要形式

目前，測定SA含量的方法主要有分光光度法[8-11]、高效液相色譜法[12-14]、氣相色譜法[15]、核磁法[16]、酶聯免疫分析[17]和液相色譜-質譜聯用法[18-20]及其他方法[21]。其中分光光度法、色譜法和核磁法的靈敏度不高、定量準確性不高。酶聯免疫法靈敏度高，但其成本較高，操作方法較為復雜，線性范圍較窄。而液相色譜串聯質譜法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)因質譜靈敏度較高，且具有分離鑒定同時進行的優點，無需衍生就可以對復雜樣品中的SA進行定性定量。目前，已有研究者采用LC-MS/MS法測定乳制品中SA的含量[18-20]，但這些研究均采用外標定量法，其定量準確性受基質效應限制。穩定同位素內標定量法因同位素標記的化合物在理化性質上與待測化合物有很大的相似性，可以有效地消除基質干擾效應。目前該方法作為LC-MS/MS定量的金標準方法被廣泛地應用于環境、食品、臨床、檢測等分析領域。然而，采用基于穩定同位素內標的LC-MS/MS法定量乳制品中的SA的研究尚未報道。因此，在本研究中使用穩定同位素標記的化合物13C123-SA作為同位素內標，開發了一種基于穩定同位素內標的LC-MS/MS法，用于準確定量乳制品中的SA的含量。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

Ultivo高效液相色譜三重四極桿質譜聯用儀，MassHunterC1.1數據處理軟件，美國Agilent公司；電子分析天平，賽多利斯科學儀器；超聲波水浴，寧波新芝生物科技股份有限公司；恒溫混勻儀，上海凈信實業發展有限公司；移液槍、漩渦振蕩器、臺式離心機，美國Thermo公司；Millipore超純水凈化器，美國MILLIPORE公司。

1.2 樣品與試劑

嬰幼兒奶粉、奶酪、酸奶、鮮牛奶、脫脂高鈣奶粉、全脂高鈣奶粉，市售；乙酸銨(LC-MS級，99%)，北京百靈威科技有限公司；乙酸(LC-MS級，99.5%)，東京化成工業株氏會社；甲酸(LC-MS級)、乙腈(LC-MS級，99%)，賽默飛公司；唾液酸標準品(99%)，Adamas-beta公司；[1,2,3-13C3]-N-乙酰基-D-神經氨酸,上海甄準生物科技有限公司；試驗用水均為超純水。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準溶液的配制

精確稱取SA標準品14 mg，用超純水溶液配制成1 mg/mL的標準儲備液，于-20 ℃下儲存備用。

將5 mg的SA同位素標準品用超純水溶液配制成1 mg/mL的內標標準儲備液，于-20 ℃下儲存備用。

混合內標標準工作液的制備：準確移取一定量的標準儲備液和內標標準儲備液用體積分數0.05%甲酸水溶液逐級稀釋成質量濃度5、2.5、0.5、0.25、0.05、0.025、0.012 5 μg/mL的唾液酸標準工作液，其中內標濃度均為0.25 μg/mL，于4 ℃下儲存備用。

1.3.2 樣品前處理

取供試品樣品，精密稱取20 mg(精確至0.000 1 g)于離心管中，加入1 mL體積分數50%的乙酸(pH 2)溶液，混勻振蕩，水浴超聲5 min，使其充分溶解。在恒溫混勻儀中80 ℃反應2 h，水解后冷卻至室溫，15 000 r/min下離心10 min(×2)。離心后取上清液稀釋1 000倍，其中加入同位素內標工作液使其濃度和標準工作液內標一致為0.25 μg/mL。接著用10 kDa的超濾管14 000×g離心10 min，過0.22 μm的有機濾膜，上機待測。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18(50 mm×2.1 mm,1.8 μm)；柱溫40 ℃；流速為0.3 mL/min，進樣量1 μL；以含體積分數0.05%甲酸水溶液為流動相A，以含體積分數0.05%甲酸的乙腈為流動相B，按照體積比進行梯度洗脫:0.0～1.0 min，3% B；1.0～2.5 min，3%～80% B；2.5～4.0 min，80% B；4.0～8.0 min，80%～90% B；8.0～10.0 min，90%～3% B。

1.3.4 MS條件

電噴霧模式(electronic spray ionization, ESI)：負離子模式(ESI-)；質譜掃描方式：多重反應監測(multiple reaction monitoring, MRM)；毛細管電壓3 000 V，噴嘴電壓500 V；鞘氣流量11.0 L/min；鞘氣溫度325 ℃；霧化器壓力30 psi；干燥器溫度250 ℃；干燥器流量7 L/min；MRM參數見表1。

表1 唾液酸及其內標在MRM模式下的主要質譜參數Table 1 Main mass spectrum parameters of sialic acid and its internal standard in MRM mode

2 結果與討論

2.1 質譜條件的選擇和優化

由于唾液酸1號碳上的羧基使得唾液酸分子帶負電荷，推測ESI-較ESI+模式更利于SA檢測，因此本研究嘗試了用ESI-和ESI+2種模式對0.5 μg/mL的唾液酸標準液和內標標準液進行母離子全掃描，結果表明較ESI+模式，ESI-模式下母離子豐度更高，且背景干擾峰較少，因此本實驗選擇ESI-模式檢測。在ESI-模式下，對所選定的母離子進行子離子掃描，最終選擇含量較高的子離子m/z87和子離子m/z90為定量離子，子離子m/z170和子離子m/z173為定性離子，最后在ESI-模式下優化電壓，碰撞能量等質譜參數，最大程度地提高了檢測的靈敏度。優化后的MRM質譜參數見表1，唾液酸標準液和內標標準液的子離子質譜圖見圖2。

a-SA;b-iSA圖2 SA和iSA的子離子掃描圖Fig.2 Product ion scan diagrams of SA figure and iSA figure

在使用LC-MS/MS法檢測樣品中唾液酸時，唾液酸的響應會受到樣品基質的影響，導致響應信號被抑制，因此使用外標法定量不準確。基于此，選擇了[1,2,3-13C3]-N-乙酰基-D-神經氨酸作為內標，在預處理之前加入待測樣品中，由于[1,2,3-13C3]-N-乙酰基-D-神經氨酸具有與SA相同的化學結構和性質，并且它們具有相同的穩定性、色譜保留、質譜響應和斷裂模式，因此它們的特異性和靈敏檢測可以通過質譜在MRM模式下基于它們的m/z值的差異來獲得(圖3)，因此可以校正由基質響應所帶來的干擾，實現了高靈敏度和精確定量。結果表明，選用穩定同位素內標既降低了基質效應又能校正樣品前處理過程的誤差。

a-SA的色譜圖；b-iSA的質譜圖圖3 SA和iSA的MRM色譜圖和質譜圖Fig.3 MRM chromatograms and mass spectra of SA figure and iSA figure

2.2 色譜條件的選擇和優化

2.2.1 色譜柱的選擇

通常選擇C18色譜柱分離樣品，鑒于唾液酸的高親水性，本研究比較了Poroshell 120 HILIC Column (150 mm×2.1 mm,2.7 μm)和Eclipse Plus C18 Column (50 mm×2.1 mm,1.8 μm)這2種色譜柱。結果表明選用HILIC色譜柱分離效果欠佳，峰形有明顯拖尾。而C18色譜柱分離效果較好，峰形較好，無嚴重的拖尾現象。故本實驗最終選擇C18色譜柱來進行分離(圖4)。

a-HILIC；b-C18圖4 HILIC (150 mm) column、C18 (150 mm) column的MRM色譜圖Fig.4 MRM chromatogram of HILIC (150 mm) column figure and C18 (150 mm) column figure

2.2.2 流動相條件的優化

由于唾液酸的極性較大，通常使用乙腈和水作流動相，在流動相中有無添加劑也會影響峰的強度和峰形，因此研究了在水中加入乙酸銨和甲酸對峰的影響。使用C18色譜柱在負離子模式下對5 mmol/L的乙酸銨水溶液/乙腈、體積分數0.05%甲酸的水溶液/0.05%甲酸的乙腈溶液2種流動相進行篩選，并篩選最優梯度洗脫。結果表明流動相含有甲酸時，SA響應較好，峰形較好(圖5-b)。為縮短檢測時間以更好地滿足快速檢測的要求，最終選擇了50 mm的同類型C18色譜柱用于后續樣品的測定(圖5-c)，最優洗脫梯度為0.0～1.0 min，3%B；1.0～2.5 min，3%～80%B；2.5～4.0 min，80%B；4.0～8.0 min，80%～90%B。

a-5 mmol/L乙酸銨水溶液；b-0.05%甲酸水溶液(150 mm)；c-0.05%甲酸水溶液(50 mm)圖5 5 mmol/L乙酸銨水溶液、0.05%甲酸水溶液(150 mm)和0.05%甲酸水溶液(50 mm)的流動相的優化Fig.5 Optimization of mobile phase of 5 mmol/L ammonium acetate aqueous solution figure and 0.05% formic acid aqueous solution figure

2.3 樣品前處理的優化

乳制品中除了游離的SA，更多的是與蛋白質結合的SA，乳制品成分復雜，含有大量乳糖、半乳糖、低聚糖等碳水化合物復雜基質，這使得奶粉中唾液酸的檢測極具挑戰性[23]，故需要對樣品進行水解以釋放唾液酸。唾液酸的水解有2種：酶水解、酸水解。由于酶水解需要溫和的條件，水解不完全。本研究采用酸水解法，目前已報道硫酸、磷酸、三氟乙酸、鹽酸等酸解條件[3,22-23]，但硫酸、磷酸等無機酸與質譜不兼容。考慮到與質譜的兼容性，本研究考察了乙酸和甲酸，結果表明相較甲酸，乙酸的水解效果更好，能較好地將唾液酸游離出來，故本研究選擇50%的乙酸(pH 2)作為水解酸。

由于奶粉樣品中含有許多蛋白質、脂質等大分子，這就需要對所得到的唾液酸粗品進行預分離純化。樣品經0.22 μm的有機濾膜過濾后，選擇用超濾法(10 kDa超濾膜)進行分離純化，以除去樣品中雜質和大分子。用超濾法預分離純化樣品，不僅操作簡單，唾液酸的損失較小。

2.4 方法學驗證

2.4.1 標準曲線、檢出限與定量限

SA標準品系列濃度為0.0125、0.025、0.05、0.25、0.5、2.5、5 μg/mL，同位素內標質量濃度為0.25 μg/mL。以SA標準品的濃度(X)為橫坐標，對應的SA標準品與同位素內標峰面積的比值(Y)為縱坐標繪制標準曲線。結果顯示在0.0125～5 μg/mL線性良好，相關系數(R2)為0.999 9。以信噪比S/N(signal to noise ratio)≥10計算方法的定量下限為1.6 ng/mL,S/N≥3計算方法的檢出限為0.4 ng/mL。該方法的靈敏度足以滿足乳制品中SA的檢測要求。

2.4.2 加標回收率與相對標準偏差

精密稱取已知唾液酸含量的樣品20 mg，按照先前建立的方法處理后進行測定。依次在原含量樣品的基礎上分別添加0.025、0.25、2.5 μg/mL的唾液酸標準品溶液，在優化實驗條件下，每個加標水平平行進樣6次，計算加標回收率，結果如表2。該方法的平均回收率(n=6)為76%～96%。相對標準偏差(relative standard deviation, RSD)分別為0.6%～6.35%，有較高的回收率。

表2 乳制品中唾液酸的加標回收實驗Table 2 Labeled recovery experiment of sialic acid in the dairy products

2.4.3 精密度、重復性、穩定性

取200 μL含有內標的唾液酸標準液(質量濃度0.5 μg/mL)，重復進樣6次，RSD為2.71%，精密度良好。同一樣品和標品檢測數據的日間和夜間平行性很好(RSD≤4.30%)，表明唾液酸標準品在24 h內穩定(表3)。

表3 唾液酸標準品穩定性Table 3 Stability of sialic acid standard

2.5 樣品測定

應用本實驗所建立的方法對超市中售賣的嬰幼兒奶粉、高鈣奶粉及其他奶制品進行SA定量檢測，測定結果如表4所示。

表4 樣品中SA的含量Table 4 Content of SA in the samples

3 結論

本文建立了基于穩定同位素內標高效液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)定量乳制品中SA含量的方法，該方法重現性和精密度良好，試劑用量少，操作簡單，無需衍生，避免了復雜的樣品前處理過程。并且由于穩定同位素內標的引入極大地降低了復雜樣品中基質的干擾，因此，該方法可準確地測定嬰幼兒配方奶粉及其他奶制品中SA的含量，為乳制品的生產質量把控和質量鑒定提供有力和有效的手段。