D-阿洛酮糖生物合成研究進展

溫鑫，寧宇航，劉光文，Mesfin Angaw Tesfay，林建強,2*，任一林，林慧彬，宋欣，林建群

1(微生物技術國家重點實驗室(山東大學)，山東 青島，266237)2(山東金宸生物科技有限公司，山東 濟南，250031)3(濟南稀有糖生物技術有限公司，山東 濟南，250000)4(青島龍鼎生物技術有限公司，山東 青島，266108)5(山東省中醫藥研究院，山東 濟南，250014)

糖是一種重要食品原料，但存在高熱量、導致血糖升高、齲齒等不利因素。隨著經濟的發展和人民生活水平的提高，人類飲食更加追求營養和健康。國際稀有糖協會(International Society of Rare Sugars，ISRS)定義稀有糖為自然界中存在但含量極少的一類單糖及其衍生物[1]。某些稀有糖不僅具有純正的甜味，而且具有低熱量、低吸收等特點，同時具有多種生理功能，在膳食、醫藥、保健等領域具有重要應用潛力，吸引著越來越多國內外科學家的廣泛關注。

D-阿洛酮糖是D-果糖的C3位差向異構體，是一種低能量甜味劑，它的甜度為蔗糖的70%，但熱量只有0.4 kcal/g，被認為是潛在的蔗糖替代品[2]。D-阿洛酮糖，英文名為D-allulose或D-psicose，化學式為C6H12O6，結構式見圖1，摩爾質量為180.16 g/mol，極易溶于水，密度為1.35 g/cm3，外觀為白色晶體，無特殊氣味，CAS號為551-68-8。在美國，D-阿洛酮糖已經被食品藥品監督管理局(Food and Drug Administration，FDA)認可為GRAS的成分，可以應用于食品中[3]。2020年，FDA發布行業指南，建議在食品標簽上將D-阿洛酮糖排除在“總糖”、“添加糖”之外[4]。

圖1 D-阿洛酮糖結構式Fig.1 Structural formula of D-allulose

目前，國內已有企業正積極申請D-阿洛酮糖進入新資源食品目錄，預計2023年可以獲得國家相關部門批復。在全球范圍內，D-阿洛酮糖生產企業仍不多，主要集中在日本、美國、歐洲、韓國。我國D-阿洛酮糖生產處于起步階段，生產規模較小，有待進一步發展，增加D-阿洛酮糖產能。

本文介紹了D-阿洛酮糖的生理功能及應用，綜述了D-阿洛酮糖生物合成過程中關于生物酶、生物轉化、分離純化和結晶等的研究進展，針對當前D-阿洛酮糖生產過程中存在的某些瓶頸問題進行了討論和分析，并提出可行的解決措施。

1 D-阿洛酮糖的生理功能及應用

1.1 低熱量甜味劑，能夠發生美拉德反應，可以改善食品的風味和色澤

D-阿洛酮糖具有與蔗糖相近的口感和甜度，但所含熱量低。它能夠提高食品的凝膠度，改善食品的風味，其可與食品中的蛋白質發生美拉德反應，不僅能夠改善食品的色澤，還能提高食品的抗氧化性，延長食品的貨架期[2，4]。

1.2 降血糖，抑制脂肪堆積，可用于研制治療肥胖和糖尿病的藥物

D-阿洛酮糖能夠抑制腸道α-糖苷酶的活性，從而降低小腸對糖的吸收，抑制脂肪堆積，提高胰島素的敏感性，降低血糖，在研制治療肥胖和糖尿病藥物方面具有重要的應用價值[5-7]。

1.3 促進谷胱甘肽的增量調節，具有神經保護功能

TAKATA等[8]研究發現，D-阿洛酮糖通過誘導細胞內谷胱甘肽上調而在神經退行性疾病的治療中發揮潛在的神經保護作用。

1.4 抑制寄生蟲生長，是一種潛在的驅蟲劑

SATO等[9]研究發現，D-阿洛酮糖可能是通過干擾秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)的消化、吸收或代謝，從而對秀麗隱桿線蟲的運動、生長和生殖成熟產生抑制作用，成為一種潛在的驅蟲劑。

1.5 生產其他稀有糖醇的前體

根據Izumoring策略[10]，以D-阿洛酮糖為底物經異構酶催化可以得到D-阿洛糖，經氧化還原酶催化可以得到阿洛醇。D-阿洛糖和阿洛醇都是具有重要生理功能的稀有糖醇。

2 D-阿洛酮糖生物轉化所涉及的生物酶

2.1 酮糖 3-差向異構酶

目前，D-阿洛酮糖的生物合成主要是通過酮糖 3-差向異構酶催化D-果糖得到。酮糖 3-差向異構酶主要包括2種：D-塔格糖 3-差向異構酶(D-tagatose 3-epimerase，DTE)和D-阿洛酮糖 3-差向異構酶(D-psicose 3-epimerase，DPE)。酮糖 3-差向異構酶具有高度保守的活性中心和具有相似特征的關鍵氨基酸殘基，大多數DTE或DPE的最適反應溫度區間為40～70 ℃，最適反應pH為7.5～9.0[11]。酶催化作用取決于每個亞基的分子排列，這些亞基暴露其活性位點，以實現有效的酶催化反應。相關動力學參數顯示DPE對D-阿洛酮糖具有較高的底物親和力和催化效率。金屬離子在D-阿洛酮糖的生物轉化中發揮重要作用，不同來源的DTE或DPE對金屬離子的依賴性不同。

1993年，IZUMORI等[12]首次發現來自于PseudomonascichoriiST-24的D-酮糖 3-差向異構酶可以催化D-塔格糖和D-山梨糖、D-阿洛酮糖和D-果糖、D-木酮糖和D-核酮糖以及L-木酮糖和L-核酮糖之間的相互轉化，特別是對D-塔格糖呈現出強特異性，因此將該酶命名為D-塔格糖 3-差向異構酶。2006年，KIM等[13]首次發現來自于Agrobacteriumtumefaciens的DPE對D-阿洛酮糖具有較高的Kcat和Kcat/Km，30 ℃反應，D-果糖和D-阿洛酮糖的平衡比為32∶68；50 ℃反應100 min，可以得到230 g/LD-阿洛酮糖(底物為700 g/LD-果糖)，D-阿洛酮糖的轉化率為32.9%。

近些年，已發現多種來自不同菌株的DTE和DPE，例如來自于Pseudomonascichorii[14]和Rhodobactersphaeroides[15]等的DTE；來自于Clostridiumsp.[1-19]，Desmosporasp.8437[20],Doreasp.CAG317[21],Treponemaprimitia[22],Flavonifractorplautii[23]，Arthrobacterglobiformis[24],Ruminococcussp.5_1_39BFAA[25],Halanaerobiumcongolense[26],Thermoclostridiumcaenicola[27]和Novibacillusthermophilus[28]等的DPE。不同微生物來源的DTE和DPE的酶學性質列于表1。

表1 不同微生物來源的DTE和DPE酶學性質Table 1 Enzymatic properties of DTE and DPE from different microbial sources

續表1

如表1所示，來自于Rhodobactersphaeroides的DTE最適反應溫度較低，為40 ℃，而其他來源酶的最適溫度分布在50～70 ℃；來自于Doreasp.CAG317的DPE最適pH偏酸性，為6.0；來自于Rhodobactersphaeroides的DTE最適pH最高，為9.0，其他DPE和DTE最適pH為7.0～8.0；大多數DTE和DPE在Co2+或Mn2+存在下表現出最高酶活性，除了Arthrobacterglobiformis和Halanaerobiumcongolense來源的DPE在Mg2+存在時具有最高酶活力；另外，來自于Doreasp.CAG317的DPE對D-阿洛酮糖具有很強的特異性。

2.2 NAD(P)-依賴型醇脫氫酶

WEN等[29]首次報道了來自于GluconobacterfrateuriiNBRC 3264 的 NAD(P)-依賴型醇脫氫酶[NAD(P)-dependent alcohol dehydrogenase，ADH]可催化阿洛醇生成D-阿洛酮糖。ADH的最適溫度為50 ℃，pH為7.0～10.0 ADH的相對酶活性皆高于80%，具有較寬的pH域，Co2+能顯著提高酶的催化活性。NAD(P)-依賴型醇脫氫酶(NCBI_ID：WP_099183078.1)由345個氨基酸組成，屬于中鏈脫氫酶/還原酶，經SDS-PAGE分析得到酶分子質量約為36.5 kDa，是可溶性的酶。

3 D-阿洛酮糖的生物合成

D-阿洛酮糖的生物合成路徑主要有3條(圖2)：(1)經DTE或DPE催化D-果糖得到D-阿洛酮糖；(2)經葡萄糖異構酶(glucose isomerase，GI)催化D-葡萄糖為D-果糖，D-果糖再經路徑(1)得到D-阿洛酮糖；(3)經氧化還原酶催化阿洛醇得到D-阿洛酮糖。

GI-葡萄糖異構酶；DTE-D-塔格糖 3-差向異構酶；DPE-D-阿洛酮糖 3-差向異構酶；ADH，NAD(P)-依賴型醇脫氫酶；Nox-NADH氧化酶圖2 D-阿洛酮糖的生物合成Fig.2 Biosynthesis of D-allulose

3.1 利用微生物來源的DPE催化轉化D-果糖為D-阿洛酮糖

目前，生物合成D-阿洛酮糖主要是由DPE催化D-果糖得到。DPE的異源表達系統常用的是大腸桿菌，因為其遺傳背景清晰、培養簡單且生長迅速。此外，食品級表達系統，例如酵母菌、枯草芽孢桿菌等，在企業生產中格外受歡迎。

PARK等[30]構建了異源表達來自于Agrobacteriumtumefaciens的DPE大腸桿菌(Escherichiacoli)工程菌株，該菌株催化D-果糖為D-阿洛酮糖的最適溫度和pH分別為60 ℃和8.5，以700 g/LD-果糖為底物，反應40 min可以得到230 g/LD-阿洛酮糖，轉化率為33%。PARK等[23]構建了異源表達來自于Flavonifractorplautii的DPE谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacteriumglutamicum)工程菌株，該菌株催化D-果糖為D-阿洛酮糖的最適溫度和pH分別為65 ℃和7.0，以750 g/LD-果糖為底物，反應40 min可以得到235 g/LD-阿洛酮糖，轉化率為31%。

LI等[25]構建了異源表達來自于菌Ruminococcussp.5_1_39BFAA的DPE短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)工程菌株，該工程菌株具有較高的DPE表達量，游離DPE經離子交換樹脂固定，所得固定化DPE的最適溫度為60 ℃，最適pH為9.0，當以500 g/LD-果糖為底物時，經固定化DPE催化4 h可得126.95 g/LD-阿洛酮糖，轉化率為25%。YANG等[31]報道了1株馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)工程菌株，該菌株能夠表達來自于Agrobacteriumtumefaciens的DPE，利用該工程菌株作為生物催化劑，以750 g/LD-果糖為底物，55 ℃反應12 h得到190 g/LD-阿洛酮糖，轉化率達到25.3%。

ZHU等[26]構建了異源表達來自于Halanaerobiumcongolense的DPE枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)工程菌株，以750 g/LD-果糖為底物，60 ℃靜息細胞反應得到240 g/LD-阿洛酮糖，轉化率達到32%。同時，ZHU等[26]通過理性設計獲得具有組合突變體Y7H/C66L/I108A/R156C/K260C的DPE，溫度為70 ℃時該突變酶的半衰期增加了5.2 h，Tm值增加了6.5 ℃。通過對關鍵位點進行突變，亞單元間引入了二硫化物橋梁，增加了界面交互，提高了DPE的熱穩定性。利用異源表達具有組合突變體DPE的枯草芽孢桿菌工程菌株作為生物催化劑，同樣地，以750 g/LD-果糖為底物，60 ℃反應可得到262.5 g/LD-阿洛酮糖，轉化率高于32%，達到35%。

不同工程菌株催化D-果糖為D-阿洛酮糖的情況見表2，工程菌株催化D-果糖生產D-阿洛酮糖所得轉化率介于25%～33%，當表達系統為大腸桿菌、谷氨酸棒狀桿菌和枯草芽孢桿菌時，D-阿洛酮糖的轉化率高于30%。相比酶催化方法，利用全細胞生物轉化方法生產稀有糖頗受歡迎，因為它可以避免酶的提取、分離純化及固定化，既可以省去繁瑣的操作步驟，也能夠降低生產成本。另外，對酶分子結構與功能進行深入研究，提高酶的底物特異性和熱穩定性，對于實現稀有糖的高效綠色生產十分重要。

表2 催化D-果糖生產D-阿洛酮糖Table 2 Production of D-allulose by catalyzing D-fructose

3.2 利用微生物來源的GI和DPE催化轉化D-葡萄糖為D-阿洛酮糖

MEN等[32]構建了1株大腸桿菌工程菌株，能夠共表達來自于芽孢桿菌的GI酶和來自于Ruminococcussp.5_1_39BFAA的DPE，在65 ℃和pH 7.0的條件下進行靜息細胞反應8 h，所得D-葡萄糖、D-果糖、D-阿洛酮糖的平衡比為3.0∶2.7∶1.0，D-阿洛酮糖的轉化率為15%。

ZHANG等[33]在大腸桿菌表達系統中異源表達來自于Acidothermuscellulolyticus11B的GI和來自于Doreasp.CAG317的DPE，在65 ℃和pH 6.5的條件下進行靜息細胞反應8 h，所得D-葡萄糖、D-果糖、D-阿洛酮糖的平衡比為2.3∶2.3∶1.0，D-阿洛酮糖的轉化率為17.8%。

ZHAO等[34]在枯草芽胞桿菌表達系統中共表達來自于菌Bacillussp.的GI和來自于菌Doreasp.CAG317的DPE，在75 ℃和pH 6.5的條件下進行靜息細胞反應3 h，所得D-葡萄糖、D-果糖、D-阿洛酮糖的平衡比為2.8∶2.9∶0.9，D-阿洛酮糖的轉化率為13.6%。

不同工程菌株催化D-葡萄糖為D-阿洛酮糖的情況見表3，當以D-葡萄糖為底物時，D-阿洛酮糖的轉化率低于20%，一方面原因是受熱力學平衡的限制，另一方面多酶促反應不同的酶最適反應條件不同，很難充分發揮每一種酶的最高催化活性。因此，D-阿洛酮糖的工業化生產還需在生物催化劑性能提高方面做出更多努力。

表3 催化D-葡萄糖生產D-阿洛酮糖Table 3 Production of D-allulose by catalyzing D-glucose

3.3 利用微生物來源的ADH催化轉化阿洛醇為D-阿洛酮糖

GULLAPALLI 等[35]利用EnterobacteraerogenesIK7靜息細胞為生物催化劑，以30 g/L的阿洛醇為底物，在37 ℃、pH 11.0條件下反應24 h，最終所得D-阿洛酮糖的轉化率為89.3%。POONPERM 等[36]利用BacilluspallidusY25 靜息細胞為生物催化劑，以10 g/L的阿洛醇為底物，在55 ℃、pH 7.0條件下反應16 h，最終所得D-阿洛酮糖的轉化率為98%。

WEN等[29]在大腸桿菌中異源表達來自于GluconobacterfrateuriiNBRC 3264 的 NAD(P)-依賴型醇脫氫酶，對該酶進行了純化分析，并研究了其酶學性質，以0.05 mol/L阿洛醇為底物，在50 ℃、pH 7.0和添加0.001 mol/L Co2+的條件下反應4 h，最終所得D-阿洛酮糖的轉化率為97%。另外，筆者利用異源表達來自于GluconobacterfrateuriiNBRC 3264 的 NAD(P)-依賴型醇脫氫酶的重組大腸桿菌作為生物催化劑，以10 g/L 和100 g/L阿洛醇為底物，在50 ℃、pH 10.0、細胞用量OD600為80的條件下反應最終所得D-阿洛酮糖的轉化率分別為80.9%和48%。同時，筆者利用制備型色譜柱對反應液進行分離，得到阿洛酮糖溶液，通過高效液相色譜法分析、比旋光度測定和質譜分析證實由阿洛醇生產所得阿洛酮糖的構型為D型，且分子質量與已知D-阿洛酮糖分子質量一致。由表4可以看出，相比異構酶催化D-葡萄糖或D-果糖生產D-阿洛酮糖，以阿洛醇為底物生產D-阿洛酮糖具有更高的轉化率。

表4 催化阿洛醇生產D-阿洛酮糖Table 4 Production of D-allulose by catalyzing allitol

3.4 D-阿洛酮糖生物轉化方法分析

利用DTE或DPE催化D-果糖生產D-阿洛酮糖因受熱力學平衡的限制，會導致D-阿洛酮糖的轉化率較低(約為30%)。并且，由于D-阿洛酮糖與其異構體D-果糖性質極為相似，導致分離純化困難，成為限制D-阿洛酮糖大規模工業化生產的關鍵因素。為了克服熱力學平衡的限制，有研究人員在反應體系中添加硼酸，與糖形成配合物，由于硼酸對D-阿洛酮糖的結合親和力遠高于D-果糖，從而使反應平衡向生成D-阿洛酮糖的方向轉變，可以大大提高D-阿洛酮糖轉化率[37]。但是硼酸具有毒性且用量大，并且硼酸去除困難，因此難以實際應用。另外，將生物催化過程與產物分離相結合，也可以克服熱力學平衡限制[38-40]。但是，該方法操作復雜且繁瑣，實際應用比較困難。

雖然利用氧化還原酶催化阿洛醇生產D-阿洛酮糖可以獲得較高的轉化率，但是這種方法也具有一定的局限性。一方面，底物阿洛醇也是一種稀有糖醇。根據稀有糖制備策略，經合適的氧化還原酶催化可以實現阿洛醇和D-阿洛酮糖的相互轉化。利用異構酶催化D-葡萄糖或D-果糖生產D-阿洛酮糖，轉化率較低，需要經分離純化后得到D-阿洛酮糖，由此帶來的分離純化成本較高；利用DPE、核糖醇脫氫酶和甲酸脫氫酶可以實現由D-果糖生產阿洛醇，阿洛醇轉化率高，可以通過結晶的方式直接得到阿洛醇，不需要額外的分離純化，得到的阿洛醇再經NAD(P)-依賴型醇脫氫酶催化可得D-阿洛酮糖，較高的轉化率有望通過結晶的方式直接獲得D-阿洛酮糖，此過程雖然繁瑣，但是可以省去高昂的D-阿洛酮糖分離純化步驟，當然也會增加生物催化劑培養成本和生物轉化成本。雖然阿洛醇可以由廉價的底物D-葡萄糖或D-果糖催化生產得到，而且生產工藝相對成熟，但是目前國內外還未實現阿洛醇的工業化生產，導致底物來源受限。

另一方面，利用氧化還原酶催化阿洛醇生產D-阿洛酮糖過程中輔酶 NAD+的再生是其限速步驟。隨著底物濃度的提高，輔酶供給不足，會限制D-阿洛酮糖的生產。因為輔酶NAD+價格昂貴，在反應體系中額外添加輔酶NAD+是不現實的。因此，解決氧化還原酶催化阿洛醇生產D-阿洛酮糖過程中輔酶再生的問題是難點和重點，也是決定該途徑實用性的關鍵因素。稀有糖生物合成過程中常用的輔酶再生方法是酶偶聯法。例如，將木糖醇脫氫酶與產水型 NADH 氧化酶偶聯，應用于L-木酮糖的生產[41]，其中產水型 NADH 氧化酶能夠氧化 NADH 為 NAD+，為氧化還原反應提供輔酶NAD+[42]。因此，尋找一種能夠與NAD(P)-依賴型醇脫氫酶偶聯的，可用于再生NAD+的高效NADH氧化酶是催化阿洛醇生產D-阿洛酮糖的重要前提。

4 D-阿洛酮糖的分離和純化

在工業化生產過程中，D-阿洛酮糖的分離和純化相對較為困難。待分離糖液中主要包括酶或細胞催化劑、金屬鹽離子、色素和至少2種性質極為相似的單糖。其中，酶及細胞催化劑可以通過超濾或離心等方式較容易地去除；金屬鹽離子可以通過陰陽離心交換色譜去除；活性炭可以有效除去色素。然而，糖的分離是最困難的。特別地，生物合成D-阿洛酮糖的轉化率為30%左右，最終糖液中D-果糖的濃度高于D-阿洛酮糖的濃度，而D-果糖和D-阿洛酮糖的結構及理化性質相似，很難分離，導致D-阿洛酮糖分離成本高，限制了D-阿洛酮糖的應用。目前，糖分離的方法主要有利用模擬移動床(simulated moving bed,SMB)技術分離和利用生物轉化法分離。

4.1 SMB技術

SMB技術是一種基于色譜分離原理而建立的連續分離色譜技術。近些年，因其具有低能耗、高溶劑利用率、高生產率和高分離純度等優點引起了人們的廣泛關注。

WAGNER等[43]提出了一種SMB工藝的多目標優化方法，采用逆方法確定模型參數，并在實驗室規模的SMB裝置上進行實驗，運行溫度70 ℃，D-阿洛酮糖的產能為2.6 kg/(L·d)，1 kg消耗27 L解吸劑，所得D-阿洛酮糖的純度為97.6%。LI等[25]利用含有8根填充了鈣離子樹脂的色譜柱和5個壓力泵組成的SMB設備分離D-阿洛酮糖，確定了SMB運行參數，最終得到D-阿洛酮糖的純度為98.5%(圖3)[25]。

1-D-果糖；2-D-阿洛酮糖a-模擬移動床示意圖；b-模擬移動床設備圖；c-D-阿洛酮糖高效液相色譜分析圖圖3 模擬移動床分離純化D-阿洛酮糖的優化工藝Fig.3 Optimization of separation and purification of D-allulose by SMB

為了保證分離效果和延長樹脂使用壽命，需要對待分離糖液進行預處理，包括去除雜質和金屬離子。雖然SMB技術具有環境友好、無副產物生成等優點，但是SMB設備價格高昂、運行參數獲取困難，限制了其在工業中的大規模應用。

4.2 生物轉化法

生物轉化法分離D-阿洛酮糖是指利用生物催化劑將剩余底物D-果糖轉化為其它易于從糖液中分離的化合物。例如，LI等[40]利用固定化葡萄糖異構酶和氧化還原酶催化底物D-果糖為葡萄糖酸，然后利用陰離子交換樹脂去除葡萄糖酸，最終D-阿洛酮糖純度達到91.2%。SONG等[44]對十字花科蔬菜殘渣進行生物加工，經過水解、異構酶轉化和酵母菌發酵得到生物乙醇和D-阿洛酮糖，并通過滲透蒸發和陽離子交換色譜分離純化得到生物乙醇和D-阿洛酮糖，其中D-阿洛酮糖的回收率約為86.2%(圖4)。

圖4 發酵法分離D-阿洛酮糖和D-葡萄糖[44]Fig.4 Separation of D-allulose and D-glucose by fermentation method[44]

YANG等[31]利用馬克斯克魯維酵母菌發酵未反應的D-果糖為乙醇，同樣地乙醇經滲透揮發除去，最終D-阿洛酮糖的純度高于90%(圖5)[31]。

圖5 馬克斯克魯維酵母菌循環催化示意圖[31]Fig.5 Schematic diagram of cyclic catalysis of K.marxianus[31]

雖然生物轉化法分離D-阿洛酮糖具有催化劑易得、操作方法簡單、節省人力物力等優點，但是該方法降低了底物(D-果糖等)的利用率。另外，酵母菌發酵會產生代謝廢物也存在雜菌污染的風險，并且產生的乙醇經濃縮后成為易燃品，具有一定危險性。總之，生物轉化純化方法在工業中未得到廣泛應用。

5 D-阿洛酮糖的結晶

5.1 蒸發濃縮冷卻結晶法

結晶是D-阿洛酮糖生產的最后一步。由于D-阿洛酮糖在高溫下會變色并且溶解度高，因此常用的D-阿洛酮糖結晶方法主要是低溫真空蒸發濃縮和冷卻結晶法，即利用低溫真空蒸發將D-阿洛酮糖溶液濃縮到一定的糖度，然后降溫冷卻進行結晶。這種方法對D-阿洛酮糖溶液的純度具有很高要求，如果D-阿洛酮糖的純度低、雜質較多則會影響D-阿洛酮糖的結晶。LI等[25]將SMB分離得到的糖液在60 ℃下真空蒸發濃縮到糖度為75%，加入0.3% 400目的D-阿洛酮糖晶種，72 h內降溫到1 ℃，離心收集并50 ℃烘干得到D-阿洛酮糖晶體，經分析得到D-阿洛酮糖純度為99.1%，D-阿洛酮糖的結晶率為82%。KIM等[45]在30～40 ℃時向D-阿洛酮糖濃縮液中加入D-阿洛酮糖晶種，最終結晶得到D-阿洛酮糖的純度為98%。

5.2 有機溶劑冷卻結晶法

因為D-阿洛酮糖在水中具有較高的溶解度，加之D-阿洛酮糖溶液濃縮后糖液黏度非常大，導致結晶困難。此時，可以考慮添加有機溶劑降低液體黏度，同時也可以降低糖的溶解度。常用的有機溶劑為無毒的無水乙醇。雖然D-阿洛酮糖可溶于無水乙醇，但是溶解度遠低于在水中的溶解度，加入無水乙醇后不僅可以降低糖液黏度，還可以降低溶解度，有利于D-阿洛酮糖的結晶。佟毅等[46]發明了1種從乙醇溶液中結晶D-阿洛酮糖的方法，通過D-阿洛酮糖在乙醇溶液中降溫結晶，一次結晶率達到50%以上，結晶晶型均一，易于固液分離，后期干燥簡單易行。

雖然添加乙醇可以改善結晶性能，但由于乙醇是易燃品，存在安全隱患，并且使用過程中需要進行回收而且具有一定的損耗，增加成本，因此很多情況下盡量避免使用乙醇。這也進一步對D-阿洛酮糖的結晶工藝提出了更高的要求。

6 總結與展望

D-阿洛酮糖作為一種理想的蔗糖替代品，具有廣闊的市場前景，對于提高人民健康水平、幸福指數和滿足日益升級的消費市場需求具有重要意義。為了提高D-阿洛酮糖的生產效率，建議從以下幾個方面進行重點研究：

(1)提高酶的催化活性和穩定性，降低最適pH。一直以來，提高酶的催化活性和穩定性是生物合成領域的研究重點和難點。催化活性高、耐熱性好、半衰期長的酶是獲得高產能和降低酶使用成本的必要條件。另外，大多數報道的DPE或DTE最適pH為堿性，容易發生美拉德反應，導致糖液顏色加深，產生副產物，對后期產品分離純化不利。通過酶分子理性設計和定向進化的方式改造DPE或DTE以及篩選和挖掘新的具有應用潛力的酶是未來D-阿洛酮糖生物合成的重要任務。

(2)構建食品級宿主工程菌株，滿足食品安全要求。大腸桿菌作為常用的表達系統因產生內毒素而不利于食品級D-阿洛酮糖的生產。雖然有酵母菌、枯草芽孢桿菌和谷氨酸棒狀桿菌等食品級表達系統構建的工程菌株生產D-阿洛酮糖的報道，但是這些表達系統具有穩定性差、重復率低等缺點。因此，構建具有高穩定性、耐受高底物濃度、具有高轉化率、高生產強度、高安全性的工程菌株是實現食品級D-阿洛酮糖生產的重要基礎。

(3)構建簡單、高效、低成本的D-阿洛酮糖工業化生產工藝。開發創新型工藝路線，提高轉化效率，解決D-阿洛酮糖分離純化問題，降低分離純化工藝難度和成本，構建適合大規模工業化生產D-阿洛酮糖的簡單、高效、創新性生產工藝路線。

(4)開發利用D-阿洛酮糖保健功能和生物醫藥應用潛能。D-阿洛酮糖的醫藥價值巨大，它既能抗齲齒、降血糖、抗氧化，又具有防止脂肪堆積、發揮神經保護作用和清除活性氧自由基等生理功能，可用于制備特醫食品、保健品和合成藥物。進一步開發D-阿洛酮糖的醫藥潛能，將會為糖尿病、肥胖癥以及動脈粥樣硬化等病患帶去福音，改善他們的生活水平和質量。