對蝦原肌球蛋白致敏性消減技術研究進展

王新，張煥蘭，邱惠，魏帥*，孫欽秀，夏秋瑜，王澤富，韓宗元，吉宏武,2，劉書成,2*

1(廣東海洋大學 食品科技學院,廣東省水產品加工與安全重點實驗室,廣東省海洋生物制品工程實驗室,廣東省海洋食品工程技術研究中心,水產品深加工廣東普通高等學校重點實驗室,廣東 湛江,524088)2(大連工業大學 海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協同創新中心,遼寧 大連,116034)

隨著全民生活水平的提高和食品加工技術的發展，消費者的飲食結構也在發生變化，越來越多可以引發人們過敏的食物被發現。其中能夠引發過敏的蛋白或其他活性物質被稱為食物過敏原。世界衛生組織(World Health Organization，WHO)和聯合國糧農組織(Food and Agriculture Organization, FAO)發布可引發人類過敏的170多種食物，其中90%的食物過敏由牛奶、雞蛋、魚、甲殼類、大豆、小麥、花生、堅果引起，被命名為“The Big-8”[1-2]。流行病學調查顯示，近年來食物過敏的發病率在世界范圍內不斷上升，全球已有3%人口受到過敏帶來的影響，已經成為繼哮喘病后的全球第二波流行病，嚴重影響人們的生活質量，已經成為世界公認的食品安全問題之一[3]。

甲殼類動物是FAO和WHO認定為八大類食物過敏原之一，蝦及其制品是海鮮過敏的主要原因，主要集中在中國、日本和北美等地區[4]。蝦及其制品引發的過敏是由IgE介導的超敏反應，能夠引起消費者哮喘、腹瀉、皮炎等癥狀，嚴重時可引發休克甚至死亡等疾病，嚴重威脅消費者的健康[5]。

1 原肌球蛋白

蝦中含有大量過敏蛋白，目前已經證實的過敏蛋白有：原肌球蛋白(tropomyosin, TM)、精氨酸激酶(arginine kinase, AK)、肌質鈣結合蛋白(sarcoplasmic calcium-binding protein, SCP)、肌球蛋白輕鏈(myosin light chain, MLC)、血藍蛋白亞基(hemocyanin, HC)和肌鈣蛋白C(troponin C, TnC)。其中，原肌球蛋白引起的過敏高達80%，是蝦中最主要的過敏原[6-7]。

原肌球蛋白是分子質量為32～39 kDa的鹽溶性蛋白，理論等電點4.5，含有豐富的谷氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、精氨酸和絲氨酸，結構以α-螺旋為主，具有熱穩定性，在機體中與肌動蛋白和肌球蛋白一起調節肌肉收縮，由HOFFMAN在1981年首次從蝦中分離出來，是甲殼類動物主要過敏原[7-9]。不同物種中TM蛋白表現出了高度同源性，結構具有相似性，如：克氏原鰲蝦、中國明對蝦和凡納濱對蝦等9種蝦TM蛋白序列同源性高達90%以上[10]。

近年來，隨著檢測技術的不斷發展，越來越多的過敏原被人們發現，YU等[11]在海螺中分離出99 kDa的新型過敏原，通過質譜法確定為副原肌球蛋白(paramyosin，PM)，并通過生物信息學工具預測出PM蛋白含有7個抗原表位。SUZUKI等[12]在盤鮑中檢測到PM蛋白，并且發現PM蛋白與TM蛋白間存在交叉反應。LEE等[13]通過免疫印跡發現煮熟蝦的提取物與過敏患者血清在63 kDa處發生結合，通過SDS-PAGE結合質譜技術確定此蛋白為丙酮酸激酶(pyruvate kinase，PK)。

2 TM蛋白消減技術

目前，對于食物過敏沒有良好的治愈辦法，但可以通過有效預防和加工處理降低食物致敏率，一般有2種途徑：一是對食品過敏反應進行早期識別和管理、準確標識、提醒和警示過敏人群，如：美國、歐盟、日本等國對含有甲殼類動物的食品標簽進行強制標識[14]；二是對含有過敏原的食物進行加工生產低敏甚至脫敏食物[15]。本文針對蝦主要過敏原TM蛋白，總結常見的消敏技術。

一些加工技術可以改變蝦肉的品質，引起蛋白發生變性、降解、聚合或糖基化等，可能改變了TM蛋白的結構，導致抗原表位的破壞、丟失或者暴露，從而消減TM蛋白致敏性。因此選擇合適的加工技術可以有效降低蝦的致敏性。TM蛋白是耐熱蛋白，傳統的熱加工很難降低其致敏性，往往需要借助其他手段進行處理以降低其致敏性。目前主要的加工方法有：物理加工法、化學處理法、生物法以及聯合處理法。常見的非熱加工對TM蛋白致敏性的影響見表1。

表1 常見非熱加工方法對TM蛋白致敏性的影響Table 1 Effect of common non-thermal processing technologies on the sensitization of tropomyosin

2.1 物理法

2.1.1 熱加工

熱加工是傳統的食品加工技術，包括蒸、煮、煎、炒、炸等，是以減少食物中微生物、延長保質期和提高品質為目的的一種加工技術。如圖1所示，蛋白易受熱變性，引起空間結構發生變化，蛋白分子發生伸展，分子間作用力改變，破壞了蛋白的構象表位，降低過敏原免疫結合能力，但熱加工不會改變蝦TM蛋白線性表位，高溫還會引起TM蛋白與還原糖的美拉德反應，可能會增加致敏性[6-7]。熱處理不能改變凡納濱對蝦TM蛋白致敏性，煮制后SCP、磷酸丙糖異構酶(triosephosphate isomerase,TIM)、AK、MLC和TM 5種過敏原IgG結合活性并沒有發生改變，高溫一定壓力處理后MLC活性降低，TIM、AK沒有陽性反應，TM蛋白仍然存在較高的IgG結合活性[27]。熱處理TM蛋白在經胃蛋白酶和胰蛋白酶消化后仍有較高的致敏性[28]。煮制后的蝦與生蝦相比，TM蛋白IgE結合活性明顯升高[29]。LALY等[30]發現花尾蝦在沸水中保持5～25 min后，IgE活性升高18%～27%。但是MEJRHIT等[31]研究摩洛哥人對蝦TM蛋白敏感性，發現熱處理后，ELISA和Dot Blot顯示熱處理降低了TM蛋白陽性反應，可能引起摩洛哥人對TM蛋白過敏的抗原表位是構象表位。不同的抗體與TM蛋白之間結合位點不同，高溫狀態下以α-螺旋為主的TM蛋白空間構象發生改變，但溫度恢復到室溫后TM蛋白α-螺旋又回復到原始狀態[32]，TM蛋白中含有大量的賴氨酸，熱加工會促使其與還原糖反應速度加快，形成新的抗原表位，提高了TM蛋白的IgE結合活性。

圖1 熱加工對過敏原致敏性的影響[7]Fig.1 Effect of allergen reduction by thermal treatment

2.1.2 超高壓技術

超高壓(high hydrostatic pressure，HHP)技術又叫超高壓殺菌技術、高靜壓技術，是一種非熱加工技術，它是在25～60 ℃，通過介質在壓強0～1 000 MPa下處理食品[3,7]。HHP主要影響蛋白質之間的氫鍵、離子鍵和疏水鍵等非共價鍵，破壞蛋白二、三級結構，使蛋白質結構發生不可逆的改變，從而降低了食物致敏性。與熱加工相比，HHP處理可保留食品原有的色澤，較大程度保留食物的營養成分，近年來在消減過敏原研究中受到國內外學者廣泛關注[3,17]。HHP可以顯著降低TM蛋白致敏性，胡志和等[16]發現，蝦TM蛋白在300 MPa、20 ℃保壓40 min時，致敏性最低[OD492(0.210±0.005)]；而當壓強增加至700 MPa時，致敏性最高[OD492(0.328±0.004)]。韓建勛[10]發現HHP未改變TM蛋白一級結構，對二級結構影響較小, 當處理條件為65 ℃、壓強為300 MPa保壓15 min時致敏性最低，且HHP可破壞TM蛋白表位(MDAIKKKKMQAMKLEKDNAMDRADTLEQQNKEAN-NRA、VAALNRRIQLLEEDLERSEER和QKLQKEVDR-LEDELVNEKEKYKSITDELDQTFSELSGY)。LONG等[17]發現TM蛋白經500 MPa、55 ℃處理10 min后幾乎完全失活，而當壓強高于500 MPa時，TM蛋白致敏性增大，可能是高壓使TM蛋白內部的抗原表位暴露導致的。FAISAL等[18]發現600 MPa、120 ℃處理TM蛋白10 min，其致敏性降低65%，且胃蛋白酶消化后原肌球蛋白抗原性顯著降低。

2.1.3 輻照技術

食品輻照作為一種典型的非熱食品加工技術，是采用高能、高穿透性射線對食品或原料進行輻照，使食品成分或生物活性物質發生物理變化或化學反應，輻照源包括能量≤10 MeV的電子束、≤ 5 MeV的X射線和Co60和Cs137放射出的γ射線，主要應用于食品殺菌和延長貨架期等[33]。輻照可以破壞過敏蛋白的空間構象和表位結構，達到降低或者消除致敏性的作用。采用γ輻射處理蝦肉粗提物，TM蛋白含量降低，免疫印跡和ELISA結果顯示 TM蛋白IgE活性隨著輻照劑量的增加而降低[34]。采用0、1、3、5、7、9 kGy劑量的輻照處理中華管鞭蝦TM蛋白，其致敏性降低，在7 kGy時效果最顯著，IgG結合能力下降了59%；3、7和9 kGy劑量的電子束輻射導致 α-螺旋和 β-折疊結構含量減少，β-轉角結構含量增加，無規則卷曲含量無顯著變化[2]。采用γ-輻射處理羅氏沼蝦TM蛋白，在10和15 kGy劑量下IgG結合能力明顯減少[19]。采用電子束輻照處理冷凍蝦TM蛋白，結果顯示蛋白發生降解，10 kGy輻照后致敏性降低了20%，而在低劑量3 kGy輻照后致敏性增加了10%，這可能是由于輕微的輻照會產生低濃度的活性氧，改變蛋白的空間結構，反而提高了TM蛋白致敏性[20]。

2.1.4 等離子體技術

等離子體是近年來興起的一種非熱加工技術，又稱非熱等離子體或低溫等離子體，與傳統的加工技術相比，有能耗低、處理溫度低和耗時短等優點[35]。它是由氣體激發和電離后產生物質的一個集合體，包括電子、離子、自由基、負離子等，又被稱為“物質第四態”[36]。當過敏蛋白暴露于含有自由基的冷等離子體時，這些活性基團與蛋白質發生相互作用，破壞蛋白質結構，引起α-螺旋和β-折疊含量的變化、酰胺鍵和側鏈的分解，這些變化可能掩蓋或破壞構象表位和線性表位，降低過敏性[17,37]。SHRIVER等[38]發現白濱對蝦TM蛋白經30 kV、60 Hz處理5 min后致敏性降低了67%。EKEZIE等[21]采用氬氣低溫等離子體(98%氬氣和2%氧氣)處理凡納濱對蝦TM蛋白 3、6、9、12、15 min，隨著處理時間的延長，間接ELISA顯示IgG/IgE分別降低了17.6%和26.87%，巰基含量顯著降低，表面疏水性增加，促進了α-螺旋向β-折疊和β-轉角的轉變。目前，已經發現等離子體可以消減蝦、花生、小麥的致敏性，但是有研究證明，等離子體可能會促進油脂的氧化，破壞食品中一些營養成分，降低食品的品質。因此，等離子體在實際加工生產過程中的應用仍有待于進一步確認。

2.1.5 超聲技術

超聲加工技術有耗能低、無污染和對食品品質影響小等優勢，受到人們廣泛關注。高強度超聲(100～800 W，15 min)處理可減少TM蛋白α-螺旋和β-折疊含量、增加β-轉角和無規則卷曲含量，誘導TM蛋白產生多肽片段，ELISA結果顯示超聲處理后TM蛋白致敏性降低70%，消化率提高[22]。TM蛋白在0、50 ℃下經30 kHz、800 W超聲處理1.5 h，0 ℃處理并未明顯降低TM蛋白致敏性，50 ℃超聲處理后致敏性顯著下降，表明超聲消減TM蛋白致敏性需要溫度共同作用[39]。煮熟的南美白對蝦經800 W，30 kHz，0 ℃超聲處理30 min后，過敏患者血清與IgE結合能力下降了50%[40]。LI等[41]用30 Hz、800 W超聲處理TM蛋白，間接ELISA結果表明，TM蛋白IgE結合活性下降75%，消減率和處理時間成線性關系。室溫下20 kHz，400 W超聲處理蝦制品，0～20 min致敏性隨處理時間延長而降低，20 min時TM蛋白含量減少76%，體外消化率提高7.53%[1]。超聲處理并不能降低對蝦中所有過敏原，CHEN等[42]采用30 ℃，200 W超聲處理小龍蝦AK蛋白，其致敏性并沒有發生明顯改變。超聲處理是一種非常有潛力的過敏原消減技術，目前關于超聲消減TM蛋白致敏性研究相對較少，消減機制還需要進一步研究。

2.1.6 其他物理方法

微波和脈沖強光等物理處理也可以改變TM蛋白致敏性。1 000 W、75～125 ℃微波處理南美白對蝦5～15 min，TM蛋白條帶強度隨著處理溫度和時間的增加而降低，125 ℃微波處理15 min后TM蛋白含量減少75%[9]。采用脈沖強光(3 脈沖/s，距光源 10 cm)處理TM蛋白，SDS-PAGE顯示4 min后TM蛋白灰度降低，處理1～3 min時，Western bolt顯示與未處理TM蛋白相比，IgE結合能力并未發生明顯改變，處理4～6 min時，IgE活性顯著降低，采用煮沸結合脈沖強光聯合處理，TM蛋白致敏性下降程度最大[43]。

2.2 化學法

2.2.1 糖基化

糖基化是還原糖和游離氨基之間發生的非酶促反應，主要發生在經過熱處理和長期儲存后的食品中。TM蛋白含有豐富的谷氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、精氨酸和絲氨酸，糖基化可能破壞TM蛋白表位，導致致敏性降低[8,44]。還原糖數量和種類、溫度和時間等因素會影響糖基化處理對TM蛋白致敏性的消減效果。美拉德反應(核糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和麥芽糖)可影響青蟹TM蛋白和AK致敏性，半乳糖、葡萄糖和阿拉伯糖降低了TM蛋白的致敏性，只有阿拉伯糖降低了AK致敏性[45]。YUAN等[23]發現經谷氨酰轉氨酶催化糖基化后，TM蛋白α-螺旋含量增加、紫外吸收峰發生藍移、表面疏水性增加、游離氨基含量減少，IgG/IgE結合能力降低。LYU等[44]研究了核糖處理對TM蛋白構象及致敏性影響，發現TM蛋白空間結構發生明顯改變，核糖修飾了苯丙氨酸、異亮氨酸和蛋氨酸殘基，改變了TM蛋白抗原表位，4 000 mmol/L核糖可顯著降低TM蛋白IgE結合能力，并抑制RBL-2H3細胞釋放細胞因子。TM蛋白經低聚乳糖(TM-GOS)、甘露聚糖(TM-MOS)、麥芽五糖(TM-MPS)糖化處理后致敏性降低，而TM-FOS糖化增加了TM蛋白的致敏性和小鼠嗜堿性粒細胞過敏反應，α-螺旋從78.7%分別減少到60.7%(TM-GOS)、66.7%(TM-FOS)、71.3%(TM-MOS)和68.9%(TM-MPS)[46]。

2.2.2 酶處理

酶處理包括：(1)酶解，在胰蛋白酶和木瓜蛋白酶等水解酶作用下，蛋白被水解成多肽、氨基酸以及其他小分子，導致線性表位丟失而降低致敏性；(2)酶交聯，常用酶有酪氨酸酶、漆酶、轉谷氨酰胺酶和多酚氧化酶，主要是通過分子間交聯導致蛋白聚集，引起蛋白空間構象變化而降低致敏性。酶解過程溫和，可以有效地破壞蛋白質的功能特性，降低動物過敏原IgE結合能力[7,24,47,48]

AHMED等[24]研究了酪氨酸酶交聯對刀額對蝦TM蛋白致敏性的影響，發現酪氨酸酶和咖啡酸交聯后的TM蛋白分子質量明顯變大，灰度值下降，酪氨酸酶處理導致 IgE 結合帶在36 kDa處減少；2 000 nkat/g的酪氨酸酶處理導致TM蛋白IgG/IgE結合能力分別下降了33.83%和43.9%。體外和體內實驗顯示酶交聯后提高了TM蛋白消化率，IgG/IgE的識別率顯著降低，有效地抑制了細胞脫顆粒[47]。采用漆酶、漆酶/咖啡酸交聯TM蛋白，ELISA和WB實驗顯示IgG/IgE結合活性降低，TM蛋白空間結構發生改變，紫外吸收峰藍移、熒光最大吸收峰降低且最大吸收波長紅移、表面疏水性降低，胃腸消化率提高[8]。通過轉谷酰胺酶和酪氨酸酶處理TM蛋白，其蛋白結構發生改變，α-螺旋在轉谷酰胺酶和酪氨酸酶處理后分別降低20.1%和15.2%，β-轉角分別增加5.8%和6.2%；酪氨酸酶交聯后，TM蛋白IgE結合活性下降34.95%[48]，可能是由于TM蛋白表位中含有大量谷氨酸、酪氨酸和賴氨酸，酶處理后導致蛋白表位破壞降低了致敏性。酪氨酸酶和辣根過氧化物酶交聯螃蟹TM蛋白，其IgE結合能力分別下降了34.5%和63.5%，IgG結合能力分別降低了16.9%和70.8%，消化穩定性下降，RBL-2H3細胞脫顆粒受到抑制，增加了小鼠口服耐受性[49]。LIU等[50]用胃蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶處理太平洋白對蝦和草蝦，發現TM蛋白耐酶解。TM蛋白顯示出對胃蛋白酶消化具有一定的抵抗力，而肌球蛋白重鏈和肌動蛋白都在短時間內迅速降解。酶催化蛋白交聯和蛋白水解2種方法可對過敏性蛋白進行修飾，為減輕甲殼動物過敏原的致敏性提供了溫和而又安全的方法。

2.2.3 其他化學處理

除了常用的糖基化和酶法可消減TM蛋白的致敏性，還有使用其他化學處理方法，如采用丙烯酰胺、2,2′-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽、丙二醛、多酚和pH等。25 ℃下將刀額對蝦TM蛋白在1 mmol/L丙烯酰胺中孵育24 h，BALB/c 小鼠模型顯示TM 蛋白特異性IgE和IgG1血清水平、組胺含量顯著降低；RBL-2H3細胞模型顯示β-氨基己糖苷酶、組胺、半胱氨酰白三烯和前列腺素D2含量與未處理的TM蛋白相比顯著降低(P<0.01)，表明丙烯酰胺可修飾TM蛋白并降低其致敏性，隨著處理濃度的增加，TM蛋白IgE結合能力降低[51]。使用2,2′-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽修飾TM蛋白，羰基和游離氨基含量顯著降低，賴氨酸和表面疏水性含量顯著增加(P<0.05)；熒光最大發射波長藍移，熒光強度降低；小鼠模型中TM蛋白特異性IgE/IgG1、組胺和mMCP-1水平顯著降低；RBL-2H3細胞中介質釋放能力降低；IgG/IgE結合能力顯著降低，5和25 mmol/L 2,2′-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽處理TM蛋白時出現新條帶，發生了交聯[5]。丙二醛可誘導TM蛋白發生交聯，降低α-螺旋含量，增加了β-折疊、β-轉角和無規則卷曲含量；表面疏水性和羰基含量顯著增加，游離氨基和可用賴氨酸含量顯著減少(P<0.05)；低濃度丙二醛交聯后的TM蛋白仍有IgG結合活性，而高濃度處理后IgG活性降低，且TM蛋白誘導RBL-2H3釋放介質和細胞因子下降[52-53]。蝦TM蛋白經不同濃度的丙二醛處理后發生輕微降解，提高了胃蛋白酶消化穩定性，但是TM蛋白IgE結合能力在胃消化后略有下降，腸消化后下降顯著[54]。多酚可誘導TM蛋白分子質量發生改變，同時降低TM蛋白的IgG/IgE結合能力，降低RBL-2H3細胞介質釋放能力和小鼠模型中TM蛋白的致敏性[4]。pH會影響TM蛋白特異性結合能力，當pH<4.0時，IgG結合能力降低了42.2%[55]，在pH 1.0～3.5下腌制蝦肉，TM蛋白IgE結合能力顯著降低[56]。

2.3 生物法

發酵是一種傳統的加工與保藏技術，發酵法主要利用發酵過程中微生物對一些過敏原蛋白進行分解，引起變性，改變過敏原空間構象，破壞抗原表位，從而達到降低或消除致敏性的目的。發酵法與熱處理以及其他物理法相比，不會破壞其他營養物質，還可以分解基質中蛋白質生成肽或氨基酸，促進機體的吸收，一定程度上增加食品風味。目前發酵法在消減水產品致敏性方面的研究較少，現階段主要應用于豆制品、奶制品以及花生制品的加工中[37,57]。PARK等[58]研究發現發酵過程可以降低蝦中TM蛋白與過敏人群血清的結合能力，當發酵溫度為25 ℃時，發酵12 d TM蛋白致敏性開始下降，降低發酵溫度會延長TM蛋白致敏降低現象的出現時間。FU等[25]發現口服干酪乳桿菌可減輕BALB/c小鼠對蝦TM蛋白的過敏癥狀和腸上皮損傷。蝦醬在37 ℃自然發酵過程中， TM蛋白含量和免疫活性隨發酵時間的增加而逐漸下降，18 d后致敏性下降69%[59]。

2.4 聯合消減

LIU等[26]采用美拉德反應結合熱處理TM蛋白，與單獨熱處理和美拉德反應相比，其消化率有所提高且IgG/IgE結合活性降低更多。采用10 kGy劑量輻照和100 ℃熱加工處理TM蛋白，與單獨處理相比，消減效果顯著提高，但TM蛋白致敏性隨著處理時間的延長未發生明顯改變[60]。木瓜蛋白酶結合超高壓處理蝦仁，在酶與底物質量比為1∶130、450 MPa、40 ℃條件下處理55 min，過敏人血清反應OD492(0.053)接近正常人血清OD492(0.05)，單獨超高壓處理時與過敏人血清結合OD492為0.585，在降低致敏性方面表現出明顯的優勢[61]。

3 結論

TM蛋白耐酸堿、耐高溫、耐消化，傳統加工方式不能有效地對其致敏性進行消減。長時間加壓高溫可以有效地對TM蛋白致敏性進行消減，但會對蝦肉品質造成影響。目前，一些非熱加工(如：超高壓、超聲、等離子體、輻照等)在消減對蝦TM蛋白致敏性上有了初步研究，但是消減效果不一，也會對蝦肉品質帶來影響。因此，部分學者采用聯合方法進行消減致敏性。雖然兩種或多種技術的組合不僅可以提高消減效果，而且可以大大縮短加工時間，保證食品的理化特性，但是與單一技術相比，組合方式需要控制更多的參數，組合技術在連續處理同一對象時，會產生明顯的相互作用，可能是協同也可能是拮抗作用，還可能產生不可預見的問題。因此，兩種或多種高效聯合消減技術的研究仍具有一定的挑戰性，有必要尋找更多的可能性，進行更多樣化的研究。此外，目前研究對蝦過敏原消減技術主要集中在純化后過敏原的消減，而對于整只蝦、蝦仁或者蝦肉糜的研究較少，是否會有同樣的消減作用，仍需進一步的確認和關注。