殼聚糖?羅倫隱球酵母涂膜處理對葡萄柚貯藏品質的影響

黃二賓，杜嶸宇，楊清，吳化雨，李賢忠，王芳,2，鄧佳,3

殼聚糖?羅倫隱球酵母涂膜處理對葡萄柚貯藏品質的影響

黃二賓1，杜嶸宇1，楊清1，吳化雨1，李賢忠1，王芳1,2，鄧佳1,3

（1.西南林業大學 林學院，昆明 650224；2.西南地區生物多樣性保育國家林業和草原局重點實驗室，昆明 650224；3.西南山地森林資源保育與利用教育部重點實驗室，昆明 650224）

研究殼聚糖?羅倫隱球酵母生物活性膜處理對葡萄柚果實抗病保鮮及貯藏品質的影響。以“里約紅”葡萄柚為實驗材料，采用殼聚糖（10 g/L）、羅倫隱球酵母發酵液（1×107CFU/mL）、殼聚糖?羅倫隱球酵母復合液對采后葡萄柚果實進行浸泡3 min處理，并設置CK組，在室溫條件（溫度為20 ℃±2 ℃，相對濕度為85%～90%）下貯藏。測定貯藏期間葡萄柚的果實發病率、果皮幾丁質酶活性、β?1, 3?葡聚糖酶活性、質量損失率、果實外觀色澤、營養物質、貯藏品質等指標。通過主成分綜合評分法分析最佳的抗病保鮮方式。在室溫貯藏過程中，與CK組相比，殼聚糖、羅倫隱球酵母發酵液和殼聚糖?羅倫隱球酵母復合液處理組均能有效降低葡萄柚果實青霉病的發病率和病斑直徑，在一定程度上誘導提高果皮抗病防御酶活性；抑制葡萄柚果實失水，增強果實的鮮亮度；延緩營養物質的流失。其中，殼聚糖?羅倫隱球酵母復合液處理對保持采后葡萄柚果實的貯藏品質最好。主成分分析結果表明，葡萄柚貯藏品質的綜合得分順序為殼聚糖?羅倫隱球酵母復合膜>CTS膜>膜>CK。采用殼聚糖?羅倫隱球酵母生物活性膜處理對采后葡萄柚果實青霉病的抗病保鮮效果最好，能夠明顯降低果實的發病率，保持更好的貯藏品質。

生物活性膜；葡萄柚；抗病；貯藏品質

葡萄柚（）又稱西柚，系蕓香科柑橘屬常綠喬木果樹，是世界上柑橘四大類群之一[1]。柑橘類果實在采后貯藏過程中易感染綠霉、青霉等病害[2]。以擴展青霉（,）引起的青霉病是最為嚴重、發病率最高的病害[3]。當前，柑橘類果實的貯藏保鮮方法以化學殺菌劑和低溫貯藏為主[4]。大部分貯藏設備存在投資成本較高、操作要求較高等缺點，甚至存在食品安全隱患。近年來，涂膜保鮮技術在果品采后保鮮產業迅猛興起，探尋綠色環保的復合涂膜保鮮技術是柑橘類果品未來保鮮技術領域的發展趨勢。

殼聚糖（Chitosan, CTS）主要來源于甲殼素，具有可降解、抗菌性和成膜性，在食品包裝方面的應用較多[5]，且它具有較好的附著性，將該膜涂于果實表面，可阻止氧氣的侵入和二氧化碳的排出，有效降低果實的呼吸作用，延緩組織細胞的衰老，阻止病原菌的侵入，延長采后果品的貯藏時間[6]。單一殼聚糖涂膜的效果不及化學殺菌劑的效果，為了改善膜的抗菌性，進一步提高殼聚糖涂膜的保鮮效果，可將一些抗菌物質加入殼聚糖膜中，制成生物活性膜液。有研究表明，在殼聚糖中添加聚環氧乙烷可以提高膜的物理性質[7]，向殼聚糖溶液中添加果皮提取物、植物精油、維生素C等可以提高其殺菌性能和抑菌性能[8]。生防菌——羅倫隱球酵母（,）具有較強的拮抗抑菌效力，還能誘導果品抗病防御系統的形成，既可單獨用于多種果品的采后病害防治，又能與物理方法、化學物質和生物源物質在采前、采后配合使用，故被認為是一種具有良好應用前景的生防酵母菌。有研究表明，在羅倫隱球酵母中添加藻朊酸鹽可以有效地抑制草莓的灰霉病[9]，在羅倫隱球酵母中添加氯化鈣可以有效地抑制梨的青霉病和灰霉病[10]。

有研究表明，海藻酸鈉?羅倫隱球酵母生物活性膜可降低藍莓的采后發病率[11]，顯著降低果實的質量損失率和腐爛率，維持果實的糖、酸和花青素等含量，保持果實中SOD、CAT和POD酶的活性，減小超氧自由基對細胞的損害，維持采后藍莓的品質[12]。前期研究發現，采用羧甲基纖維素與羅倫隱球酵母復合處理可抑制葡萄柚果實采后綠霉病的發生，有效防止貯藏期間果實營養品質的下降，表現出較好的保鮮效果[13]。目前，關于殼聚糖與羅倫隱球酵母復合膜處理對果實貯藏期外觀品質的影響鮮有報道。鑒于此，文中將殼聚糖與羅倫隱球酵母（CTS?）發酵液制備成生物活性膜，研究其對葡萄柚果實貯藏期間抗病保鮮效果的影響。

1 實驗

1.1 材料

主要材料：“里約紅” 葡萄柚，購于云南省玉溪市嘎灑鎮葡萄柚果園；羅倫隱球酵母（.由筆者課題組前期分離自葡萄柚果實表面，并保存；擴展青霉（.），分離自葡萄柚發病果實表面，并保存。

1.1.1 培養基配制

YM液體培養基、PDA固體培養基的配制參照馬電通等[2]的方法。

1.1.2 擴展青霉、羅倫隱球酵母的活化

1）擴展青霉（.）活化。將保存在甘油管的.進行三級畫線，接種在PDA固體培養基上，并置于培養箱內培養，培養箱的溫度調至28 ℃。在3 d后采用顯微鏡觀察其形態，重復3次活化實驗，以確保.成活，培養至1×105CFU/mL，備用。

2）羅倫隱球酵母（）活化。將保存好的接種在YM液體培養基中，并在28 ℃、120 r/min的搖床上培養至1×107CFU/mL，備用。

1.2 試劑及設備

主要試劑：殼聚糖（CTS），河南萬邦實業有限公司；蛋白胨、麥芽浸粉、葡萄糖、酵母粉、瓊脂、3,5?二硝基水楊酸、酚酞、草酸、氫氧化鈉、甲醇、鹽酸，上海滬試實驗器材股份有限公司；2,6?二氯酚靛酚鈉、3,5?二硝基水楊酸、冰乙酸、氫氧化鈉，國藥集團；無水氯化鈣，昆明華森實驗設備有限公司。

主要設備：HH?B11?BS?Ⅱ恒溫培養箱，上海躍進醫療器械有限公司；SW?CJ?2FD 超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；MIKRO 220R冷凍型臺式高速離心機、Nikon YS100型電子顯微鏡，廣州頤騰貿易有限公司。

1.3 方法

1.3.1 不同膜溶液的配制

配制20 g/L的殼聚糖溶液，用磁力機攪拌1 min，再加入7 mol/L的冰乙酸15 mL，繼續攪拌2 min，至殼聚糖完全溶解，再用40 g/L 氫氧化鈉調至殼聚糖溶液pH值為5.5～5.8。將20 g/L 殼聚糖溶液用蒸餾水稀釋為10 g/L 殼聚糖溶液。在 YM液體培養基中培養，至1×107CFU/mL, 待用。

1.3.2 不同膜的制備

將1.3.1節配制的CTS（20 g/L）與（1×107CFU/mL）按體積比1∶1均勻混合，得到CTS?膜液。將7 mL的CTS（10 g/L）、（1×107CFU/mL）和CTS?膜液分別倒入60 mm的培養皿，置于室溫條件干燥成膜后，在培養皿中加入30 g/L的氯化鈣溶液浸泡5 min，隨后將膜從培養皿上剝離下來，并置于室溫條件下晾干。

1.3.3 試樣處理

從購買的果實中挑選色澤、大小、成熟度基本一致，無病害，無損傷的果實。用蒸餾水將果實洗浄后，再使用體積分數為75%的酒精擦拭果實表面，以消毒，并置于框中在室溫下貯藏備用。將葡萄柚分為4組，每組有6個果實，共24個果實，分別置于蒸餾水（對照組，CK）、CTS（10 g/L）、、CTS?等4組液體中浸泡3 min，取出后晾干備用。

1.3.4 不同涂膜處理對葡萄柚果實抗青霉病的效果

1.3.5 生物活性膜處理對葡萄柚果實抗病防御酶活性的影響

果實浸泡涂膜處理方法同1.3.2節的操作方法，每個處理組有18個果實，共需72個果實。將處理后的果實置于室溫條件下晾干，采用塑料保鮮袋包裝果實，在室溫條件下貯藏。分別在處理后的0（處理后2 h）、5、10、15、20、25 d時對果肉、果皮進行取樣，并做標記，置于?80 ℃低溫冰箱中保存，待用。防御酶指標的測定采用蘇州夢犀生物科技股份有限公司試劑盒，防御酶包括幾丁質酶（Chitinase, CHI）和β?1,3?葡聚糖酶（β?1, 3?glucanase, GLU）。

1.3.6 色差的測定

1.3.7 果實質量損失率的測定

1.3.8 生物活性膜處理對葡萄柚果實貯藏品質的影響

這里的處理條件和取樣時間同1.3.5節操作方法，測定指標包括可滴定酸（Titrate acid, TA）、還原糖（Reducing sugar，RS）、抗壞血酸（Ascorbic acid，ASA）、可溶性固形物（Soluble solid content，SSC）等含量，參考曹建康等[16]的實驗操作方法進行測定。

1.4 數據處理與分析

采用單因素實驗設計，共4個處理組，每組重復3次實驗，實驗重復2遍。采用Excel 2010、Origin 2019、SPSS 26.0軟件對數據進行分析、制圖、單因素方差分析和鄧肯氏多重比較，0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同膜材料的形態

從圖1可知，不同膜的顏色、形態和韌性也不同。顏色：膜呈現淡黃色半透明狀；CTS膜為無色透明；CTS?復合膜呈現淺黃色半透明狀，其顏色略比膜的顏色淺。表面光滑程度：CTS膜的表面粗糙；膜的表面光滑；CTS?復合膜的表面粗糙程度略低于CTS膜。柔韌性：CTS?復合膜的韌性較好，取出后膜的形態完整；CTS膜較脆、易折，取出后膜呈碎片狀；膜黏附在培養皿上，取膜較困難。結果表明，CTS?可以更好地在果實表面形成一層生物活性膜，提高了在果皮上的定殖能力，對果實的抑菌效果更好。

2.2 不同涂膜處理對葡萄柚果實青霉病的抑制效果

由圖2a可知，接種病原菌在2 d后使所有果實都開始發病，3個處理組與CK組相比，均顯著（<0.05）抑制了葡萄柚的果實發病率。其中，經CTS?處理后果實的發病率最低。如圖2b所示，果實病斑的變化趨勢與發病率趨勢相似，各處理組果實的病斑直徑均呈上升趨勢。在接種后6～7 d，和CTS?處理組果實的病斑直徑顯著小于其他處理組果實的病斑直徑（<0.05）。在接種后8～11 d，CTS?處理組果實的病斑直徑最小（<0.05）。綜合來看，在整個貯藏期，CTS?對葡萄柚果實青霉病（）的抑制效果最顯著（<0.05）。

段主任接過化驗單便笑了，說：他不是有醫保嗎？王姐趕緊解釋說：我妹夫是有醫保，就是沒醫保，得了病，也不能治。主要不是我妹夫喘得歷害嗎？尋思能不折騰就盡量不折騰他了嗎。段主任便找來護士，抽出幾張化驗單說：廣雨辰這個病人我了解，除了肺功和心電外，其余的化驗就不用給他做了。

圖1 不同生物活性膜材料

圖2 不同生物活性膜處理對貯藏期葡萄柚果實青霉病的影響

注：同一時間不同小寫字母表示在<0.05的水平差異性顯著，下同。

2.3 不同涂膜處理對葡萄柚果實抗病防御酶活性的影響

GLU和CHI在植物抵御病原菌侵染過程中起著重要作用[17]。由圖3a可知，整個貯藏期間葡萄柚果皮GLU酶活性總體呈先下降再上升再下降的趨勢，.處理組在第20天、第25 天與CK組無顯著性差異，其他處理組均有差異。CTS?.處理組果皮GLU酶活性顯著（<0.05）高于CK組。在貯藏期間，所有處理組中CTS?.的GLU酶活性最高。由圖3b可知，隨著貯藏時間的延長，葡萄柚果皮CHI酶活性總體呈先上升后下降的趨勢。除貯藏第15天和25天外，在貯藏期間3組處理組與CK組相比，對果皮的CHI酶活性都有顯著性提高（<0.05）。在貯藏第10天，各處理組的CHI酶活性達到最高值，CTS?.、CTS和.處理組果實的酶活性分別比CK組果實的酶活性高1.45、1.45和1.32倍。

圖3 不同生物活性膜處理對貯藏期葡萄柚果皮酶活性的影響

2.4 不同涂膜處理對葡萄柚果實質量損失率的影響

在貯藏期間，果實的呼吸作用會影響水分含量，導致水分逐漸流失，從而影響果實的商品價值。隨著貯藏時間的延長，各處理組果實的質量損失率不斷上升，見圖4。在貯藏期間，3組涂膜處理組果實的質量損失率均低于CK組果實的質量損失率，且差異顯著（<0.05），除第15天.處理組外。在貯藏25 d時，CTS?.、CTS和.組果實的質量損失率比CK組果實的質量損失率分別降低了1.37%、4.12%、6.53%。

圖4 不同生物活性膜處理對貯藏期葡萄柚果實質量損失率的影響

2.5 不同涂膜處理對葡萄柚果實外觀色澤的變化

隨著貯藏時間的延長，果實的值總體呈下降的趨勢，CTS?.處理組果皮的值高于CK組的值，在貯藏初期（5～10 d）存在顯著性差異（<0.05），這表明CTS?.處理能夠提高果皮的亮度。在整個貯藏期間，除第20天外，CTS?.處理組果皮的值顯著（<0.05）低于CK組的值，這表明CTS?.組果皮呈綠色，CK組果皮由綠轉紅；除貯藏第5天外，CTS?.處理組果皮的值顯著（<0.05）高于CK組果實的值，這表明CTS?.組與CK組相比，其果皮顏色由藍色轉黃色的時間提前。此外，單一顏色不能代表果皮色澤的真實變化，在貯藏10～25 d時，CTS?.處理組果皮的/值顯著（<0.05）低于CK組的/值，該處理有效延緩了果皮色澤向紅黃色轉變的進程。在貯藏中后期（15～25 d），CTS?.處理組果皮的值顯著（<0.05）高于CK組的值，有效增加了果皮的色澤飽和度，見表1。

采后葡萄柚果實在后熟作用下，其果皮從青綠向黃紅轉變，CTS?.處理在一定程度上維持了果品采收時的外觀光澤品質，延緩了果皮后熟轉色的進程。

2.6 不同涂膜處理對葡萄柚果實營養品質的影響

在葡萄柚果實中含有豐富的糖、酸和抗壞血酸，隨著果實貯藏時間的延長，以及貯藏環境的影響，這4種成分會隨之變化，因此可以將其作為評價果實營養品質和貯藏效果的重要指標[18]。

由圖5a可以看出，果實的抗壞血酸含量呈先升后降的趨勢。原因是，近熟果實采后在短期內其營養物質（糖、抗壞血酸等）仍會繼續積累，含量會不斷升高，抗壞血酸含量也會有所增加。在貯藏期間果實的呼吸作用持續進行，營養物質會作為呼吸底物被消耗。隨著貯藏時間的延長，果實營養物質的消耗減少，因此抗壞血酸含量不斷降低。在貯藏過程中，CTS?.與CK組果實的抗壞血酸含量存在顯著性（<0.05）差異。在貯藏20 d時，各處理組果實的抗壞血酸含量達到了峰值，其中CTS?.處理組果實的抗壞血酸含量最高，顯著高于其他處理組（<0.05）。在貯藏25 d時，果實的ASA含量開始下降，與CK組相比，采用3種處理均能延緩果實抗壞血酸含量的下降進程。

表1 不同生物活性膜處理對貯藏期葡萄柚果實外觀品質的影響

注：表示果皮的亮度；為正值表示紅色，為負值表示綠色；為正值表示黃色，為負值表示藍色；表示飽和度；、、、越大表示顏色越深。

如圖5b所示，在貯藏期間，CK組葡萄柚果實的可滴定酸含量持續減少。經CTS?.處理后，在貯藏早期有效維持了果實的可滴定酸含量。在貯藏期間，除CTS和.處理在第5、15天外，其他處理組果實的可滴定酸含量均顯著（<0.05）高于CK組果實的可滴定酸含量。

由圖5c可見，采后葡萄柚果實的可溶性固形物含量增加。3種處理均不同程度地促進了可溶性固形物的增加，CTS?.處理的效果最明顯，在貯藏期間，該處理組果實的可溶性固形物含量顯著高于CK組果實（<0.05）的可溶性固形物含量。

由圖5d可知，在貯藏期間葡萄柚果實的還原糖含量呈先升后降的趨勢。經3種涂膜處理后，葡萄柚果實的還原糖含量保持相同的變化趨勢，并且顯著（<0.05）提高了果實的還原糖含量。CTS?.處理的效果最優，該處理組果實的還原糖含量明顯（<0.05）高于其他涂膜處理組果實的還原糖含量。

2.7 PCA綜合評價生物活性膜處理對葡萄柚果實貯藏性的影響

圖5 不同生物活性膜處理對貯藏期葡萄柚果實營養品質的影響

表2 主成分特征值和貢獻率

表3 主成分得分

3 討論

柑橘類果實在采后運輸和貯藏過程中容易感染青霉病害[19]。果實抗病性最直觀的外部表現為果實發病率和病斑直徑的變化[6]。研究表明，將拮抗生防菌與一些特殊的物質結合可以提高生防菌的抑菌能力，如水楊酸、殼聚糖、氯化鈣等[20]。另有研究表明，在羅倫隱球酵母中添加殼聚糖可以增強酵母的抗氧化能力，有效提高酵母對果實采后病害的生防效力[21]。在實驗中，采用CTS、.復合生物活性膜處理葡萄柚果實后接種青霉菌（.）發現，經涂膜處理后葡萄柚果實的發病率和病斑直徑顯著（<0.05）低于CK果實的的發病率和病斑直徑，其中CTS?.處理的效果最優。推測.添加CTS制備的復合膜，可以有效提高.在果實表面的定殖能力，延長酵母在果實表面的存活時間，從而提高酵母的生防效力。CHI和GLU是植物體內最重要的病程相關蛋白[22]，可分別降解β?1, 3?葡聚糖和病原真菌細胞壁的幾丁質，破壞病原菌的細胞結構，從而抑制病原菌的侵染、繁殖和生長[23-24]。文中實驗發現，CTS?.處理對果實GLU、CHI酶活性的誘導提高效果顯著優于CTS、.單獨處理，有效抑制了青霉菌的繁殖和侵染。在貯藏過程中，果實后熟軟化、表皮失水皺縮、果皮轉色、色澤變化是反映果實外觀品質的直接指標，經CTS?.復合膜處理后顯著推延了果實的轉色期，維持了采后果皮的亮度和飽和度，使果實表皮更加光澤鮮亮，降低了果實水分的損失，延緩了果皮的皺縮。

營養品質是果實品質的重要指標。果實在采后仍然會呼吸代謝，會消耗果實中糖、酸、抗壞血酸等呼吸作用底物，這些物質含量的變化可以用來衡量采后果實品質的好壞[25]。實驗結果表明，與CK組相比，采用3種涂膜處理均能有效維持果實的抗壞血酸、可溶性固形物、還原糖等含量，延緩可滴定酸含量的下降，減少果實營養物質的流失。主成分CTS?.處理的抗病保鮮效果最好，推測可能是CTS?.處理使果皮表面形成了多糖?酵母復合膜，減緩了果實的呼吸強度，降低了呼吸作用對果實營養物質的消耗，能夠防止果皮的氧化，維持采后果實的營養品質。

4 結語

采用CTS?.生物活性膜處理能有效誘導提高果實抗病防御酶（β?1,3葡聚糖酶和幾丁質酶）的活性，明顯抑制了葡萄柚果實青霉病害的發生，延緩了果皮的皺縮，增強了果皮的鮮亮度，有效改善了果實的外觀品質，降低了果實可溶性固形物、抗壞血酸、可滴定酸、還原糖等含量的下降速率，減緩了果實內在營養物質的消耗，維持了采后葡萄柚果實的營養品質。

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Effect of CTS-Bioactive Film on Quality of Grapefruit During Storage

HUANG Er-bin1, DU Rong-yu1, YANG Qing1,WU Hua-yu1,LI Xian-zhong1,WANG Fang1,2,DENG Jia1,3

(1. College of Forestry, Southwest Forestry University, Kunming 650224, China; 2. Key Laboratory of National Forestry and Grassland Administration on Biodiversity Conservation in Southwest China, Kunming 650224, China; 3. Key Laboratory for Forest Resources Conservation and Utilization in the Southwest Mountains of China, Ministry of Education, Kunming 650224, China)

The work aims to investigate the effects of chitosan-yeast bioactive film coating treatment on disease resistance, preservation and quality of grapefruit during storage. With ''Rio Red'' grapefruit as the experimental material, harvested grapefruit was soaked respectively with 10 g/L chitosan, fermentation broth ofyeast (1×107CFU/mL) and chitosan-yeast complex solution for 3 min. A deionized-water-treatment group was set as the CK group, and then they were stored at room-temperature conditions (temperature: (20±2)℃, relative humidity: 85%-90%). Quality indicators of fruits during storage such as disease incidence of fruits, chitinase and β-1,3-glucanase activity of peels, weight loss of fruits, color and nutrient quality were determined during storage. The best way of preservation was analyzed through the comprehensive principal component scoring method. During the storage at room temperature, the disease incidence and diameter lesions were effectively reduced in grapefruit through the treatment of chitosan,and chitosan-compared with the CK group. The activity of fruit peel resistance defense enzymes was enhanced to a certain extent after different treatments. These treatments also exhibited excellent preservation effects, such as the inhibition of weight loss, the enhancement of peel brightness and the delaying of nutrients loss. Among these treatments, with chitosan-complex solution, the best postharvest quality of fruit was maintained. The results of principal component analysis showed that the comprehensive score of grapefruit storage quality was in the following order: chitosan-composite film > CTS film >film > CK film. Chitosan-bioactive film treatment has the best effect on the disease resistance and preservation of green mold of harvested grapefruit, which can significantly reduce the incidence of disease and maintain fruit storage quality.

bioactive film; grapefruit; disease-resistance; storage quality

TS255.3

A

1001-3563(2023)01-0185-10

10.19554/j.cnki.1001-3563.2023.01.021

2022?10?05

云南省農業聯合專項（202101BD070001?065）；國家自然科學基金（31960326，32160394）；云南省高層次人才培養支持計劃（YNWR?QNBJ?2020?205）；云南省“兩類”人才培養項目（202105AC160045）；科技處科研預研基金（110822082）

黃二賓（1995—），男，碩士生，主攻經濟林栽培與利用。

鄧佳（1983—），女，教授，博士，主要研究方向為經濟林（果樹）栽培與利用。

責任編輯：彭颋