大灰蘚低溫響應的時間動態*

關易云，雷純義，王倩，巫韜，劉蔚秋

1.廣東省熱帶亞熱帶植物資源重點實驗室/中山大學生態學院，廣東深圳 518107

2.廣東封開黑石頂省級自然保護區管理處，廣東肇慶 526536

3.江西省林業科技推廣和宣傳教育中心，江西南昌 330038

自然環境中的水分、熱量、光照和營養鹽等因子處于波動中，當這種波動范圍大于植物的最適生長范圍時，植物即處于脅迫狀態。溫度脅迫是植物最常面臨的環境脅迫之一，在遭遇溫度脅迫時，植物代謝失衡將導致活性氧的積累以及膜穩定性的破壞，進而影響植物的生長、代謝和發育［1-2］。

植物在其演化過程中，形成一系列適應機制以度過不良環境。植物內源激素是植物重要的生長調節物質，脫落酸（ABA）、乙烯（ETH）、茉莉酸（JA）和水楊酸（SA）在脅迫條件下作為整合外部脅迫信號和內部代謝的信使，調節植物的脅迫響應，被定義為脅迫激素［3-4］。ABA 在植物脅迫響應中起著關鍵作用，ABA 積累可以激活一系列脅迫代謝的活性［4-6］。ETH、JA 和SA 常被認為主要與生物防御有關［7］，但它們在非生物脅迫響應中亦具重要作用［8-9］，而目前有關ETH、JA 和SA 對苔蘚植物脅迫調節的研究很少［6］。抗氧化防御系統是植物重要的脅迫響應途徑，在脅迫條件下抗氧化酶如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物歧化酶（POX）等的活性上升以清除體內過量的活性氧。溫度脅迫亦可導致植物體內的滲透調節物，如脯氨酸、可溶性糖等含量上升，以應對非適宜溫度導致的滲透脅迫［10］。苔蘚植物的內源激素、抗氧化系統和滲透調節物均積極參與植物的低溫響應過程［11-12］。

植物在由適宜溫度向非適宜溫度的轉換過程中，會經歷一個代謝調節過程，不同的代謝途徑在此過程中會經歷不同的變化，且這種變化與植物的種類、品種均密切相關［13-15］。另外，植物在經歷溫和的低溫環境馴化后，常常會形成脅迫印記，使其可以更好地應對未來的同類或不同類脅迫［6，16］。了解植物在非最適溫度條件下的代謝調整動態有助于人們深刻認識植物的脅迫適應策略，也有助于人們認識植物溫度馴化及脅迫印記的建立機制［13，17］。

苔蘚植物體型矮小、結構簡單、缺少角質層和維管組織，但其種類繁多、分布廣泛，為繼被子植物之后的第二大陸生植物類群，同時其系統位置重要，研究苔蘚植物脅迫響應特征可豐富人們對植物脅迫響應機制的認識，并為其保護提供理論依據。雖然對于苔蘚植物低溫脅迫的響應已經有一系列研究，但有關苔蘚植物在低溫響應過程中的時間動態尚未見報道，基于此，我們以廣泛分布的大灰蘚（Hypnum plumaeforme）作為研究對象，研究其在適宜溫度環境（15～20 ℃）和非最適的溫和低溫環境（2～4 ℃，正常年份實驗研究地黑石頂地區的最低溫）條件下氧化脅迫及其生長調節特征，探討大灰蘚對低溫響應的開啟過程及其響應機理，并探討苔蘚植物中的脅迫記憶物質。

1 材料和方法

1.1 研究地概況

研究點位于廣東省肇慶市封開縣黑石頂自然保護區（23°25′～23°29′N，111°49′～111°55′E），屬南亞熱帶濕潤季風氣候，根據位于保護區氣象站的數據，保護區年均溫度約19.5 ℃，最低月均溫（1月或2 月）和最高月均溫（7 月或8 月）分別為10.3～10.6 ℃和26.3～28.4 ℃；年降雨量1 740～2 096 mm，其中79%的降水集中在4～9月。

1.2 實驗設計

在黑石頂自然保護區野外環境采集生長狀況良好的大灰蘚配子體植物材料，種于33 個30 cm×50 cm 的人工種植床內，種植密度模仿野外生長情況，種植床置于一林緣山谷中自然條件馴化1 周，馴化期間保持土壤濕潤。馴化期間平均氣溫為16.3 ℃。馴化結束后，取3 個盆的樣品作為起始（0 h）樣品。剩余30 個種植盆平均放入兩個光照培養箱中（每個培養箱15 盆，分別作為對照組和低溫處理組），培養箱光周期均設置為12 h 黑暗/12 h光照，光照強度約為2 000 lx，其中低溫處理組溫度設置為2 ℃（黑暗）/4 ℃（光照）；對照組溫度設置為15 ℃（黑暗）/20 ℃（光照）。放入時先開始12 h光照處理，處理期間每天均勻噴水保持苔蘚表面濕潤，實驗共持續276 h。在處理12、36、84、180 h以及處理結束時（276 h）分別取出3 個低溫組和對照組種植盆，剪取苔蘚植物上部2 cm 部分用于相關生理指標測定。為避免日周期的影響，每次取樣時間均在光周期結束時進行。

1.3 生理指標測定

剪下的苔蘚植物樣品用蒸餾水反復沖洗干凈后迅速用吸水紙吸干水分，立即置于液氮中貯存并于24 h內完成相關生理指標測定。

1.3.1 植物激素測定 取1.0 g 苔蘚樣品用7 mL

經預冷的PBS 緩沖液（pH=7.4）研磨，在4 ℃條件下提取1～2 h，4 000 r/min離心15 min后收集上清，離心管封口，-20 ℃冷凍保存。ABA、ETH、SA以及JA 含量采用ELISA 試劑盒（上海酶聯生物科技有限公司，中國上海）測定。

1.3.2 丙二醛、過氧化氫及相關酶活測定 取0.5 g苔蘚樣品用7 mL 經預冷的提取緩沖液［0.1 mol/L pH 7.8的PBS緩沖液，內含0.1 mmol/L EDTA-Na2和φ=16%甘油］低溫研磨提取，所得勻漿倒4 ℃條件下12 000 r/min離心5 min，取上清液待測。此提取液用于丙二醛（MDA）、過氧化氫（H2O2）、SOD（EC 1.15.1.1）、CAT（EC 1.11.1.6）和愈創木酚POX（EC 1.11.1.7）以及可溶性蛋白的檢測。

MDA 含量采用硫代巴比妥酸（TBA）顯色法［18］測定；H2O2含量用南京建成生物工程研究所（中國南京）試劑盒測定；可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍顯色法［19］。SOD 和POX 活性分別采用氯化硝基四氮唑藍（NBT）光還原法［20］和愈創木酚法測定［18］；CAT活性根據李仕飛等［21］的方法改進后測定。

1.3.3 脯氨酸含量測定 稱取1.0 g的苔蘚樣品用事先預冷的氨基酸提取液30 mL研磨提取，室溫放置5 min后抽濾，濾液轉入干凈的三角瓶中，向三角瓶中加入5 mL 氯仿，6 mL 蒸餾水，搖晃混勻后轉入50 mL離心管靜置分層。待分層清晰后，收集上層水相，并向氯仿相加入φ=50%甲醇6 mL，搖晃混勻，待液體再次分層后取表面水相，與上一次分層水樣合并，加蒸餾水補至40 mL，即得氨基酸提取液［22］。脯氨酸測定方法參考李紹軍等［23］的方案。

1.3.4 可溶性糖含量測定 稱取0.3 g 苔蘚樣品，用預冷的φ=80%乙醇20 mL 研磨提取，提取混合物于80 ℃水浴提取30 min。冷卻后抽濾，濾液定容至50 mL，加入0.5 mL飽和堿式醋酸鉛溶液，搖勻以沉淀蛋白質等雜質。沉淀充分后加入0.2 g 草酸鈉以除去過量的鉛離子，過濾即得到可溶性糖提取液。蒽酮比色法測定可溶性糖含量［18］。

1.4 數據統計方法

各指標在相同條件下不同取樣時間的差異顯著性采用單因素方差分析（ANOVA，LSD，P<0.05），同一取樣時間不同溫度處理間的差異顯著性采用獨立樣本t-檢驗（P<0.05）。分析軟件均為SPSS 23.0。

2 結果與分析

2.1 氧化脅迫

對照處理組在實驗期間MDA含量無顯著變化，而低溫處理12 h 時MDA 含量略有上升（差異不顯著），但此后MDA含量降低并趨于穩定（圖1a）。

在實驗期間，對照組H2O2含量略有波動，而低溫處理組中H2O2含量波動幅度遠大于對照，且整體水平略高于對照組，180 h 后對照組和低溫組大灰蘚的H2O2含量漸趨一致（圖1b）。

圖1 溫度處理276 h期間大灰蘚體內丙二醛（MDA）和過氧化氫（H2O2）含量的動態變化（平均值±標準差，n=3）Fig.1 Dynamics of malondialdehyde(MDA),and H2O2 contents in Hypnum plumaeforme during the 276 h treatment(mean±S.D.,n=3)

2.2 抗氧化酶活性

實驗處理初期低溫組和對照組的SOD 活性均下降，但對照組至12 h 后逐漸上升，到180 h 時恢復至初始水平；低溫組SOD 活性在36 h 時達到最低，此后逐漸回升，但始終低于初始值，亦低于對照組（圖2a）。

實驗處理期間CAT活性呈下降趨勢，但低溫組的CAT 活性整體略高于對照（圖2b）。POX 活性在處理84 h之前呈明顯的波動狀態，低溫組在處理實驗12 h時顯著上升，到36 h時降至初始水平，至84 h再次回升，對照組則表現出剛好相反的波動趨勢；實驗處理84 h后，對照組和低溫組POX活性均呈下降趨勢，且低溫組POX活性高于對照組（圖2c）。

2.3 相容性物質含量

實驗期間，對照組和低溫組大灰蘚可溶性蛋白含量均呈下降趨勢，兩者間的差異相對較小（圖2d）。

對照組的可溶性糖含量在實驗期間較穩定，僅在處理12 h 時有小幅下降，而低溫處理組可溶性糖含量在36 h 后大量積累，至84 h 達到峰值，較初始值升高64.49%，至276 h 時仍較初始值高40.94%。實驗期間低溫組可溶性糖含量整體高于對照組，特別是在84 h 后低溫組可溶性糖含量大幅上升，遠高于對照組（圖2e）。

對照組脯氨酸含量在實驗期間無顯著變化，但低溫處理組中脯氨酸含量持續降低，至180 h 后趨于穩定的趨勢，在實驗結束時（276 h）低溫處理組中脯氨酸含量較初始值降低了40.11%（圖2f）。

圖2 溫度處理276 h期間大灰蘚體內超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和過氧化物歧化酶（POX）活性以及可溶性蛋白、可溶性糖和脯氨酸（Pro）含量的動態變化（平均值±標準差，n=3）Fig.2 Dynamics of superoxide dismutase(SOD),catalase activity(CAT)and guaiacol peroxidase(POX)activities in Hypnum plumaeforme during the 276 h treatment(mean±S.D.,n=3)

2.4 激素含量

由圖3 可見，所測定的4 種激素在實驗期間表現出類似的動態特征：對照條件時激素水平整體波動較小，而在低溫條件下，4 種激素在12 h 時含量大幅上升，此后下降，至36 h 時與初始值接近，之后逐漸升高并趨于穩定。至276 h 的實驗結束時，低溫處理組ABA、JA、SA和ETH含量較初始值分別上升22.9%、98.3%、70.4%和71.6%，且均顯著高于同一時間對照組。

圖3 溫度處理276 h期間大灰蘚體內脫落酸（ABA）、茉莉酸（JA）、水楊酸（SA）和乙烯（ETH）含量的動態變化（平均值±標準差，n=3）Fig.3 Dynamics of abscisic acid(ABA),jasmonates(JA),salicylic acid(SA)and ethylene(ETH)contents in Hypnum plumaeforme during the 276 h treatment(mean±S.D.,n=3)

3 討 論

3.1 氧化脅迫響應

低溫條件下，由于光系統受損，導致細胞內O2-、·OH 和H2O2等活性氧成分積累［24-25］，但在其生長耐受閾值內，植物可通過多種途徑清除過量的活性氧，抗氧化酶系統是清除活性氧的主要機制之一［26-27］。低溫處理早期，不同物種或品種抗氧化系統變化格局明顯不同［13-14］。

H2O2可作為信號分子調節細胞功能，但高濃度H2O2損害植物的細胞的完整性［28］。本研究中，低溫處理大灰蘚體內H2O2的含量在12 h 時顯著高于對照，此后處于波動狀態，顯示在脅迫的過程中植物體內H2O2的積累和酶系統對其的清除處于動態調整過程中。MDA 是植物細胞膜過氧化的指標，顯示植物細胞膜受損程度［29］，在非最適溫度條件下，植物體內MDA 含量在早期上升，但此后會逐漸下降［14-15］，大灰蘚MDA 含量在2 ℃/4 ℃溫度條件下表現出相似的變化規律，在12 h 有小幅上升，但此后降至初始水平，顯示大灰蘚可通過自身調節較好地應對2 ℃/4 ℃的非最適生長溫度。

SOD 作為抗氧化酶系統中第一步起作用的酶，在植物抗氧化脅迫中起著重要作用［30］，但不耐寒植物在低溫處理時SOD 活性可能降低［27］，此前我們的研究亦顯示，大灰蘚和小金發蘚在低溫條件下SOD 酶活性均下降［11］。本研究中SOD 在低溫前期迅速下降，且36 h 后一直明顯低于對照，與此前的研究結果一致。另外，植物體內MDA 含量并未大幅上升，我們推測非酶活性氧清除系統參與了低溫條件下活性氧O2-、·OH 的清除。CAT 和POX 是清除H2O2的主要酶系統。本研究中，對照組大灰蘚在實驗期間CAT 和POX 活性均表現出大的變化，可能與培養箱水濕條件與自然環境有一定差異有關。處理期間低溫處理組CAT 活性整體高于對照組；低溫處理組POX 活性在84 h 后高于對照組水平，顯示苔蘚植物中CAT 和POX 在低溫條件下被激活參與H2O2的清除過程。

3.2 細胞滲透調節

低溫條件下植物會因水分吸收受阻和細胞失水間接引起滲透脅迫［31］，植物可以通過積累相容性物質，如可溶性蛋白、可溶性糖和脯氨酸等來增大細胞液濃度，以維持細胞滲透壓及膜穩定性［32-33］。

可溶性糖不僅可作為重要的滲透調節物質，還能為細胞代謝提供碳源和底物［34］，是植物滲透脅迫條件下普遍積累的細胞相容性物質之一。本研究中，低溫組大灰蘚體內可溶性糖在84 h 大幅升高至遠高于對照，此后整體維持在較高水平，脯氨酸在處理期間大幅下降且遠低于對照水平，而此前的研究顯示大灰蘚在1～3 ℃的低溫處理條件下，脯氨酸含量呈上升趨勢［35］，顯示大灰蘚脯氨酸的溫度響應較為復雜，其溫度響應的敏感度和溫度閾值尚需進一步研究。

3.3 抗逆激素調節

植物的低溫響應是一個高度復雜精細的過程，在此過程中發生復雜的信號級聯反應，而植物激素則往往是這些反應的信號物質［36］。ABA 可調控多種脅迫響應基因的表達，調節植物抗氧化活性及細胞相容性物種的積累［4，12，26］，脅迫條件下苔蘚植物體內ABA 含量亦大幅上升，為苔蘚植物脅迫響應的重要調控激素［6］，但不同物種植物在脅迫條件下JA、SA 和ETH 的變化存在一定的差異［6，37-39］，表現出明顯的物種分化。本研究中，低溫處理大灰蘚體內ABA、JA、SA和ETH含量變化的時間格局一致，均在12 h 時迅速上升，在36 h時顯著下降，在84～276 h 期間穩定上升。我們推測大灰蘚體內抗逆激素在低溫處理的12 h 內迅速升高，以迅速調節其代謝通路應對低溫環境，此后由于下游代謝物的積累對激素的含量產生負反饋調節導致激素含量降低，但之后植物逐漸適應低溫環境開始重建新的平衡狀態，各個激素含量回升并趨于穩定，至84 h后期4種抗逆激素保持在較高的穩定水平，共同調控低溫下大灰蘚的基因表達和生理生化過程。

4 結 論

較溫和的低溫處理（2 ℃/4 ℃）導致大灰蘚植物體內抗逆激素迅速響應，處理12 h 即大幅上升，顯示其作為信號及調節物質的快速響應。在低溫處理的前期，大灰蘚的H2O2含量和抗氧化酶指標亦從處理12 h 起即表現出較為劇烈的調整，在實驗處理期間植物體處在不斷的調整和適應過程中，而可溶性糖在84 h 時才明顯上升，顯示其響應速度相對較慢，處于調節通路的下游部分。處理84 h后，各項指標漸趨穩定，表明新的平衡逐漸形成。在實驗處理后期，植物體內積累的高含量抗逆激素和可溶性糖可作為苔蘚植物的脅迫印記物質。