血清miR-124-3p、miR-361-5p與晚期胃癌患者臨床病理特征、化療敏感性和PI3K/AKT/mTOR信號通路的關系

劉漢屈，張燕芳，張帆，孔娜，王建剛

胃癌是臨床常見消化道惡性腫瘤，至2019年我國胃癌發病率已達43.1/10萬左右[1]。化療可有效延長晚期胃癌患者生存期，但整體預后依然不理想，化療耐藥是化療失敗的主要原因[2]。微小RNA(miRNA，miR)在腫瘤增殖、侵襲、耐藥等多種生物學過程起著重要調控作用[3]。miR-124-3p、miR-361-5p在肺腺癌、胃癌病情進展中的作用已有報道，但研究多集中于體外研究或動物學研究[4-5]，而在臨床中的研究較少，且關于二者在胃癌患者外周血循環中的表達與臨床病理參數的關系尚不清楚。磷脂酰肌醇3激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/AKT/mTOR)是細胞自噬及耐藥的關鍵通路[6-7]。本研究旨在探討血清miR-124-3p、miR-361-5p與晚期胃癌患者臨床病理特征、化療敏感性及PI3K/AKT/mTOR通路的關系，為晚期胃癌的治療提供參考，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2020年3月—2022年2月云南省第三人民醫院消化內科收治的晚期胃癌患者90例為研究組，男48例，女42例，年齡48～73(61.30±7.61)歲；合并癥：高血壓13例，高脂血癥7例，糖尿病10例；不良習慣：吸煙史18例，飲酒史13例，喜腌制食品67例，喜辛辣食品47例，不進早餐40例；家族史：胃癌家族史14例，慢性萎縮性胃炎家族史15例；體力狀況ECOG評分0～1分58例，2分32例；TNM分期：ⅢB期28例，Ⅳ期62例。另選取同期醫院健康體檢者45例為健康對照組，男24例，女21例，年齡50～72(60.71±6.85)歲；不良習慣：吸煙史8例，飲酒史6例，喜腌制食品20例，喜辛辣食品15例，不進早餐13例；家族史：胃癌家族史1例，慢性萎縮性胃炎家族史2例。2組患者性別、年齡、吸煙史、飲酒史、不進早餐習慣占比比較，差異無統計學意義(P>0.05)；研究組患者喜腌制食品、喜辛辣食品、胃癌家族史、慢性萎縮性胃炎家族史占比高于健康對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。本研究通過醫院醫學倫理委員會批準[(2019)醫倫審第12號]，受試者及家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標準 (1)納入標準：①年齡18～85歲；②符合晚期胃癌診斷標準[8]，且經病理學或細胞學明確診斷，TNM分期ⅢB～Ⅳ期；③不符合手術切除指征者，或既往手術治療術后化療結束1年以上復發或單一遠處轉移者；④既往未接受含紫杉醇方案化療者；⑤卡氏評分>60分，ECOG評分≤2分；⑥有影像學測量病灶。(2)排除標準：①合并其他部位原發性惡性腫瘤者；②已出現腹膜、皮膚等廣泛性轉移者；③預計生存期不足3個月；④合并機體重要器官功能障礙者；⑤完全性腸梗阻者；⑥精神病史或交流障礙無法配合資料收集者。

1.3 治療方法 研究組患者入組完善各項檢查和采血后，接受紫杉醇+鉑類/5-氟尿嘧啶方案化療，具體方案：多西紫杉醇(哈爾濱三聯藥業股份有限公司)第1天給予75 mg/m2靜脈滴注，或紫杉醇(江蘇恒瑞醫藥股份有限公司)第1天給予135 mg/m2靜脈滴注；聯合注射用順鉑(齊魯制藥有限公司)20～25 mg/m2靜脈滴注，第1～3天，或氟尿嘧啶注射液(廣東嶺南制藥有限公司)600 mg/m2靜脈滴注，第1～5天。21 d為1個化療周期。所有患者化療至不能耐受藥物不良反應或疾病進展。

1.4 觀測指標與方法

1.4.1 血清miR-124-3p、miR-361-5p及外周血PI3K/AKT/mTOR信號通路mRNA表達檢測：治療前用含EDTA真空抗凝管和不含EDTA的真空管采集研究組和健康對照組受試者的空腹肘靜脈血4 ml 2份，不含抗凝劑的血樣離心后獲得血清樣本，-80℃保存待測，用于檢測miR-124-3p、miR-361-5p mRNA表達水平；含抗凝劑的血樣混勻后-80℃保存全血，用于檢測PI3K、AKT、mTOR mRNA表達水平。采用DNA抽提試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)獲得血清及全血中的基因組DNA，Trizol法提取總RNA，離心取上清液進行純度測定，采用逆轉錄試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司]將mRNA逆轉錄合成互補鏈cDNA，并以之為模板鏈進行實時熒光定量PCR(RT-qPCR)，按照試劑盒設定反應體系，反應條件為：95 ℃預變性45 s、95 ℃ 10 s、60 ℃ 20 s、72 ℃ 60 s，共進行40個循環，72 ℃延伸8 min。以U6為內參基因，2-△△CT計算miR-124-3p、miR-361-5p的相對表達量，以β-actin為內參基因，2-△△CT計算PI3K、AKT、mTOR的相對表達量。引物序列見表1。

表1 血清miR-124-3p、miR-361-5p及外周血PI3K/AKT/mTOR信號通路mRNA引物序列

1.4.2 化療敏感性評價：化療2個周期后采用《實體瘤的療效評價標準1.1(RECIST 1.1)》評估近期療效。所有目標病灶完全消失為完全緩解(CR)，所有可測量目標病灶長徑總和縮小≥30%為部分緩解(PR)，所有可測量目標病灶長徑總和增加≥20%為疾病進展(PD)，所有可測量目標病灶長徑總和變化在PR和PD之間為疾病穩定(SD)；CR與PR患者記為化療敏感亞組，SD與PD患者記為化療抵抗亞組。

2 結 果

2.1 2組血清miR-124-3p、miR-361-5p表達水平比較 研究組血清miR-124-3p、miR-361-5p相對表達量低于健康對照組，差異均有統計學意義(P<0.01)，見表2。

表2 健康對照組與研究組血清miR-124-3p、miR-361-5p表達水平比較

2.2 不同化療敏感程度亞組患者血清miR-124-3p、miR-361-5p表達水平比較 90例晚期胃癌患者均完成2個周期以上化療，其中CR 2例，PR 32例，SD 38例，PD 18例，化療敏感34例(37.78%)，化療抵抗56例(62.22%)。化療敏感亞組血清miR-124-3p、miR-361-5p相對表達量高于化療抵抗亞組，差異均有統計學意義(P<0.01)，見表3。

表3 化療敏感亞組和化療抵抗亞組血清miR-124-3p、miR-361-5p表達水平比較

2.3 不同化療敏感程度亞組患者外周血PI3K/AKT/mTOR信號通路mRNA表達比較 化療敏感亞組PI3K、AKT、mTOR mRNA相對表達量低于化療抵抗亞組，差異有統計學意義(P<0.01)，見表4。

表4 化療敏感亞組和化療抵抗亞組外周血PI3K、AKT、mTOR mRNA相對表達量水平比較

2.4 血清miR-124-3p、miR-361-5p在晚期胃癌患者不同臨床/病理特征中比較 不同性別、年齡、ECOG評分、病理類型、腫瘤位置的患者血清miR-124-3p、miR-361-5p水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)；低分化患者血清miR-124-3p、miR-361-5p水平低于中分化和高分化患者，且中分化患者血清miR-124-3p水平低于高分化患者(P<0.05)，而中分化與高分化患者血清miR-361-5p水平比較差異無統計學意義(P>0.05)；TNM分期Ⅳ期患者血清miR-124-3p、miR-361-5p水平低于ⅢB期患者(P<0.01)，見表5。

表5 血清miR-124-3p、miR-361-5p在晚期胃癌患者不同臨床病理特征中比較

2.5 血清miR-124-3p、miR-361-5p與PI3K/AKT/mTOR信號通路相關性分析 研究組化療前血清miR-124-3p、miR-361-5p與PI3K、AKT、mTOR mRNA相對表達量均呈負相關(P<0.05)，見表6。

表6 晚期胃癌患者血清miR-124-3p、miR-361-5p與PI3K/AKT/mTOR信號通路相關性分析

3 討 論

多數胃癌患者在確診時已是中晚期，失去最佳手術時機[9-10]。含紫杉醇化療方案是晚期胃癌或胃癌術后復發/轉移患者的主要治療手段，臨床療效顯著，且不良反應相對較少[11-12]。紫杉醇屬于天然抗癌藥，其抗腫瘤機制通過與微管蛋白或微管蛋白二聚體作用，誘導癌細胞有絲分裂周期停滯，從而阻止癌細胞無限增殖過程，但胃癌對紫杉醇耐藥頻發是晚期胃癌治療失敗的重要因素，尋找胃癌細胞藥物敏感的分子生物學靶標有重要臨床意義[13-14]。微小RNA一直是惡性腫瘤發生機制研究的熱點。越來越多研究顯示[15-17]，非編碼區單鏈小分子RNA通過與編碼區靶基因的3’-UTR區域在轉錄水平上特異性結合調控靶基因的表達，從而參與有絲分裂、凋亡、耐藥等過程。miRNA的異常表達可導致靶基因功能異常，從而導致癌細胞對化療藥物的吸收、代謝等過程造成影響，進而影響化療藥物敏感性[18]。

miR-124-3p定位于5q31.1，在多種惡性腫瘤的發生和其他相關疾病中具有潛在作用[19-20]。劉利平等[21]研究顯示，卵巢癌患者血清miR-124-3p異常低表達，且與腫瘤分級、分期及淋巴結轉移有關，是卵巢癌預后預測的潛在指標。miR-361-5p屬于miR-361家族成員之一，定位于X染色體q21.2外顯子，已有研究顯示其在卵巢癌、乳腺癌組織中低表達[22-23]，參與多種惡性腫瘤的發生及發展。本研究結果也可以看出，晚期胃癌患者血清miR-124-3p、miR-361-5p表達可能參與胃癌惡性進展，其表達水平與分化程度、TNM分期等病理特征有關。本研究中化療敏感者血清miR-124-3p、miR-361-5p表達水平更高，說明二者表達水平與晚期胃癌化療敏感性有關。細胞學研究顯示[24]，miR-124-3p在胃癌細胞中表達上調后可通過調節E-box同源框1(ZEB1)表達，促進癌細胞對紫杉醇的敏感性。Hu等[25]研究發現，miR-124-3p在乳腺癌組織及細胞系中表達顯著降低，且其表達水平與腫瘤大小、淋巴結轉移顯著相關，細胞水平上過表達miR-124-3p后可顯著增強乳腺癌細胞對阿霉素的敏感性。Cai等[26]研究提示，miR-124-3p在細胞水平可以克服肺腺癌細胞對培美曲塞的耐藥性。上述研究提示，miR-124-3p與惡性腫瘤對化療藥物的敏感性有關。Zheng等[27]研究顯示，miR-361-5p/Toll樣受體4信號通路可影響三陰乳腺癌細胞對紫杉醇的敏感性。臨床研究顯示[28]，雄激素可調控miR-361-5p表達參與去勢抵抗性前列腺癌對雄激素靶向治療的耐藥過程。以上研究提示，miR-361-5p表達可能是癌細胞化療敏感性的重要調控基因。

自噬是真核細胞的一種自我保護機制，同時具有雙重調控作用，PI3K/AKT/mTOR通路是細胞內調控自噬水平的關鍵通路，已成為腫瘤化療耐藥機制研究的熱點[29-30]。Gu等[31]研究表明，PI3K/AKT/mTOR通路可通過調控胃癌細胞自噬水平，提高胃癌細胞對順鉑化療的敏感性。新近研究顯示[32]，PI3K/AKT/mTOR信號通路中較高水平的突變基因數量可作為胃腺癌免疫治療效果的預測因子，提示使用該通路抑制劑有助于提高胃腺癌治療效果。上述研究說明，PI3K/AKT/mTOR參與調控自噬過程可能是影響胃癌細胞紫杉醇化療敏感性降低的決定因素。本研究發現，胃癌患者血清miR-124-3p、miR-361-5p與PI3K、AKT、mTOR mRNA相對表達量呈負相關，提示血清miR-124-3p、miR-361-5p可能通過負調控PI3K/AKT/mTOR信號通路而參與胃癌對含紫杉醇方案化療敏感性的調控。研究證實，miR-124-3p可通過與編碼區基因相互作用抑制PI3K/AKT/mTOR的激活，從而發揮抗鼻咽癌作用[33]；Jin等[34]發現miR-361-5p在有順鉑抗性的胃癌細胞系MGC803/DDP中的表達較MGC803細胞系顯著下調，提示miR-361-5p可能參與胃癌細胞順鉑耐藥的調控。由此可推測在胃癌中的調控機制可能為：miR-124-3p、miR-361-5p通過與PI3K/AKT/mTOR信號通路的靶基因的3’-UTR片段特異性結合從而抑制該信號通路的激活，通過抑制自噬來抑制胃癌的化療抗性，而發生化療抵抗的患者血清miR-124-3p、miR-361-5p處于低表達狀態，對自噬通路抑制效果不足從而導致化療耐藥發生[35]。

綜上所述，血清miR-124-3p、miR-361-5p與晚期胃癌分化程度、TNM分期及化療敏感性有關，而且二者的低表達水平可能通過負調控PI3K/AKT/mTOR信號通路而降低胃癌對紫杉醇化療的敏感性，為臨床晚期胃癌患者選擇合理化療方案提供參考依據。但miR-124-3p、miR-361-5p在胃癌中的分子生物學機制仍需要進行深入探討，在進一步研究中會針對治療前后血清miR-124-3p、miR-361-5p水平的變化與化療敏感性及PI3K/AKT/mTOR信號通路的相關性進行深入分析，為臨床研究提供更多理論支持。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

劉漢屈：設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫，資料搜集整理，論文修改；張燕芳：提出研究思路，論文審核；張帆、孔娜、王建剛：分析試驗數據，進行統計學分析