四種方法聯合檢測對病原學陰性肺結核的診斷價值

田麗麗 陳雙雙 樊瑞芳 張潔 王嫩寒 陳昊 代小偉 任怡宣 趙琰楓 李傳友 丁北川 李波 于蘭 易俊莉 王佩 楊新宇 宋衛萍

肺結核是一種以呼吸道傳播為主要途徑的慢性傳染病，對患者的生命健康造成嚴重危害，我國結核病新發患者居全球第3位，僅次于印度和印度尼西亞[1]。WHO發布的《全球結核病報告(2022年)》[1]中顯示，2021年全球結核病患者平均病原學(包括細菌學和分子生物學)檢測陽性率為63%，中國疾病預防控制中心結核病預防控制中心數據顯示，我國2021年結核病患者的病原學(細菌學和分子生物學)檢測陽性率為58%，比2020年的55%有所提升[2]；也有報道顯示菌陰肺結核患者比例顯著增加給我國結核病防治工作帶來巨大挑戰[3]。病原學陰性肺結核缺少細菌學的相關證據，容易出現誤診和漏診的現象[4]。隨著檢查技術的不斷發展，多種診斷技術的發明和使用可以減少此現象[5]。免疫學檢測技術如結核感染T細胞斑點試驗(T-SPOT.TB)和結核抗體(TB-Ab)已應用于結核病輔助診斷，尤其在病原學陰性的肺結核患者中意義更大[6-7]。近些年，血紅細胞沉降率(ESR)也被應用于輔助診斷結核病[8]。亦有些學者報道[9-10]，結核病患者超敏C-反應蛋白(hs-CRP)升高，亦可用于結核病的輔助診斷。本研究通過探討T-SPOT.TB、TB-Ab、ESR、hs-CRP 多指標聯合檢測在病原學陰性肺結核診斷中的價值，為完善和改進臨床病原學陰性肺結核的診斷提供一些思路。

資料和方法

一、一般資料

收集2020年7月至2022年7月北京市疾病預防控制中心結核病門診收治的初治且病原學陰性的肺結核患者216例，以及同期收治的147例病原學陽性的初治肺結核患者和455例其他肺部疾病患者。其中男439例(53.7%)，女379例(46.3%)。患者年齡18～85歲，中位年齡40(29,60)歲。根據《WS 288—2017肺結核診斷》[11]和《WS 196—2017結核病分類》[12]標準，臨床診斷病原學陰性肺結核216例(病原學陰性肺結核組)，包括男131例(60.6%)，女85例(39.4%)，年齡中位數(四分位數)為37(25，58)歲；病原學陽性肺結核147例(病原學陽性肺結核組)，男102例(69.4%)，女45例(30.6%)，年齡中位數(四分位數)為42(28，62)歲。依據文獻[13]確診其他肺部疾病455例(其他肺部疾病組) (上呼吸道感染424例、肺炎14例、肺癌1例、支氣管炎14例)，男210例(46.2%)，女245例(53.8%)，年齡中位數(四分位數)為42(30，61)歲。本研究經北京市疾病預防控制中心倫理委員會審核(2022-08)。

二、方法

1.T-SPOT.TB檢測：采用結核分枝桿菌特異性細胞免疫反應檢測試劑盒(TS-SPOT.TB試劑盒)，購自北京同生時代生物技術有限公司。從全血樣本中分離出外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)，在每個預包被抗γ-干擾素抗體的孔中加入2.5×105個PBMC，分別與早期分泌抗原靶蛋白6(ESAT6)、培養濾液蛋白10(CFP10)和Rv3615c共同孵育18～20 h，使用讀板儀對斑點進行計數。結果判讀標準：(1)陰性對照孔斑點數≤10，超過10個視為無效檢測樣本；(2)陽性對照孔斑點數應當≥20個或布滿整個孔底，如果斑點數<20個時，且通過檢測孔與陰性對照孔判定結果為陽性，則視為陽性結果，否則為無效樣本； (3)當陽性對照孔斑點數≥20個時，T-N等于5、6、7時，此結果認為是灰區，應當結合其他臨床診斷信息進行判斷，必要時重復實驗。

2.TB-Ab檢測：結核分枝桿菌IgG抗體檢測試劑盒(膠體金法)(MP Diagnostics ASSURE?TB Rapid Test)購自MP生物醫學亞太私人有限公司(MP Biomedicals Asia Pacific)。取患者血清25 μl至檢測孔內，加3滴緩沖液于橢圓孔，直至樣本前沿到達藍色指示線即刻拉下分離片，加1滴緩沖液于加樣孔，水平放置，15 min內判讀結果。結果判讀標準：(1)如果在測試線處(T)和質控線處(C)出現紫紅色條帶，則結核分枝桿菌抗體為陽性，任何深度條帶均應判作陽性；(2)如果視窗內僅質控線處(C)顯示紫紅色條帶，則結核分枝桿菌抗體陰性；(3)如果質控線處(C)條帶未顯示，則結果無效。

3.ESR測定：采用非可替(VACUETTE)全自動ESR檢測系統，采集患者外周靜脈血2 ml，注入含有3.8% 枸櫞酸鈉0.4 ml抗凝魏氏ESR采血管內充分混勻，并直立于ESR架上30 min，沉降管應垂直豎立，不能傾斜，觀察紅細胞下降的速度(mm/1 h)。ESR正常參考值男性0～15 mm/1 h, 女性0～20 mm/1 h。大于參考值上線為陽性。

4.外周血CRP測定:應用日立全自動生化分析儀 (型號:HITACHI7100),試劑購自北京萬泰德瑞診斷技術有限公司。嚴格按照儀器、試劑盒相關說明操作。采用速率散射比濁法檢測，檢測前經離心10 min分離血清(離心力2600×g),正常hs-CRP濃度0～5.0 mg/L，>5.0 mg/L均為陽性。

三、病原學陰性肺結核診斷流程

病原學陰性肺結核診斷是依據《WS 288—2017肺結核診斷》[11]和 《WS 196—2017結核病分類》[12]標準，專門針對病原學檢測陰性肺結核診斷制定的標準。本研究確診病原學陰性肺結核患者216例，通過門診部醫師詳細問診；實驗室檢查對每一例就診的疑似結核病患者進行3次涂片、2次培養、1次分子生物學檢測均為陰性，規范利用結核病免疫學輔助檢查，如T-SPOT.TB檢測和TB-Ab檢測，結合胸部影像學檢查如胸部X線攝片或CT檢查，門診部肺結核診斷小組多名資深醫生共同閱片，鑒別診斷(根據患者的臨床表現、胸部影像學特征、免疫學檢查結果，以及診斷性抗結核治療效果進行綜合判斷)后做出明確診斷。

四、質量控制

T-SPOT.TB檢測質量控制：每例患者進行T-SPOT.TB檢測的同時做試劑盒內提供的陽性和陰性對照，確保實驗結果的準確性；TB-Ab檢測質量控制：根據檢測反應板質控線條帶顯示判斷，嚴格按照試劑盒檢測規程以保證檢測準確性；ESR儀器每年行校準維護；每批次hs-CRP檢測行室內質控，并參與北京市臨床檢驗中心室間質評，考核合格。

五、統計學處理

采用SPSS 19.0軟件對數據進行統計分析。計數資料采用“例數，率(%)”描述，組間差異的比較采用卡方檢驗。 通過Kolmogorov-Smirnov方法檢驗數據是否呈正態分布，非正態分布的數據以“中位數(四分位數)[M(Q1，Q3)]”描述。采用診斷性試驗比較T-SPOT.TB檢測與其他方法對病原學陰性肺結核的診斷價值，繪制受試者工作特征曲線(ROC曲線)，計算ROC曲線下面積(AUC)。以P<0.05 為差異有統計學意義。

結 果

一、3組患者應用不同檢測方法陽性率比較

病原學陰性肺結核組、病原學陽性肺結核組、其他肺部疾病組3組患者T-SPOT.TB檢測陽性率分別為82.4%、87.8%、28.6%，陽性率差異有統計學意義(χ2=255.492，P=0.000)； 3組患者TB-Ab檢測陽性率分別為39.8%、55.8%、18.9%，陽性率差異有統計學意義(χ2=70.049，P=0.000)； 3組患者ESR檢測陽性率分別為22.7%、42.2%、7.5%，陽性率差異有統計學意義(χ2=96.703，P=0.000)； 3組患者CRP檢測陽性率分別為13.0%、36.73%、5.3%，陽性率差異有統計學意義(χ2=97.492，P=0.000)(表1)。與其他肺部疾病組相比較，四種檢測方法在病原學陰性肺結核組陽性率差異均有統計學意義(χ2值分別為170.953、 33.606、 31.271、 12.110，P值均<0.001)，在病原學陽性肺結核組陽性率差異均有統計學意義(χ2值分別為158.758、75.117、99.832、97.503，P值均<0.001)；與病原學陽性肺結核組相比較，TB-Ab、ESR、CRP 三種檢測方法在病原學陰性肺結核組陽性率差異均有統計學意義(χ2=8.970，P=0.003；χ2=15.655，P<0.001；χ2=28.267，P<0.001)，而T-SPOT.TB在病原學陰性肺結核組陽性率差異無統計學意義(χ2=1.917，P=0.166)。

表1 三組患者四種方法檢測陽性率比較

二、四種檢測方法對病原學陰性肺結核的檢測效能

以臨床診斷為標準，T-SPOT.TB對病原學陰性肺結核診斷的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值和準確度分別為82.4%、71.4%、57.8%、89.5%、75.0%，TB-Ab對病原學陰性肺結核診斷的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值和準確度分別為39.8%、81.1%、50.0%、74.1%、73.9%，ESR對病原學陰性肺結核診斷的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值和準確度分別為22.7%、92.5%、59.0%、71.6%、70.0%，hs-CRP對病原學陰性肺結核診斷的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值和準確度分別為13.0%、94.7%、53.9%、69.6%、68.4%。與其他三種方法比較，T-SPOT.TB對病原學陰性肺結核診斷的敏感度、陰性預測值和準確度較高，ESR和hs-CRP對病原學陰性肺結核診斷的特異度較高。四種方法聯合診斷的敏感度和陰性預測值最高(表2)。

表2 以臨床診斷為標準四種檢測方法對病原學陰性肺結核的檢測效能

三、T-SPOT.TB聯合其他3種方法對病原學陰性肺結核的檢測陽性率情況

含T-SPOT.TB的兩種檢測(TB-Ab+T-SPOT.TB、ESR+T-SPOT.TB、hs-CRP+T-SPOT.TB)對病原學陰性肺結核的陽性率分別為89.8%、84.7%、83.3%，與不含T-SPOT.TB的單一檢測(TB-Ab/ESR/hs-CRP)的陽性率相比較差異有統計學意義(P<0.05)；含T-SPOT.TB的三種檢測(TB-Ab+ESR+T-SPOT.TB/TB-Ab+CRP+T-SPOT.TB/ESR+hs-CRP+T-SPOT.TB)對病原學陰性肺結核陽性率分別為90.7%、90.7%、85.7%，與不含T-SPOT.TB的兩種檢測(TB-Ab+ESR+/TB-Ab+CRP/ESR+hs-CRP)的陽性率相比較差異有統計學意義(P<0.05)；含T-SPOT.TB的4種檢測(TB-Ab+ESR+hs-CRP+T-SPOT.TB)對病原學陰性肺結核的陽性檢出率為91.7%，與不含T-SPOT.TB的3種檢測(TB-Ab+ESR+hs-CRP)的陽性率相比較差異有統計學意義(P<0.05)。病原學陰性肺結核的陽性率隨聯合種類增加而遞增，聯合檢測陽性率較單一檢測增加， T-SPOT.TB聯合TB-Ab檢測尤為明顯。有T-SPOT.TB參與時其2種、3種、4種方法聯合檢測的陽性率均明顯高于無T-SPOT.TB組(P<0.05)(表3)。

四、聯合診斷對病原學陰性肺結核的診斷效能

4種檢測方法分別檢測及聯合檢測的ROC曲線見圖1，其中T-SPOT.TB的AUC為0.764，標準誤差為0.020(95%CI： 0.726～0.802)，大于其他3種方法的AUC(TB-Ab的AUC為0.600，標準誤差為0.024(95%CI： 0.553～0.647)；ESR的AUC為0.529，標準誤差為0.024(95%CI： 0.482～0.576)；hs-CRP的AUC為0.515，標準誤差為0.024(95%CI： 0.468～0.562)，可見T-SPOT.TB對病原學陰性肺結核的診斷相對于其他方法有較高準確性。4種方法聯合檢測的AUC為0.804，標準誤差為0.018(95%CI： 0.769～0.839)，可見聯合檢測對病原學陰性肺結核的診斷效能更好(圖1)。

圖1 四種方法聯合檢測病原學陰性肺結核ROC曲線

討 論

肺結核是對人類健康造成嚴重威脅的一種慢性呼吸道傳染性疾病，結核病在世界的年發病率逐漸增高[14]。結核分枝桿菌細菌學、分子生物學和病理學檢查陽性是肺結核的確診依據[11-12]。2022年WHO報告[1]估計，2021年全球肺結核患者中37%缺乏病原學診斷依據，比2020年的41%有所降低。我國2021年報告的結核病患者中缺乏病原學確診依據的占42%，比2020年的45%有所降低[2]。因此，完善病原學陰性肺結核的診斷對肺結核病情的控制有著積極的意義。目前，診斷病原學陰性肺結核除依據胸部影像學檢查和臨床表現外,實驗室的檢測指標對診斷可發揮良好作用，T-SPOT.TB和TB-Ab免疫檢測方法為輔助診斷病原學陰性肺結核的重要依據[6-7]。本研究探討以上免疫檢測以及ESR和hs-CRP檢測診斷病原學陰性肺結核的敏感度、特異度，以及幾種方法聯合檢測病原學陰性肺結核的診斷效能。

T-SPOT.TB是近些年發展起來的快速診斷結核病新技術，其ESAT-6和CFP-10為結核分枝桿菌特有的片段，因此能較好地排除卡介苗接種、非結核分枝桿菌感染[15]。有研究報道，T-SPOT.TB檢測肺結核具有更高的敏感度、特異度、準確度[16-17]。本研究中，病原學陰性肺結核組中T-SPOT.TB檢測方法的敏感度、陰性預測值和準確度較高，尤其是敏感度明顯高于其他三種檢測方法，T-SPOT.TB的陽性檢出率明顯高于其他肺部疾病組，與其他研究結論一致[18-19]； T-SPOT.TB在病原學陰性肺結核組與病原學陽性肺結核組中陽性檢出率差異無統計學意義。在病原學陰性肺結核組中，含T-SPOT.TB的四種方法(TB-Ab+ESR+hs-CRP+T-SPOT.TB)聯合檢測陽性檢出率高達91.7%，不含T-SPOT.TB的三種方法(TB-Ab+ESR+hs-CRP)聯合檢測陽性檢出率僅為50.00%，說明T-SPOT.TB檢測方法對病原學陰性肺結核的診斷尤為重要。

研究表明，TB-Ab檢測對結核病輔助診斷，尤其是病原學陰性患者的輔助診斷有很大價值[7,20]。當然血清TB-Ab檢測結果會受到交叉抗原、既往結核分枝桿菌感染史、產品質量、技術及評價體系等因素的影響，故多建議聯合其他診斷方式，盡量排除人為因素以達到減少假陽性的目的[21]。本文TB-Ab敏感度、特異度較國內、外一些研究偏低[22-24]，可能主要是因為在試劑中抗原的選擇及優化上有區別。敏感度、特異度與楊珊明和周建芳[25]研究相差不大。本研究顯示，TB-Ab對病原學陰性肺結核診斷的敏感度高于其他肺部疾病，但低于對病原學陽性肺結核診斷的敏感度，與一些研究一致[18，26]。

ESR指紅細胞在一定條件下降的速度，健康人ESR數值會在一個較窄的范圍內波動，如若發生惡性組織壞死、炎癥、組織損傷等會使ESR加快，因此，ESR在判斷肺結核的活動性與非活動性有一定幫助[8]。ESR對組織炎癥、損傷及壞死均有影響，對于結核病診斷特異度不高，因此，需要與其他診斷方法聯合加以鑒別來提高診斷效能。本研究顯示，病原學陰性肺結核組ESR陽性檢出率高于其他肺部疾病組，低于病原學陽性肺結核組，均低于馬龍鳳[27]的報道。

hs-CRP屬于y球蛋白，是一種炎癥標志物，屬于血清中常見的非抗體性蛋白質。近年來,有學者指出血清hs-CRP作為重要的血液生化指標,在結核病合并肺部細菌感染中的篩查、評估效果較好,在肺結核合并肺部細菌感染患者中敏感度(63.45%)較高，高于單純肺結核患者[9]。因此，此指標對于單純結核病診斷的特異度并不高，適合同時合并炎癥的患者的輔助診斷，需根據患者臨床特點與其他檢測指標聯合診斷。本研究結果顯示，病原學陰性肺結核組hs-CRP陽性檢出率低于病原學陽性肺結核組，高于其他肺部疾病組，均低于朱捷等[10]的報道。

病原學陰性肺結核由于缺乏細菌學檢查證據，僅依靠病史、癥狀、胸部影像學等綜合分析易出現漏診及誤診。隨著細胞免疫學和體液免疫學等更多檢測方法的建立和發展，多項方法聯合檢測對病原學陰性肺結核的早期診斷及鑒別診斷有很大的提高。每種檢測方法均有優勢與不足，可根據患者臨床指征選擇聯合檢測較單項檢測更能提高病原學陰性肺結核的檢出率，因此，對病原學陰性肺結核采取多種方法聯合檢測可提升陽性檢出率，提高診斷效能，在判別病原學陰性肺結核和排除結核有一定的臨床使用價值[18，28]。本研究顯示，T-SPOT.TB、TB-Ab、ESR、hs-CRP等四種檢測方法均對病原學陰性肺結核有一定診斷價值，尤其是T-SPOT.TB對病原學陰性肺結核的診斷效能優于其他三種方法，但比較與四種方法聯合檢測，其陽性檢出率低于后者。當然，T-SPOT.TB檢測也有一定局限性，不能區分活動性肺結核與結核分枝桿菌潛伏感染。有研究報道，肺癌患者T-SPOT.TB陽性率較高，可能因為腫瘤患者免疫力低下，易并發結核分枝桿菌潛伏感染等[29]。此外，我國為結核感染高發國家，這些原因均可能導致T-SPOT.TB特異度較低[6]。本研究中，4種方法聯合檢測診斷效能較高，尤其是診斷敏感度較高，但特異度比較低，可能與本文聯合檢測陽性定義(只要有一種方法檢測為陽性即定義為聯合檢測陽性)有關，因此，在提高了診斷的敏感度同時降低了其特異度；AUC為0.804，略低于筆者曾研究4種方法聯合檢測診斷活動性肺結核AUC，可能與本文僅分析對病原學陰性肺結核的診斷價值，且TB-Ab、ESR、hs-CRP等3種方法在病原學陰性肺結核組陽性檢出率低于病原學陽性肺結核組，因此，AUC略低于筆者之前的研究結果[6]。

綜上所述,T-SPOT.TB聯合TB-Ab、ESR、hs-CRP檢測在病原學陰性肺結核診斷中可起到互補作用，實現診斷效能的最大化，結合臨床指征對提高病原學陰性肺結核早診斷、早治療有很重要的臨床意義。每種檢測方法均有一定不足之處，因此，可根據患者臨床指征以及醫療機構實際情況選擇不同相關診斷方法聯合檢測。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻田麗麗：醞釀和設計實驗、實施研究、采集數據、分析/解釋數據、文章撰寫；陳雙雙：醞釀和設計實驗、采集數據、批判性審閱文章；樊瑞芳、張潔、王嫩寒、陳昊、代小偉、任怡宣、趙琰楓、李波、于蘭和易俊莉：采集數據、批判性審閱文章與支持性貢獻；李傳友和丁北川：分析/解釋數據、批判性審閱文章、指導和支持性貢獻；楊新宇：采集數據、分析/解釋數據、批判性審閱文章、統計分析、指導與支持貢獻；王佩和宋衛萍：行政、材料支持、指導和支持性貢獻