SLC22A12基因多態性與吡嗪酰胺誘導高尿酸血癥的易感性研究

彭江麗 陳潔 陳永剛 王璐 李娜 羅季 韓祎 喻明麗 朱江春

目前，結核病仍是全球重大公共衛生問題之一，結核病防控形勢依然十分嚴峻[1-2]。吡嗪酰胺(pyrazinamide，PZA)是非常有效的一線抗結核藥物，也是用于耐藥結核病治療的重要藥物，并被推薦與二線抗結核藥物全程聯合使用[3-4]。然而，高尿酸血癥是吡嗪酰胺除肝毒性外最常見的藥物不良反應，在其誘發關節炎或急性痛風后可導致抗結核治療不連續或停藥，影響治療效果[5-6]。有研究顯示，吡嗪酰胺的活性代謝物吡嗪酸可刺激人尿酸鹽轉運蛋白(human urate transporter，hURAT)的活性，大幅增加腎小管近曲小管對尿酸鹽的重吸收，破壞機體尿酸鹽的動態平衡，進而誘導高尿酸血癥[7-8]。hURAT是體內血尿酸水平調節的關鍵蛋白，是由溶質載體家族22成員12(solute carrier family 22 member 12，SLC22A12)基因編碼[9-10]。作為高尿酸血癥的重要候選基因，SLC22A12基因多態性所導致的hURATl產物的改變和(或)活性的改變，可能是不同個體之間高尿酸血癥易感性不同的重要原因。目前尚不明確SLC22A12基因單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)是否與肺結核患者服用吡嗪酰胺導致高尿酸血癥的發生風險密切相關。因此，筆者對二者相關性進行探討，為臨床治療提供參考。

對象和方法

一、研究對象

從2019年1月至2021年3月昆明市第三人民醫院結核科住院治療的12 000例肺結核患者中篩選出約6500例強化期含吡嗪酰胺抗結核方案的患者作為初步研究對象，參照排除標準中(1)～(5)條，篩選可入組的4800例研究對象并開始按要求服用吡嗪酰胺；服用吡嗪酰胺期間定期監測血清尿酸等生化指標，觀察血清尿酸變化情況(每2～3天復查1次)，期間符合排除標準中(6)～(8)任一條剔除；吡嗪酰胺服用4～5周時，根據誘導高尿酸血癥情況及高尿酸血癥判定標準，將研究對象分為尿酸升高組和尿酸正常組，判定入組時，分別采集兩組研究對象外周靜脈血5 ml，存于-80 ℃冰箱備用后續全血DNA提取；最終納入尿酸升高組294例，其中，男性155例(52.72%)、女性139例(47.28%)，平均年齡為(46.80±9.98)歲；納入尿酸正常組220例，其中，男性118例(53.64%)、女性102例(46.36%)，平均年齡為(45.91±10.76)歲；兩組患者在性別分布和年齡的差異均無統計學意義(χ2=0.042，P=0.837；t=0.065，P=0.573)。本研究通過昆明市第三人民醫院倫理委員會審批(批號：2019031992)，患者均經知情同意并簽署知情同意書。

納入標準：(1)研究對象來自中國云南地區的漢族人群，個體間無血緣關系，年齡范圍為18～75歲，且尿酸升高組和尿酸正常組在某個年齡段及性別的比例均盡可能按照1∶1進行匹配，一般控制在1∶4以內；(2)肺結核診斷參照《WS 288—2017肺結核診斷》；(3)強化期抗結核治療方案包含有吡嗪酰胺(口服，0.5 g/次，3次/d)，住院治療觀察周期為吡嗪酰胺治療4～5周；(4)服用吡嗪酰胺前血清尿酸及腎功能均正常。

排除標準：(1)服用吡嗪酰胺前已合并原發性高尿酸血癥及痛風者；(2)家族史具有高尿酸血癥及痛風者；(3)服用吡嗪酰胺前已存在不明原因尿酸增高者；(4)服用吡嗪酰胺前腎功能異常者；(5)同時合并血液系統疾病、腫瘤、腎臟疾病、肝臟疾病、銀屑病等可能導致繼發性高尿酸血癥者；(6)服用吡嗪酰胺期間同時使用乙胺丁醇、阿司匹林、噻嗪類利尿藥、免疫抑制劑(環孢素、他克莫司)等常見的導致血尿酸升高藥物者；(7)服用吡嗪酰胺過程中未限制動物內臟、海鮮、啤酒等高嘌呤飲食攝入者；(8)病歷資料不完整者。研究對象篩選流程見圖1。

圖1 研究對象篩選流程

二、研究方法

1.生化指標測定：為維持吡嗪酰胺連續使用確保抗結核療效，本研究結合臨床實際情況，在吡嗪酰胺使用前及使用后每2～3 d復查1次，監測周期為4～5周[11-12]。采用紅色分離膠生化管采集各監測時間點研究對象外周靜脈血4 ml，應用全自動生化分析儀測定研究對象血清尿酸、尿素氮和肌酐。檢驗員經過統一培訓，使用統一標準試劑、質控標本。本研究根據吡嗪酰胺服用第4～5周誘導高尿酸血癥的情況，以非同日2次血尿酸水平男性>416 μmol/L、女性>357 μmol/L判定為高尿酸血癥。

2.全血DNA提取：所有患者分組后，采用紫色EDTA抗凝管采集外周靜脈血5 ml，存于-80 ℃冰箱備用后續全血DNA提取。采用基因組DNA提取試劑盒(購自北京百泰克生物技術有限公司)提取全血DNA，使用 NanoDrop 2000儀器進行吸光度(A)值檢測，選取所測A值為1.6～2.2的樣本進行1.25%瓊脂糖凝膠電泳檢測。當質檢評估符合Massarray SNP分型DNA質量要求后，轉移至96孔板，-20 ℃儲存備用。

3.SLC22A12基因各位點分型檢測：采用MassARRAY Analyzer 4.0質譜儀(美國Agena Bioscience公司)進行SNP Sequenom MassARRAY分型檢測。首先通過PCR擴增包含SNP位點的DNA序列，再通過UEP單堿基延伸引物擴增上述PCR產物，該延伸引物只擴增與待檢測SNP位點互補的堿基即終止，最終延伸產物通過飛行時間質譜系統(time of flight，TOF)進行分析，根據不同堿基的分子量差異對SNP進行分型。本研究SLC22A12基因rs11602903、rs559946、rs475688、rs476037位點是以國際人類基因組計劃數據庫Hapmap最小等位基因頻率(MAF)>0.05，r2>0.8，并優選錯義、同義、啟動子、非 UTR 區等功能SNP為原則，從NCBI的SNP數據庫挑選出來，并同時查閱大量文獻進行最終選擇。多重SNP位點引物設計采用Assay Designer 4.0軟件進行設計評估，并根據不同的位點信息酌情調整設計參數，滿足最優化標準。采用PAGE引物純化方法，合成每個SNP位點對應的3條引物，分別為2條PCR引物和1條UEP單堿基延伸引物，引物序列見表1。以上基因分型檢測委托博淼生物(北京)科技有限公司完成。基因型頻率為基因型個體數/個體總數，而等位基因頻率是個體總數的2倍，1個等位基因的頻率為該等位基因純合子的頻率+1/2雜合子的頻率，即：等位基因頻率=(2倍該基因型純合子個體數+雜合子的頻率個體數)/2倍個體總數。

表1 SLC22A12基因多重SNP位點引物設計

三、統計學處理

結 果

一、兩組臨床資料比較

吡嗪酰胺使用前，兩組患者尿酸、血尿素氮、血肌酐均正常，且差異均無統計學意義(P值均>0.05)。吡嗪酰胺使用4周時，兩組患者血肌酐、血尿素氮均未發生明顯改變，差異均無統計學意義(P值均>0.05)，但尿酸升高組血尿酸明顯高于正常組，差異有統計學意義(P<0.05)。具體見表2。

表2 兩組患者服用吡嗪酰胺前后血清尿酸、血尿素氮和血肌酐水平比較

二、SLC22A12基因SNP分型檢測結果

SLC22A12基因rs11602903、rs559946、rs475688和rs476037位點SNP Sequenom MassARRAY分型檢測結果顯示，rs11602903位點基因分型為：AA純合野生、TA雜合突變型和TT純合突變型；rs559946和rs475688位點基因分型均為：CC純合野生型、TC雜合突變型和TT純合突變型；rs476037位點基因分型為：GG純合野生型、AG雜合突變型、AA純合突變型。

三、Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗

尿酸升高組與尿酸正常組的SLC22A12基因的4個位點(rs11602903、rs559946、rs475688和rs476037)基因型分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(P值均>0.05)，具體見表3。

表3 兩組患者SLC22A12基因各位點Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗情況

四、兩組基因型頻率及等位基因頻率比較(表4，5)

表4 兩組患者基因型及等位基因分布比較 [頻次(頻率，%)]

尿酸升高組rs11602903位點的AA基因型頻率和A等位基因頻率均高于尿酸正常組，而TA和TT基因型頻率均低于尿酸正常組，兩組間分布差異均有統計學意義。經校正性別和年齡因素后，logistic 回歸分析顯示，攜帶TA和TT基因型及T等位基因均是降低肺結核患者服用吡嗪酰胺導致高尿酸血癥風險的因素(OR值分別為0.425、0.328、0.511)。

尿酸升高組rs559946位點的CC和TT基因型和C等位基因頻率均高于尿酸正常組，而TC基因型頻率低于尿酸正常組，兩組間分布差異均有統計學意義。logistic回歸分析結果顯示：攜帶TC基因型及T等位基因均是降低肺結核患者服用吡嗪酰胺導致高尿酸血癥風險的因素(OR值分別為0.578和0.716)。

表5 肺結核患者SLC22A12基因多態性對吡嗪酰胺誘導高尿酸血癥影響的多因素logistic回歸分析

尿酸升高組rs475688位點的各基因型頻率及等位基因頻率分布與正常組相比，差異均有統計學意義。logistic回歸分析結果顯示，TC、TT基因型及攜帶T等位基因肺結核患者服用吡嗪酰胺導致高尿酸血癥的風險分別是參照組的2.028倍、6.077倍及2.229倍。

尿酸升高組rs476037位點各基因型及等位基因頻率分布與正常組相比，差異均無統計學意義。

討 論

吡嗪酰胺導致的高尿酸血癥國內報告臨床發生率高達70%以上[11]，一般在吡嗪酰胺使用1～2周逐漸出現，第4～5周達到高峰，大多數患者的血清尿酸水平都在正常高限的2倍左右，少數患者血清尿酸可能會進行性升高。以往普遍認為，高尿酸血癥是一個短暫的過程，且停藥后即可恢復，也不會對疾病的預后及患者自身產生影響，臨床也不需要更改方案，認為吡嗪酰胺的監測意義不大。然而，在臨床實際工作中，雖然停用吡嗪酰胺后，患者血清尿酸水平開始下降，但大多數患者的血清尿酸水平在短時間內并不能恢復到正常水平，一般需在停藥后的1～2個月后才能恢復正常，也有病例報告發現少數患者在停藥2年以后血清尿酸水平仍維持在0.1 g/L，在體內可形成多個痛風石[11-13]，對心、腎、血管等組織器官具有直接致病作用[13]。這些均提示高尿酸血癥仍然會引起患者嚴重不良結局，其臨床危害不容忽視。而且臨床為了確保抗結核治療效果，一般不會隨意停用吡嗪酰胺，當血清尿酸超過正常參考值高限后若進行性升高，會及時給予碳酸氫鈉、別嘌醇等降尿酸對癥治療，并對患者尿酸變化情況嚴密監測，以保證患者用藥安全。因此，隨著吡嗪酰胺在耐藥結核病的廣泛及長療程使用，高尿酸血癥對抗結核方案的制定及執行的影響愈發明顯，尤其是對于合并糖尿病、腎病、高齡等進行抗結核治療的特殊人群，更應該引起關注。

hURAT是近年研究發現位于腎小管上皮細胞最重要的尿酸重吸收轉運體，與其他轉運體相比，hURAT對尿酸鹽具有較強的底物特異性。hURAT 位于染色體11q13上，含有9個內含子和10個外顯子，cDNA全長2642 bp，是一個完整的跨膜蛋白[14-15]。本研究所選SLC22A12基因rs11602903和rs559946為功能區域SNP位點，側重功能調控；rs475688和rs476037為標簽SNP位點，是基于CHB數據庫進行的強關聯代表SNP位點。目前，SLC22A12基因以上位點多態性與高尿酸血癥、痛風的相關性報道較多[16-20]，但與肺結核患者服用吡嗪酰胺導致高尿酸血癥的相關性還未見相關報道。

本研究結果發現，尿酸升高組SLC22A12基因rs11602903、rs559946和rs475688位點各基因型頻率及等位基因頻率分布均與尿酸正常組差異有統計學意義。經校正性別、年齡因素后的logistic回歸分析發現，攜帶rs11602903位點的TA、TT基因型及T等位基因與攜帶rs559946位點的TC基因型及T等位基因均可能是肺結核患者服用吡嗪酰胺導致高尿酸血癥的保護因素，而攜帶rs475688位點的TC、TT基因型及T等位基因均可能會明顯增加肺結核患者服用吡嗪酰胺后導致高尿酸血癥的發生風險。Cho等[16]研究發現，與尿酸正常組相比，尿酸升高組rs11602903位點的AA型純合子或AT型雜合子受試者患高尿酸血癥的風險降低，但發生高尿酸血癥的易感基因型與本文結果不一致，可能與該研究樣本量有限，以及不同地域、不同種族人群基因多態性分布差異有關。Li等[17]對rs559946多態性與中國漢族男性人群原發性高尿酸血癥相關性的研究發現，rs559946多態性與高尿酸血癥易感性明顯相關，而攜帶T等位基因能降低患高尿酸血癥的風險，這與本文發現一致，提示攜帶rs559946位點T等位基因可能降低肺結核患者服用吡嗪酰胺誘導高尿酸血癥的風險。張小珍[18]發現rs559946 T→C位點的基因型頻率和等位基因頻率在痛風組和對照組間的差異無統計學意義，提示rs559946 T→C位點與痛風易感無關，這與本文研究結果不一致，可能原因有待進一步探索。國外一項關于SLC22A12基因與痛風易感性之間的Meta分析結果顯示，rs475688多態性與痛風易感性存在明顯相關[19]；Tu等[20]在一項病例對照研究中發現，SLC22A12基因rs475688與無癥狀性高尿酸血癥和痛風發生有關，攜帶C等位基因可能增加無癥狀性高尿酸血癥和痛風的發生風險，這也與本文不一致，認為研究的樣本量、基因分型方法，以及不同地域和種族等可能與之有關。本研究還發現rs476037位點的各基因型頻率及等位基因頻率分布在兩組間差異均無統計學意義，提示rs476037位點多態性與肺結核患者服用吡嗪酰胺誘導高尿酸血癥的發生風險可能無關，而rs476037位點與高尿酸血癥的相關性既往并未見相關報道。

精準化治療是結核病化療的發展方向，本研究首次通過病例對照研究從基因多態性的角度解釋吡嗪酰胺誘導高尿酸血癥存在個體差異的原因，該結果的發現可為臨床根據不同基因型提前預測吡嗪酰胺誘導高尿酸血癥的發病風險、提前制定有效的防治策略、最大限度地減少或避免高尿酸血癥的發生提供科學依據

綜上所述，SLC22A12基因rs11602903、rs559946、rs475688位點多態性可能與肺結核患者服用吡嗪酰胺導致高尿酸血癥的發生風險相關。但本研究樣本量有限，所選研究對象僅局限在本院住院治療的肺結核患者，且僅涉及SLC22A12基因4個多態性位點，必要時可納入更多功能性位點，并在不同地區和不同民族間開展大樣本人群研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻彭江麗和陳潔：實施研究、數據整理及統計分析、撰寫及修改文章；陳永剛、王璐、李娜、羅季和韓祎：收集臨床資料、整理部分數據、查閱文獻；喻明麗和朱江春：篩選研究對象、收集及送檢血液標本、整理部分數據、查閱文獻、文章修改