四種技術(shù)平臺(tái)檢測(cè)甲狀腺癌NTRK融合變異的比較

陳靈鋒,林 潔,俞訓(xùn)彬,吳義娟,游治杰,陳小巖

神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體酪氨酸激酶(neurotrophic receptor tyrosine kinase, NTRK)基因家族包括NTRK1、NTRK2和NTRK3,NTRK融合變異是許多罕見腫瘤的驅(qū)動(dòng)因素,例如嬰兒纖維肉瘤、先天性中胚層腎瘤以及乳腺和唾液腺分泌性癌等[1]。拉羅替尼和恩曲替尼已相繼在中國(guó)獲批用于治療NTRK融合陽性的包括甲狀腺癌在內(nèi)的實(shí)體瘤。有別于單核苷酸變異或小片段插入缺失等突變類型的檢測(cè),融合基因檢測(cè)更為復(fù)雜,可針對(duì)融合基因的DNA、RNA和蛋白等不同水平進(jìn)行檢測(cè)。常見的NTRK融合變異檢測(cè)方法包括:FISH、免疫組化、二代測(cè)序(next generation sequencing, NGS)和實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(real-time fluorescent quantitative PCR, qRT-PCR)。本研究對(duì)40例同一組臨床樣本同時(shí)行FISH、免疫組化、DNA-based NGS和qRT-PCR法檢測(cè)NTRK融合變異,比較四種方法的一致性,分析各方法的敏感性、特異性和優(yōu)、缺點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 樣本選擇檢索2018～2022年福建省立醫(yī)院病理科數(shù)據(jù)庫(kù),對(duì)行免疫組化檢測(cè)pan-TRK蛋白的病例進(jìn)行回顧性審查,將20例免疫組化NTRK陽性標(biāo)本(包括11例甲狀腺癌,2例脂肪纖維瘤病樣神經(jīng)腫瘤,2例涎腺分泌性癌,1例去分化脂肪肉瘤,1例隆突性皮膚纖維肉瘤,3例右鼻腔腦膜源性腫瘤)作為臨床研究樣本,同時(shí)行FISH、DNA-based NGS和qRT-PCR法檢測(cè)NTRK融合;并選擇20例免疫組化NTRK陰性且qRT-PCR檢測(cè)BRAF V600E突變陽性的甲狀腺癌標(biāo)本作為NTRK融合陰性對(duì)照樣本(研究表明NTRK融合與BRAF等驅(qū)動(dòng)基因熱點(diǎn)突變互斥[2]),所有樣本均為福爾馬林固定石蠟包埋組織。

1.2 儀器與試劑主要實(shí)驗(yàn)儀器為Illumina NextSeq 500,安捷倫科技公司的熒光定量PCR儀(Mx3000P),全自動(dòng)免疫組化染色儀(VENTANA)。人類腫瘤多基因突變聯(lián)合檢測(cè)試劑(可逆末端終止測(cè)序法)、人類NTRK基因融合檢測(cè)試劑(熒光PCR法)試劑均由廈門艾德公司提供;NTRK1/2/3 Dual Color Break Apart Probe探針由廣州安必平公司提供;VENTANA pan-TRK(EPR17341)Assay由上海羅氏公司提供。

1.3 免疫組化pan-TRK(EPR17341)抗體在全自動(dòng)免疫組化染色儀(VENTANA)上染色,根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行判讀:以闌尾組織作為外對(duì)照,神經(jīng)和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞弱至強(qiáng)染色;黏膜、平滑肌和淋巴樣聚集體無染色;血管壁作為內(nèi)對(duì)照;組織中任何染色超過背景染色強(qiáng)度,且陽性細(xì)胞≥1%即判為陽性,不同類型的細(xì)胞染色模式都判讀為陽性(細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜、細(xì)胞核、外周核)。彌漫強(qiáng)陽性的標(biāo)準(zhǔn)為:≥75%的腫瘤細(xì)胞強(qiáng)陽性,呈黃色或褐色顆粒狀,信號(hào)定位準(zhǔn)確。

1.4 FISH每個(gè)樣本均執(zhí)行3次NTRK1/2/3檢測(cè),根據(jù)試劑盒說明操作,陽性閾值設(shè)為15%的細(xì)胞呈異常信號(hào)[3]。

1.5 DNA-based NGS根據(jù)試劑盒說明書操作,探針覆蓋的NTRK檢測(cè)區(qū)域:NTRK1(外顯子8/9/10/13,內(nèi)含子8/9)、NTRK2(外顯子12/13/15/16,內(nèi)含子12/15)、NTRK3(外顯子3/5/7/9/11/13/15/17/18)以及ETV6基因(外顯子4/5/6,內(nèi)含子4/5)。

1.6 qRT-PCR40例樣本提取的RNA內(nèi)控HEX信號(hào)Ct值均<20,RNA質(zhì)量均符合質(zhì)控要求,根據(jù)試劑盒說明書操作,試劑盒涵蓋了109種融合類型:NTRK1的63種融合類型(LMNA:exon10-NTRK1:exon11、TPM3:exon7-NTRK1:exon10等),NTRK2的24種融合類型(VCL:exon16-NTRK2:exon12、ETV6:exon5-NTRK2:exon15等),NTRK3的22種融合類型(ETV6:exon5-NTRK3:exon15、EML4:exon2-NTRK3:exon14等)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。運(yùn)用Kappa檢驗(yàn)進(jìn)行兩種檢測(cè)方法結(jié)果的一致性分析,Kappa≥0.75為一致性較好,0.4

2 結(jié)果

2.1 FISH檢測(cè)FISH檢測(cè)顯示,40例樣本中13例陽性,其中甲狀腺癌9例,涎腺分泌性癌2例,脂肪纖維瘤病樣神經(jīng)腫瘤2例。陽性樣本的信號(hào)如下:紅綠分離(NTRK1,n=1;NTRK3,n=10)和單一綠色(NTRK1,n=2,均為脂肪纖維瘤病樣神經(jīng)腫瘤)(圖1)。

圖1 FISH檢測(cè)NTRK融合陽性:A. NTRK3重排陽性(紅綠分離信號(hào)模式);B. NTRK1重排陽性(單一綠色信號(hào)模式) 圖2 免疫組化檢測(cè)NTRK融合陽性,VENTANA染色:A. 細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中pan-TRK呈彌漫強(qiáng)陽性;B. 細(xì)胞核中pan-TRK呈彌漫強(qiáng)陽性;C. 細(xì)胞膜中pan-TRK呈彌漫強(qiáng)陽性;D. 細(xì)胞質(zhì)中pan-TRK呈彌漫中等陽性

2.2 免疫組化、DNA-based NGS和qRT-PCR檢測(cè)與FISH檢測(cè)比較在20例免疫組化NTRK陰性的甲狀腺癌標(biāo)本中,DNA-based NGS、qRT-PCR與FISH檢測(cè)均為陰性;在20例免疫組化陽性樣本中,12例為細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)彌漫強(qiáng)陽性(甲狀腺癌9例,脂肪纖維瘤病樣神經(jīng)腫瘤2例,去分化脂肪肉瘤1例)(圖2),2例細(xì)胞核彌漫強(qiáng)陽性(均為涎腺分泌性癌),1例細(xì)胞膜彌漫強(qiáng)陽性(甲狀腺癌),1例細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)彌漫中等陽性(隆突性皮膚纖維肉瘤),4例細(xì)胞質(zhì)彌漫中等陽性(甲狀腺癌1例,右鼻腔腦膜源性腫瘤3例)(表1)。與FISH檢測(cè)相比,免疫組化的敏感性、特異性、陽性預(yù)測(cè)值(positive predictive value, PPV)、陰性預(yù)測(cè)值(negative predictive value, NPV)、總符合率(total coincidence rate, TCR)和Kappa值詳見表2,免疫組化的PPV較差(65.0%),與FISH檢測(cè)結(jié)果的一致性一般(Kappa<0.75);但免疫組化彌漫強(qiáng)陽性的PPV為86.7%(13/15),提示免疫組化檢測(cè)的PPV隨著染色強(qiáng)度增加而增加。其中,在免疫組化與FISH均檢測(cè)的31例甲狀腺癌樣本中,免疫組化的PPV也較差(81.8%,9/11)。

表1 四種方法檢測(cè)NTRK融合結(jié)果

表2 四種方法檢測(cè)NTRK融合的結(jié)果比較

40例樣本中,DNA-based NGS檢測(cè)NTRK融合陽性8例(圖3),DNA-based NGS與FISH檢測(cè)結(jié)果的一致性一般(Kappa<0.75,表2),其敏感性較差(61.5%,8/13)。其中,在DNA-based NGS與FISH均檢測(cè)的31例甲狀腺癌樣本中,敏感性也較差(44.4%,4/9)。

圖3 qRT-PCR和DNA-based NGS檢測(cè)NTRK融合陽性:A. NTRK3基因融合陽性(箭頭),qRT-PCR法;B. LMNA-NTRK1融合陽性(箭頭所指融合斷點(diǎn)信號(hào)),DNA-based NGS法;C. ETV6-NTRK3融合陽性(箭頭所指融合斷點(diǎn)信號(hào)),DNA-based NGS法

qRT-PCR法檢測(cè)NTRK融合12例陽性,與FISH檢測(cè)結(jié)果的一致性較好(Kappa=0.942),僅1例樣本(脂肪纖維瘤病樣神經(jīng)腫瘤)檢測(cè)結(jié)果不一致。其中,在qRT-PCR與FISH技術(shù)均得到檢測(cè)結(jié)果的31例甲狀腺癌樣本中一致性為100%(31/31)。

3 討論

FISH技術(shù)是一種基于DNA的檢測(cè)方法,具有良好的敏感性和特異性,常被用作評(píng)估是否存在基因重排的標(biāo)準(zhǔn)方法[4-5],因此本研究選擇FISH法作為參照方法。FISH檢測(cè)的陽性信號(hào)有紅綠分離或單一綠色的模式,其中單一綠色的信號(hào)模式大部分是NTRK發(fā)生非經(jīng)典的融合類型[6]。NTRK重排可通過平衡、不平衡易位或大片段缺失等形式和任何伙伴基因發(fā)生有效或無效的融合,FISH檢測(cè)無法排除這種無效的融合,此外復(fù)雜的重排模式以及結(jié)果判讀均可影響FISH結(jié)果的解釋[7]。

甲狀腺癌NTRK融合的發(fā)生率為1%～6%[8-9]。有研究顯示,采用免疫組化結(jié)合BRAF V600E突變檢測(cè)可以作為甲狀腺癌NTRK融合陽性的初篩方法[10]。姜陽陽等[11]采用免疫組化和DNA-based NGS檢測(cè)NTRK,也發(fā)現(xiàn)免疫組化可作為甲狀腺乳頭狀癌NTRK融合變異的篩選方法,并且可通過提高免疫組化染色陽性閾值或結(jié)合BRAF V600E突變檢測(cè)進(jìn)一步增強(qiáng)其準(zhǔn)確性。最新研究顯示,免疫組化的敏感性和特異性有限,假陰性結(jié)果會(huì)使患者錯(cuò)失靶向治療的機(jī)會(huì),應(yīng)考慮對(duì)甲狀腺癌采取其他檢測(cè)[12]。

DNA-based NGS的敏感性中等,特異性高,可檢測(cè)具體融合伴侶基因;RNA-based NGS的敏感性高,特異性高[15]。有研究認(rèn)為DNA-based NGS在檢測(cè)NTRK融合方面是合適的,其總體敏感性為81.1%,但當(dāng)融合涉及分析未涵蓋的斷點(diǎn)時(shí),會(huì)出現(xiàn)假陰性[1]。也有研究認(rèn)為DNA-based NGS漏檢率很高,如Fu等[6]針對(duì)18例樣本同時(shí)行DNA-based和RNA-based NGS檢測(cè),DNA水平的漏檢率高達(dá)76.9%(10/13)。本組32例DNA-based NGS陰性樣本中,有5例經(jīng)FISH和qRT-PCR重新檢測(cè)證實(shí)為陽性,推測(cè)NTRK基因斷裂點(diǎn)可能在試劑盒探針覆蓋的區(qū)域之外。并不是所有的DNA-based NGS平臺(tái)都能識(shí)別出所有NTRK基因融合變異,需在融合斷點(diǎn)高發(fā)的基因內(nèi)含子區(qū)域設(shè)計(jì)探針,而內(nèi)含子重復(fù)序列多,且融合點(diǎn)多變,但NGS為檢測(cè)NTRK融合提供了一種精確的方法,能夠檢測(cè)出具體的融合伴侶基因,這是FISH和qRT-PCR技術(shù)無法實(shí)現(xiàn)的。NGS對(duì)人員的要求較高,普通實(shí)驗(yàn)室常難以滿足,且穿刺活檢等小標(biāo)本檢測(cè)失敗率較高,限制了其應(yīng)用[16]。

qRT-PCR技術(shù)是基于樣本RNA進(jìn)行檢測(cè),對(duì)標(biāo)本的要求較高,福爾馬林固定石蠟包埋樣本提取的RNA質(zhì)量好壞(主要受組織前處理影響)直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果,本組40例樣本RNA質(zhì)量均符合質(zhì)控要求。與基于DNA水平的技術(shù)相比,基于RNA水平的技術(shù)更易檢出融合基因[1],且只有在RNA水平的融合檢出才是該融合能夠在功能上被轉(zhuǎn)錄和翻譯的直接證據(jù)[6]。與FISH技術(shù)相比,qRT-PCR操作更加簡(jiǎn)便、結(jié)果判讀更直觀,既縮短了檢測(cè)周期,又減少了主觀因素對(duì)結(jié)果的影響。融合基因在RNA水平已剪切去除內(nèi)含子,因此與DNA-based NGS技術(shù)相比,qRT-PCR簡(jiǎn)化了探針設(shè)計(jì)需充分覆蓋的技術(shù)要求,避免了由于內(nèi)含子序列長(zhǎng)、斷點(diǎn)不固定、重復(fù)序列等導(dǎo)致的探針難以捕獲的問題。本組排除1例因qRT-PCR檢測(cè)范圍未覆蓋的NTRK少見融合類型(LMNA:exon4-NTRK1:exon10)而未檢出的樣本,qRT-PCR和FISH技術(shù)的一致性可達(dá)100%(39/39),進(jìn)一步說明基于RNA檢測(cè)融合的qRT-PCR技術(shù)具有高敏感性、高特異性的優(yōu)勢(shì)。然而,qRT-PCR方法也存在不足之處,qRT-PCR檢測(cè)是一種定制化設(shè)計(jì),可檢測(cè)已知的融合位點(diǎn),對(duì)于引物和探針未覆蓋的融合位點(diǎn)和新的融合位點(diǎn)無法檢出,該缺陷可以通過更全面的RNA-based NGS或全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序來彌補(bǔ),但這兩種方法檢測(cè)如前述討論,可及性較差等特點(diǎn)限制了臨床的廣泛開展。《中國(guó)實(shí)體瘤NTRK融合基因臨床診療專家共識(shí)》也推薦qRT-PCR檢測(cè)可以作為NTRK融合基因發(fā)生率高的腫瘤和已知伴侶基因情況下的確診手段,而甲狀腺癌中主要的融合類型為ETV6-NTRK3和TPM3-NTRK1。綜上所述,基于RNA的普通qRT-PCR技術(shù)可能是適用于病理科常規(guī)臨床檢測(cè)甲狀腺癌NTRK融合變異的優(yōu)選方案。

本研究也存在一定的局限性:(1)本研究受條件限制,并未對(duì)7例免疫組化陽性而其他3種方法均陰性的標(biāo)本采用RNA-based NGS進(jìn)行確認(rèn);(2)由于是單中心研究,樣本量相對(duì)有限,陽性病例主要集中在NTRK1/3融合,對(duì)于NTRK2融合檢測(cè)有待進(jìn)一步補(bǔ)充;(3)NTRK融合在不同瘤種間差異較大,本研究同一樣本4種方法同時(shí)檢測(cè)的主要是甲狀腺癌,其他瘤種的比較還有待進(jìn)一步研究。