甲狀腺細針穿刺液基薄層細胞學檢查聯合p21、Cyclin D1檢測在甲狀腺乳頭狀癌術前診斷中的意義

王晨晨,張 俊,沈銘紅,曹 丹,陳汝蕾,張智弘,呂京澴

甲狀腺癌的發病率逐年增加,其中以甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)最為常見,發病年齡趨向年輕化[1]。目前超聲引導下細針穿刺活檢(ultrasound-guided fine needle aspiration biopsy, US-FNAB)聯合液基薄層細胞學(thinprep cytologic test, TCT)技術常用于術前評估[2-3]。雖然Bethesda分類報告系統對甲狀腺細胞病理學診斷進行了規范,但仍有10.00%～40.00%的結節無法明確診斷[4],其中25.00%～57.14%的甲狀腺結節術后病理診斷為PTC[5-6]。因此,術前穿刺診斷的敏感性亟需提高。BRAF V600E是PTC中最常見的突變基因,在西方國家(美國和歐洲)突變率為35.00%～60.00%[7-8],亞洲國家的突變率相對較高,其中中國為71.20%[9]。Fanis等[10]行大樣本量Meta分析顯示BRAF V600E獨立診斷PTC的敏感性并不高(69.00%),US-FNAB和BRAF V600E聯合診斷的敏感性更低(52.00%),故將BRAF V600E作為單一診斷指標的可行性尚未確定,且對檢測手段有實驗室平臺要求,并需要項目質量控制以確保檢測結果的準確性,降低假陰性率和假陽性率。

Cyclin D1屬于周期素(Cyclin)家族,p21屬于細胞周期蛋白依賴性激酶的抑制因子(cyclin-dependent kinase inhibitors, CDKI)家族,共同調控細胞周期從G1期進入S期進程。文獻報道Cyclin D1表達與PTC分化程度、侵襲性生物學行為有關[11],有望作為PTC的診斷標志物[12]。p21在PTC中的表達尚未見相關報道,亦無兩者的聯合性研究。本研究旨在探討p21、Cyclin D1在甲狀腺細針穿刺細胞標本中的表達及其臨床病理學意義。

1 材料與方法

1.1 材料收集2021年5月～2022年11月南京醫科大學附屬蘇州醫院行甲狀腺US-FNAB患者118例,其中男性26例,女性92例,患者年齡23～78歲,平均(43.2±12.37)歲,TI-RADS 4類69例,5類49例;結節最大徑0.30～4.00 cm,平均最大徑(1.19±0.68) cm。

1.2 方法

1.2.1US-FNAB 采用SIEMENS OXANA3彩色超聲診斷儀,選擇9L4高頻線陣探頭,頻率為4～9 MHz。經高分辨率超聲檢查評估和定位結節后,設計穿刺路徑行US-FNAB,將穿刺物注入液基細胞保存液。

1.2.2TCT制片及結果判讀 運用PrepStain全自動液基細胞制片機制備細胞病理學切片,行巴氏染色。采用Bethesda分類標準判讀:Ⅰ類,標本無法診斷或不滿意;Ⅱ類,良性病變;Ⅲ類,意義不明確的細胞非典型性病變或意義不明確的濾泡性病變;Ⅳ類,濾泡性腫瘤或可疑濾泡性腫瘤;Ⅴ類,可疑惡性腫瘤;Ⅵ類,惡性腫瘤。所有病例均由病理科高年資細胞學診斷醫師審核閱片。

1.2.3免疫細胞化學及結果判讀 使用TCT方法制片,采用羅氏全自動免疫組化儀進行免疫組化染色(EnVision法)。p21(貨號GT204307)、Cyclin D1(貨號GT205807)一抗購自上海基因科技公司,黃褐色為陽性,定位于細胞核。陽性判讀標準:細胞核彌漫強著色或部分強著色;陰性判讀標準:細胞核弱著色、無著色及非細胞核著色。所有病例均由病理科高年資細胞學診斷醫師審核閱片。

1.2.4BRAF V600E基因檢測 采用QIAamp DNA Micro Kit提取試劑盒提取穿刺針洗脫液中的DNA,運用人BRAF V600E基因突變檢測試劑盒(廈門艾德生物公司,貨號8.0120301X024B)進行熒光PCR。根據CT值判定結果,CT值≥30判定為陰性,CT值<30判定為陽性。

2 結果

2.1 臨床特征本組118例甲狀腺結節術后病理診斷:PTC 66例,良性結節52例,兩者在TI-RADS分類、Bethesda分類及BRAF V600E基因檢測結果差異均有統計學意義(P<0.05,表1)。

表1 TI-RADS分類、Bethesda分類和BRAF V600E基因檢測結果[n(%)]

2.2 良性結節和PTC中p21、Cyclin D1蛋白的表達差異免疫細胞化學結果顯示:PTC組中p21和Cyclin D1呈陽性,良性結節組中呈陰性(圖1)。p21、Cyclin D1在PTC中表達上調,陽性率分別為86.36%(57/66)、93.94%(62/66),在良性結節中陽性率分別為1.96%(1/52)、5.77%(3/52)。PTC組p21、Cyclin D1的陽性率高于良性結節組,差異均有統計學意義(P<0.05,圖2)。PTC組p21+/Cyclin D1+57例,p21+/Cyclin D1-0例,p21-/Cyclin D1+5例,p21-/Cyclin D1-4例,p21與Cyclin D1表達呈正相關(rs=0.639,P<0.05)。

圖1 A.甲狀腺乳頭狀癌液基細胞學巴氏染色,濾泡細胞呈團片狀單層排列,輪廓不規則,核染色質毛玻璃樣,可見核內包涵體和微小核仁;B、C.甲狀腺乳頭狀癌組p21(B)和Cyclin D1(C)免疫細胞化學染色呈陽性,EnVision法;D.甲狀腺乳頭狀癌組織學HE形態;E.甲狀腺良性結節巴氏染色,濾泡細胞平鋪排列,輕微核重疊和擁擠,染色質勻細,可見細小核仁;F、G.甲狀腺良性結節組p21(F)和Cyclin D1(G)免疫細胞化學染色呈陰性,EnVision法;H.甲狀腺濾泡性腺瘤組織學HE形態

圖2 甲狀腺乳頭狀癌和良性結節中p21(A)和Cyclin D1(B)的表達差異

2.3 p21、Cyclin D1蛋白表達與PTC臨床病理特征的關系本組66例PTC中,p21、Cyclin D1表達與腫瘤大小相關,兩者在腫瘤最大徑≥1 cm者中表達較高(P<0.05);而與患者性別、年齡、瘤灶數量、淋巴結轉移、TNM分期無關(P>0.05,表2)。

2.4 BRAF V600E野生型PTC中p21及Cyclin D1的表達本組66例PTC中,有9例US-FNAB檢測BRAF V600E為野生型,其臨床病理特征見表3,經組織切片復核顯示8例BRAF V600E為野生型(圖3),1例為突變型。其中8例p21、Cyclin D1呈陽性(圖4),例9呈陰性,陽性率均為88.89%(8/9)。

圖3 BRAF V600E野生型甲狀腺乳頭狀癌FISH檢測結果:PC.陽性參照,NC.陰性參照

圖4 A.BRAF V600E野生型甲狀腺乳頭狀癌液基細胞學巴氏染色;B、C. BRAF V600E野生型甲狀腺乳頭狀癌p21(B)和Cyclin D1(C)免疫細胞化學染色呈陽性,EnVision法;D. BRAF V600E野生型甲狀腺乳頭狀癌組織HE形態

表3 US-FNAB 9例BRAF V600E野生型甲狀腺乳頭狀癌臨床病理特征

2.5 US-FNAB、p21、Cyclin D1聯合檢測的診斷價值US-FNAB、p21和Cyclin D1聯合診斷的敏感性、特異性、陽性預測值和陰性預測值均高于US-FNAB獨立診斷,聯合診斷的敏感性和陰性預測值高于BRAF V600E(表4)。US-FNAB、p21和Cyclin D1聯合診斷的AUC大于US-FNAB獨立診斷,差異有統計學意義(Z=2.304,P=0.021),并大于BRAF V600E獨立檢測(Z=0.702 1,P=0.482 6)及US-FNAB和p21(Z=0.417,P=0.677)或Cyclin D1(Z=0.458,P=0.647)聯合檢測,與US-FNAB聯合BRAF V600E(Z=0.068 4,P=0.945)檢測接近(圖5)。

圖5 US-FNAB、p21、Cyclin D1和BRAF V600E獨立診斷及聯合檢測的ROC曲線

表4 US-FNAB、p21、Cyclin D1及聯合檢測的診斷效能比較

3 討論

近年甲狀腺癌的發病率急劇上升,其中PTC最為常見且瘤體微小時便已發生轉移[1],因此早篩查、早治療極為重要。甲狀腺疾病的無創檢查首選彩色多譜勒超聲,US-FNAB可在術前判斷甲狀腺結節的性質,是診療決策的關鍵[2]。TCT具有細胞富集度高、背景清晰等優點。巴氏染色使細胞核細節分辨度提高,制片質量優于傳統涂片[3]。本組對118例甲狀腺結節進行超聲檢查,采用ACR-TIRADS報告系統評估風險性,運用US-FNAB聯合TCT巴氏染色技術進行診斷。其中32.14%(36/112)的結節無法明確診斷,與以往文獻報道(10%～40%)相符[4]。無法明確診斷的36例結節經術后病理診斷為PTC者占44.44%(16/36),亦與文獻報道(25.00%～57.14%)一致[5-6]。如何提高診斷精度是亟需解決的重要問題。BRAF V600E基因是PTC最常見的基因突變,但臨床研究數據顯示其在實際應用中的敏感性偏低[10],且需借助分子病理學技術,對診斷平臺要求較高,基層醫院尚未開展;而采用免疫組化技術標記特定蛋白相對普及,且價格較低。

傳統的PTC免疫標志物CK19、Galectin-3、HBME-1等均存在診斷局限性。CK19診斷PTC的特異性僅為32.86%[13],且因細胞學標本中缺乏正常組織參照,判讀難度較組織學更大,診斷可靠性更低。Galectin-3在PTC中的陽性率為45.70%～80.00%[14-15],HBME-1為84.00%,且兩者在甲狀腺良性結節和乳頭狀增生病變中也有較高的陽性率,特異性較低[15]。

p21屬于細胞周期蛋白依賴性激酶的抑制因子(CDKI)家族,其異常表達會對Cyclin、CDK及其激酶活性產生影響,致使細胞增殖與分化異常,最終導致腫瘤的發生[16]。研究表明p21在多種腫瘤的發生發展中起雙重作用[17],在多種生存率較差的腫瘤(神經膠質瘤、前列腺癌、子宮頸癌等)中p21表達升高;而在其他腫瘤(乳腺、胃癌等)中,p21表達缺失與預后不良和總生存率降低有關[18]。p21潛在促進腫瘤發生和進展的功能包括但不限于腫瘤細胞從p21誘導的生長停滯中"逃脫"后,進行核內再復制和異常有絲分裂,再通過多種不同的機制抑制細胞凋亡,并刺激具有促有絲分裂和抗凋亡活性的分泌因子的轉錄。目前,p21在PTC中的表達及意義尚未見相關研究,而PTC瘤體微小便可發生轉移,p21是否參與其中的腫瘤"逃逸"機制,有待進一步研究。Cyclin D1在多種腫瘤中過表達[19],2015年Lamba Saini等[12]首次提出將Cyclin D1作為PTC的候選標志物。本研究顯示這兩個指標在PTC中的表達顯著高于良性結節,且其在PTC中的陽性率也明顯高于CK19、Galectin-3和HBME-1等常用指標。同時,由于p21和Cyclin D1均為核蛋白,免疫組化判讀也更為便捷、可靠。

本研究中,BRAF V600E基因檢測獨立診斷和與US-FNAB聯合診斷PTC的敏感性高于以往文獻報道[10],但仍有9例PTC的BRAF V600E為野生型,經組織切片復核BRAF V600E檢測示8例為野生型,1例為突變型。這9例中p21和Cyclin D1的陽性率均為88.89%(8/9),極大地提高了BRAF V600E野生型PTC的檢出率,有很好的臨床診斷應用價值。由于US-FNAB的BRAF V600E檢出率與腫瘤大小和穿刺手法有關,可能會出現假陰性情況,此時輔助應用p21、Cyclin D1檢測,可彌補此不足。這提示p21和Cyclin D1有可能參與BRAF V600E野生型PTC的發生,其機制值得進一步探索。

進一步的聯合診斷效能分析顯示,US-FNAB、p21及Cyclin D1三者聯合診斷的敏感性、陰性預測值高于US-FNAB、BRAF V600E、p21及Cyclin D1獨立診斷,同時將特異性和陽性預測值控制在較高水平(>90.00%)。三者聯合檢測的四項診斷評價指標均優于Abu-Sinna等[15]研究的Galectin-3/HBME-1共表達。三者聯合診斷的AUC高于US-FNAB和BRAF V600E獨立診斷,與US-FNAB和BRAF V600E聯合檢測接近,但高于以往文獻報道的US-FNAB和BRAF V600E聯合檢測(AUC=0.900)[19]。

綜上,US-FNAB、p21、Cyclin D1三者聯合檢測進一步提高了PTC術前診斷的敏感性,有較高的實用性,尤其適用于無分子病理學平臺的機構,且對于診斷BRAF V600E野生型PTC有較高的應用價值。