以粗糧為基質(zhì)保藏米根霉的保存時間研究

陳思達 陳沙 張鳳英

摘要：對以粗糧為基質(zhì)保藏米根霉種的保存時限進行了探討。將不同年份的3株根霉種及其轉(zhuǎn)接制備的新鮮麩皮菌種，用于發(fā)酵糯米，測定發(fā)酵液的糖度，來衡量保存多年的根霉種的糖化酶活力和遺傳穩(wěn)定性。結(jié)果表明，保存3～8年的根霉種的酶活力變化很小；不同年份的3株根霉種及其轉(zhuǎn)接制備的新鮮菌種的酶活力與當年不相上下。由此可知，在4～7 ℃米根霉以粗糧為保藏基質(zhì)的保存時限可達8年以上，且遺傳穩(wěn)定性良好。

關(guān)鍵詞：米根霉；粗糧；糖度；酶活力；保存時限

中圖分類號：TS261.1 文獻標志碼：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20230525

Study on the preservation time of coarse grains cultures of Rhizopus oryzae

Chen Sida1， Chen Sha1， Zhang Fengying2

（ 1. Food Inspection and Testing Research Institute of Jiangxi General Institute of Testing and Certification， Nanchang， Jiangxi 330052； 2. School of Food Science and Technology， Jiangxi Agricultural University， Nanchang， Jiangxi 330045 ）

Abstract： In this paper， the preservation time of coarse grains cultures of Rhizopus oryzae was discussed. The three R. oryzae strains cultures from different years and the fresh wheat bran cultures transferred by the former were used to ferment glutinous rice. Saccharification enzyme activity and genetic stability of the preserved R. oryzae strains were measured by detecting the sugar content of the fermentation liquid. The results showed that the enzyme activity of R. oryzae strains stored for 3～8 years had little change. The enzyme activity of the three R. oryzae strains in different years and fresh cultures were similar to that of the same year. In conclusion， the preservation time of R. oryzae using coarse grains as storage substrate could reach more than 8 years at 4～7 ℃ and the genetic stability was good.

Key words： Rhizopus oryzae， coarse grains， total sugar， enzyme activity， preservation time

米根霉是釀酒用曲藥的主要糖化菌株，同時也是大曲中功能菌之一[1]，工業(yè)上還可用來生產(chǎn)淀粉酶[2]。根霉除有較強的糖化能力外，還具有一定的酒精發(fā)酵能力，但其酒精發(fā)酵能力比一般酵母弱得多，只能產(chǎn)生3%～5%的酒精度[3]；因此米根霉常作為生產(chǎn)小曲和甜酒釀的糖化菌種，另外它具有的產(chǎn)有機酸[4-6]的特性使酒的口感更香醇。菌株傳代保存是相關(guān)科研生產(chǎn)單位的重要工作之一。大多數(shù)酒曲廠都是采用試管培養(yǎng)基轉(zhuǎn)管傳代的方法保藏菌種，由于頻繁傳代培養(yǎng)，又加上小企業(yè)無菌操作設施和技術(shù)限制，菌種極易染雜菌和變異退化，一般每年都要到科研機構(gòu)或菌種保藏機構(gòu)購買母種，有時買來的菌種只能保證是這個種，不一定能保證所需要的優(yōu)良生產(chǎn)性能。如何長期有效地保藏性能優(yōu)良的米根霉菌種讓相關(guān)技術(shù)人員倍加關(guān)注。

目前真菌的保存方法主要有三類[7-8]：第一類是保持菌體連續(xù)生長的保藏方法，其特點是不斷將菌株轉(zhuǎn)接到新鮮培養(yǎng)基上，培養(yǎng)好后放在4～7 ℃冰箱中，此方法主要以斜面每2～3月轉(zhuǎn)接一次為主[9-10]，因需要頻繁傳代，易變異退化，染上雜菌的機會也較多[11]；第二類是在缺氧干燥的空間中保藏菌種的休眠體，如孢囊孢子、分生孢子等，此法可保存1～2年，保存過程中需換干燥劑、抽真空1～2次，操作也較繁瑣；第三類是通過抑制微生物的生長活性而達到長期保存目的，一般是低溫凍藏，如真空冷凍干燥、液氮保存[12]及磁珠保藏[13]等，微生物可存活5～20年，弊端是設備貴、操作復雜[14-15]，特別是微生物細胞冷凍和解凍活化技術(shù)要求都較高，在處理過程中也難免存在因冷凍降溫操作不慎導致冰晶對細胞造成的傷害問題，這也就是為什么有時企業(yè)從相關(guān)微生物保藏中心購買的凍干管菌種，活化轉(zhuǎn)接后會失去菌株原本的生產(chǎn)能力甚至接不活的原因；瓷珠菌種保存管法，常用于食品微生物標準菌種和分離菌株的保存、復蘇以及運輸，保存效果次于冷凍真空干燥保藏法，也比較容易操作，但保存時間較短[13]。

現(xiàn)在真菌保藏技術(shù)研究多以提高菌株的存活率和純度為衡量指標[16-17]，而忽視保持菌株的生產(chǎn)性能的穩(wěn)定性。況且沒有一種保藏方法能適合所有真菌的保藏，每一種真菌都應該有獨特的保藏方法。本研究擬設計一種以混合粗糧為基質(zhì)干燥冷藏保存根霉種的方法，將以該法保藏的不同年份的米根霉種及用其制備的新鮮菌種，用于發(fā)酵糯米，并測定糯米發(fā)酵液的糖度，以此來衡量該方法保存多年的根霉種的繁殖力和糖化力的穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要原料

麩皮、燕麥、藜麥、小米、玉米芯、糯米：市售。不同保藏年份的根霉種2-2、F14、F6：江西農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院微生物實驗室保存。

1.1.2 主要藥品

氫氧化鈉、酚酞、醋酸、醋酸鈉、五水硫酸銅、次甲基藍、酒石酸鉀鈉、亞鐵氰化鉀（均為分析純）：天津市永大化學試劑開發(fā)中心；可溶性淀粉、葡萄糖（均為分析純）：成都市科龍化工試劑廠。

1.1.3 主要儀器和設備

BCD-378DGN型冰箱：青島海爾股份有限公司；HH-B11-600型電熱恒溫培養(yǎng)箱、GZXDH-DXO-S型電熱恒溫干燥箱：上海躍進醫(yī)療器械廠；SW-CJ-2D型超凈工作臺：江蘇凈化設備有限公司；MJ-54A型高壓滅菌鍋：施都凱儀器設備（上海）有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 保藏培養(yǎng)基制備

稱取磨碎或粉碎玉米芯10%、燕麥片55%、小米20%、黎麥15%混合均勻，將上述原料混勻后放在65 ℃的烘箱內(nèi)烘2 h，用粉碎機打碎；先過20目篩篩掉粗顆粒，再過40目篩篩掉細粉，取篩上物料，加入物料質(zhì)量分數(shù)40%的海藻糖水溶液（含海藻糖8%），然后翻拌混勻至松散不結(jié)塊狀態(tài)即可。

1.2.2 根霉種保藏方法

將上述保藏培養(yǎng)基分裝入250 mL三角瓶中，用棉塞塞好包扎滅菌后，趁熱取出并將培養(yǎng)基拍散，冷卻，分別接入分離純化好的米根霉試管種F6、F14、2-2，然后于28～32 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40～48 h后，無菌操作在三角瓶內(nèi)弄散后裝入無菌牛皮紙信封中封好，于40～45 ℃恒溫干燥箱（使用前干燥箱應紫外燈照射殺菌）中干燥36～48 h，干燥脫水后，用無菌塑料袋裝好密封，放入2～7 ℃冰箱中保存3～9年。

1.2.3 轉(zhuǎn)接制備新鮮根霉種

稱取適量麩皮[18]，加入麩皮量40%～50%的水翻拌混勻至松散不結(jié)塊狀態(tài)，分裝入250 mL三角瓶中，用棉塞塞好包扎滅菌后，趁熱取出并將培養(yǎng)基拍散，冷卻，分別接入不同保藏年份的根霉種F6、F14、2-2，然后于28～32 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40～48 h后，弄散裝入滅菌過的牛皮紙信封中封好，于40～45 ℃恒溫干燥箱中烘干36～48 h，用無菌塑料袋裝好，放入2～7 ℃冰箱備用。

1.2.4 根霉種糖化力檢測

將糯米洗凈、浸泡3～4 h、瀝干水，隔水蒸至米半透明內(nèi)無白心，用純凈水淋冷至室溫，均勻拌入0.5%～1.0%的根霉種，裝入容器、壓實，用保鮮膜封好，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中糖化40～48 h，有酒香味及發(fā)酵液后，用糖度計測發(fā)酵液的糖度，以發(fā)酵液的糖度來反映根霉的糖化力。糖度越高，根霉的糖化力越強。

1.2.5 酸度測定

參考文獻[19]。

1.2.6 糖化酶活力測定

參考文獻[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 根霉菌株2-2保存時限探討

2.1.1 不同年份2-2的糖化力及其酒液的酸度

根霉2-2是從貴陽花溪酒曲中分離到的一株生產(chǎn)和生長性能類似于經(jīng)典根霉糖化菌Q303的菌株，在釀酒過程中不僅有很強的糖化能力，而且具有一定的酒精發(fā)酵能力[21]。將保存5～9年的2-2分別發(fā)酵糯米，以發(fā)酵液的糖度來反映其糖化力，以發(fā)酵液的酸度高低及是否有異味來確定保存的根霉種發(fā)酵的酒釀質(zhì)量是否符合要求，從而得出根霉種可保存年限。根霉2-2發(fā)酵液的糖度見圖1，酸度和風味見表1。

由圖1可以看出，保存了5～9年的根霉種的糖度均在40～45 °Bx，當年糖度和目前糖度的差值不大，符合根霉種質(zhì)量要求；保藏5年的有異味，可能是原種不純或是操作性污染，重復幾次后發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)同樣結(jié)果，由此可知是原種不純。由表1可以看出，發(fā)酵液的酸度均未超過0.5%，在相關(guān)標準規(guī)定的范圍內(nèi)。由此可知，保存的根霉種的糖化力基本沒有衰減。

2.1.2 用不同年份的2-2轉(zhuǎn)接制備的新鮮種的糖化力及其酒液的酸度

為了檢測所保藏種2-2的繁殖力及遺傳穩(wěn)定性，用保藏種2-2轉(zhuǎn)接制備成新鮮麩皮根霉種，糖化發(fā)酵糯米40～45 h，測發(fā)酵液的糖度和酸度。保存5年的由于不純，這步實驗忽略。由圖1可以看出，用保存3～9年的根霉轉(zhuǎn)接制備的新鮮根霉種的糖化力均在42.0～46.8 °Bx，新鮮種與保藏種的差值在0.5～2.0，且高低互現(xiàn)，說明糖化力基本未隨著保藏年份的增加而衰減，保持了優(yōu)良的繁殖力和遺傳穩(wěn)定性。 由表2可以看出，發(fā)酵液的酸度都沒超過0.5%，發(fā)酵液甜味純正豐滿，無明顯酸感，均無異味，說明保存過程中未染雜菌。

綜上所述，由燕麥皮、小米粉、藜麥粉等粗糧混合制備的保藏培養(yǎng)基培養(yǎng)的根霉種2-2干燥脫水后保存時限可達9年。

2.2 根霉菌F14保存時限的探討

2.2.1 不同年份F14的糖化力及其酒液的酸度

多數(shù)根霉菌株的孢子囊成熟后呈黑色，由于這些黑色孢子囊（一般簡稱黑孢子）往往影響米粉酒餅的外觀品質(zhì)，許多酒廠和酒曲經(jīng)銷商不喜歡使用或經(jīng)銷外表有黑孢子的酒餅，所以一般只適合做麩曲或糠曲，不適合做酒餅。而用F14做出的酒餅不長肉眼可見的黑孢子，糖化發(fā)酵能力又較強，因此F14成為湖北、四川、廣西等一些酒餅企業(yè)生產(chǎn)常用菌[22]。

用保存3～9年的F14發(fā)酵糯米，糖度見圖2，酸度和風味見表3。

由圖2可知，保存了3～9年的F14的發(fā)酵液糖度均大于44 °Bx，糖化力較高。由表3可知，發(fā)酵液的酸度較低，均小于0.37%，且發(fā)酵液均有蜂蜜的香甜味。由此確定，保存3～9年的F14的發(fā)酵特性未發(fā)生改變。

2.2.2 用不同年份的F14轉(zhuǎn)接制備的新鮮種的糖化力及其酒液酸度

為了檢測F14的繁殖力及遺傳穩(wěn)定性，將不同年份保藏種F14轉(zhuǎn)接制備成新鮮麩皮種，用其發(fā)酵糯米，觀測發(fā)酵液的糖度和酸度。由圖2可以看出，用不同年份的F14轉(zhuǎn)接制備的新鮮種的糖化力均在43～46 °Bx，說明糖化力基本上沒有衰減。由表4可以看出，發(fā)酵液的酸度多數(shù)較低（低于0.24%），保藏6年的酸度雖高（0.35%），但口感反而更豐滿；符合相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量要求，證明該方法保存9年的F14的糖化力和遺傳穩(wěn)定性依然很好。

2.3 根霉菌F6保存時限的探討

2.3.1 不同年份F6的糖化力和及其酒液的酸度

F6是從廣東肇慶傳統(tǒng)小曲中分離得到的一株糖化能力較強的菌株，與Q303、2-2、F14相比，F(xiàn)6的孢子囊梗和菌絲更短，在麥芽汁培養(yǎng)基表面生長會起皺褶，氣生菌絲稀疏，黑孢子很少。因此用其生產(chǎn)的酒餅不僅不長肉眼可見的黑孢子，還呈現(xiàn)悅目的淡黃色；且在糖化發(fā)酵中產(chǎn)生獨特風味。 該菌種現(xiàn)已被廣西、廣東、海南等地的一些酒曲廠采用。F6與2-2、F14純根霉曲相比，釀造的酒18種氨基酸總含量（1.7 g/100 mL）和人體8種必需氨基酸的總含量（0.53 g/100 mL）均更高[23]。

用不同年份的F6糖化發(fā)酵糯米，發(fā)酵液的糖度檢測結(jié)果見圖3，酸度和風味見表5。

由圖3可以看出，保存2～8年的根霉F6，其糖度在36～40 °Bx，與當年的糖化力差別在范圍內(nèi)，酸度雖普遍比2-2和F14都更高，但均未超過0.5%，且風味醇香可口，符合企業(yè)標準。

2.3.2 用不同年份的F6轉(zhuǎn)接制備的新鮮種的糖化力及其酒液的酸度

將保藏根霉種轉(zhuǎn)接制備新鮮種，用其發(fā)酵糯米，測糯米發(fā)酵液的糖度和酸度，以衡量F6的繁殖力及遺傳穩(wěn)定性。由圖3可知，用保存2～8年的F6轉(zhuǎn)接制備新種的糖化力均在39～42 °Bx，均比保藏種高1.0～3.4 °Bx，說明保藏種F6經(jīng)轉(zhuǎn)接活化后使用酶活力更強，生產(chǎn)效率會更高，這可能與F6孢子少有關(guān)系，因為孢子抵抗不良生長環(huán)境的能力更強，菌絲經(jīng)長時間的保存繁殖力比孢子要弱[24]。由表6可知，發(fā)酵液的酸度及風味與保藏種差不多，均未超過0.5%，在合格范圍內(nèi)，說明保存8年的 F6依然保持了良好的繁殖能力和糖化力。

綜上所述，以混合粗糧為基質(zhì)保藏的根霉F6的保存時限也可達8年。

2.4 糖化酶活力測定

為了驗證上述糖化力測定方法的可靠性，從不同年份的2-2、F14、F6保藏種和轉(zhuǎn)接制備的新鮮菌種中，各取1個糖化力最高的種，用還原法測定其糖化酶的活力，結(jié)果見圖4。

由圖4可以看出，所檢測的菌種的糖化酶活力與直接發(fā)酵糯米測定的糖化力強弱順序相吻合，說明本文使用的糖化發(fā)酵糯米的方法檢測根霉種的糖化力是可靠的。

3 結(jié) 論

由粉碎的燕麥、小米、藜麥、玉米芯混合制備的保藏培養(yǎng)基制備的根霉種干燥脫水后保存時限可達8～9年。根霉2-2和F14直接應用保藏種與轉(zhuǎn)接活化種發(fā)酵糯米的糖化力沒有明顯規(guī)律性的差別，但F6使用前將保藏根霉種轉(zhuǎn)接活化后其糖化酶活力均更高。

保藏種可隨取隨用，每次從冷藏冰箱取用時只需先回溫至常溫，再打開封口就可直接用于制備2級種；而試管和冷凍管菌種須活化1～2代，再擴培后，才能用于制備2級種。從活化、擴培到制備2級種至少要再傳2～4代[25-26]，用本方法的保藏種制備2級種只需傳1～2代。

本研究中4種保藏培養(yǎng)基組分玉米芯、燕麥、小米、藜麥各有功能。其中，玉米芯是玉米棒剝掉玉米粒的廢棄物粉碎而成的，在培養(yǎng)基組成中不作為根霉菌的營養(yǎng)組分，只起疏松透氣和固定化作用；藜麥淀粉含量雖很低，但含30%的胚芽，蛋白質(zhì)、皂甙和多酚含量均比其它谷物高，抗氧化能力較強，其蛋白含量豐富且比例平衡，含有全部天然氨基酸，是聯(lián)合國糧農(nóng)組織推薦的唯一全營養(yǎng)食品[27]，是作為本文保藏培養(yǎng)基的保健組分；小米含有其它原料中沒有的胡蘿卜素，維生素B1的含量居其它谷物之首，此外小米的鈣含量也較高且僅次于燕麥[28]，鈣是許多生物酶的激活劑，在保藏方法中小米對根霉起復壯作用；燕麥是該保藏培養(yǎng)基的基本營養(yǎng)組分。綜上所述，該保藏培養(yǎng)基中4種原料相輔相成，各有其重要功能。

該保種方法：操作簡單，對設備要求低，保藏時間長，保存量大，保存菌種的糖化力穩(wěn)定，對于一般酒曲企業(yè)和酒廠，尤其是個體戶是一項很實用的保種技術(shù)，對釀造工業(yè)用種質(zhì)資源的可持續(xù)發(fā)展也有重要意義。后續(xù)將對保藏8～9年的3個種進行產(chǎn)糖化酶基因測序，并與用試管頻繁轉(zhuǎn)管保藏種的酶基因?qū)Ρ龋^察其相關(guān)遺傳基因是否有變化。

參 考 文 獻

[1] 舒波，余金洪，王濤.半夏曲發(fā)酵機制及主要優(yōu)勢真菌的發(fā)酵功能研究[J].中草藥，2022，53（10）：3022-3031.

[2] 陳衛(wèi)平，劉火興，黃安全，等.制曲工藝[M].南昌：江西科學技術(shù)出版社，1993：32-37.

[3] 張鳳英，董開發(fā)，涂瑾.根霉酒精發(fā)酵特性的研究[J].食品科學，2002，23（8）：158-159.

[4] FU Y Q， XU Q， LI S， et al. Strain improvement of Rhizopus oryzae for over-production of fumaric acid by reducing ethanol synthesis pathway[J]. Korean Journal of Chemical Engineering， 2010， 27（1）：183-186.

[5] SHU B O， YING J， WANG T， et al. Microbiota and chemical compounds in fermented Pinelliae Rhizoma （Banxiaqu） from different areas in the Sichuan Province， China [J]. Pol J Microbiol， 2019， 68（1）：83-92.

[6] 顧金剛，李世貴，姜瑞波.真菌保藏技術(shù)研究進展[J].菌物學報，2007，26（2）：316-320.

[7] 孫葳.淺談微生物菌種保藏方法[J].輕工標準與質(zhì)量，2021（1）：95-96.

[8] 周龍洋，霍光華，羅貴祥.3種保藏方法對66種大型真菌活力影響[J].生物災害科學，2013，36（2）：130-136.

[9] 孫智敏，張文齊，邵威平，等.醋酸菌菌種保藏方法的改進及保藏期限的研究[J].中國釀造，2005（12）：30-32.

[10] 蔡令儀，譚琦，曹暉.不同菌種保藏方法對香菇產(chǎn)量的影響[J].食用菌學報，2003，10（4）：52-54.

[11] 吳婧，李東明，de HOOG G S.病原性絲狀真菌的菌種保藏方法[J].中國真菌學雜志，2011，6（5）：305-307.

[12] 桑軍軍，鄧淑文，郭凱.醫(yī)學真菌菌株保藏方法概述[J].中國真菌學雜志，2014，9（2）：107-110.

[13] 楊文君.食品微生物實驗室標準菌株的瓷珠保藏方法[J].現(xiàn)代食品，2020（12）：47-48.

[14] COMEAU A M， DOUGLAS G M， LANGILLE M G I， et al. Microbiome helper：a custom and streamlined workflow for microbiome research[J]. mSystems，2017，2（1）：e00127-16.

[15] 姜寧，李玉，周峰.一種香菇菌種保藏方法初探[J].食用菌，2020，42（5）：22-23+27.

[16] 杜興蘭，李正楠，姬惜珠，等.葡萄生軸霜霉菌孢子囊的長期保存菌[J].菌物學報，2008，27（6）：908-914.

[17] 馬海霞，梁慧剛，黃翠，等.我國菌種保藏機構(gòu)的現(xiàn)狀與未來[J] .軍事醫(yī)學，2018，42（4）：304-308.

[18] 趙輝.基于生物技術(shù)的小麥麩皮深加工工藝[J].糧食科技與經(jīng)濟，2018，43（9）：69-71.

[19] 李啟隆，胡勁波.食品分析科學[M].北京：化學工業(yè)出版社，2011：123-125.

[20] 劉慧，張紅星，高秀芝.現(xiàn)代食品微生物學實驗技術(shù)[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，2021：253-255.

[21] 張鳳英，黃占旺，顏賢仔.外界環(huán)境對F-14根霉長黑孢子能力的影響[J].釀酒，2002，29（3）：26-29.

[22] 于博，董開發(fā)，張鳳英，等.廣東肇慶傳統(tǒng)酒曲優(yōu)勢霉菌的分離及鑒定[J].中國食品學報，2007，7（1）：95-99.

[23] 王鵬，張鳳英.米根霉 F6 生長和發(fā)酵特性的研究[J].釀酒科技，2014（3）：21-24.

[24] ZHANG L， JIANG X L， YANG X Y， et al. Inhibition of chlamydospore germination and mycelial growth of Trichoderma spp. by chemical fungicides[J]. Agricultural Science & Technology，2015，16（7）：1494-1499.

[25] 孫婷，黃彩桃，呂曉航，等.紅曲霉高產(chǎn)菌株篩選及固態(tài)發(fā)酵研究[J].糧食科技與經(jīng)濟，2019，44（5）：121-122.

[26] 楊春曉，方艷梅，黃輝濤，等.兩種菌種保藏方法對金黃色葡萄球菌抗力影響的研究[J].國際檢驗醫(yī)學雜志，2022，43（6）：668-671.

[27] 魏愛春，楊修仕，么楊，等.藜麥營養(yǎng)功能成分及生物活性研究進展[J].食品科學，2015，36（15）：272-276.

[28] 楊統(tǒng)帥，張文占，馬森.小米的營養(yǎng)價值及在面制品中的應用[J].糧食加工，2022，47（1）：22-28.