氣相色譜-熱能分析法測定羊乳中11種N-亞硝基類化合物

何強，張亞莉，施妍婧，李子豪，高暉

（1.西安海關技術中心，西安710068；2.陜西科技大學食品與生物工程學院，西安710068）

0 引言

大約90%亞硝胺類化合物具有致癌性[1]。生成亞硝胺的前體物質亞硝酸鹽、硝酸鹽和胺類在食物中普遍存在，食品N-亞硝胺的主要來源包括外源性污染和內源性合成，亞硝酸鹽與胺的反應生成等[2]。羊乳在運輸、儲存等過程中，因微生物污染、包裝材料遷移等，均可能造成N-亞硝胺類物質產生[3-5]。我國食品安全監控質量指標體系中，僅對食品中肉及肉制品、水產動物及其制品中N-二甲基亞硝胺限量做了規定，分別為3.0μg/kg和4.0μg/kg為硝，對其他食品類別中亞硝胺類化合物的限量未做規定，也沒有相關的風險監測數據，對羊乳中N-亞硝胺類化合物檢測技術開展研究具有現實意義。

N-亞硝胺類化合物檢測方法眾多，常用的檢測方法有氣相色譜法[6-8]、氣相色譜-質譜法[9-11]、液相色譜-質譜法[12-16]、熱能分析法（GC-TEA）[17-19]等，其中熱能分析法專屬性強、靈敏度高，適合進行微量N-亞硝胺類化合物檢測。關于N-亞硝胺的前處理方法主要有水蒸氣蒸餾法[11]、固相萃取法[20-24]和QuEChERS方法[25]，奶基質中含有大量的磷脂等雜質，因此樣品的前處理凈化步驟至關重要，查閱相關標準發現，GB 5009.26-2016《食品安全國家標準 食品中N-亞硝胺類化合物的測定》采用水蒸氣蒸餾提取，該方法可以達到理想的凈化效果，但用水蒸餾法進行樣品前處理，樣品需求量大，操作過程復雜、耗時長，全玻璃蒸餾裝置采用膠管接口密封，存在老化現象、密封性不好，對于批量操作存在一定的局限性并且由于亞硝胺類化合物熱穩定性差，存在重復性差、耗時長，無法批處理的缺點[26-27]。本實驗室前期采用Prime HLB固相萃取柱凈化效果良好，可以有效的去除牛奶中磷脂等脂類物質，大幅簡化凈化步驟，提高檢測效率。

本研究通過優化樣品前處理及儀器檢測條件，建立了PRime HLB通過型固相萃取柱凈化，熱能分析儀檢測的方法，實現了奶中11種N-亞硝胺類化合物的快速檢測，取得良好效果，提高了檢測效率，保證了檢測結果的穩定性及良好的方法回收率。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

氣相色譜,安捷倫公司；熱能分析儀（800 Series TEA)，英國Ellutia公司；高速離心機(AllegraTM X-22R centrifuge)，德國BECKMAN公司；渦旋混合器(IKAVORTEX GENIUS3)，德國IKA公司；振蕩器(IKA-WAKER)，德國IKA公司；Milli-Q超純水器(Advantage-10/Elix)，美國Millipore公司；PRiME HLB固相萃取小柱（3 mL，200 mg)，美國Waterst公司。

乙酸乙酯(色譜純)，美國TEDIA公司；10種亞硝胺類混合標準品：N-亞硝胺-N-乙基苯胺(N-nitroso-N-ethylaniline)、N-甲基-N-亞硝基苯胺(Nnitroso-N-methylaniline)、亞硝基-二乙基胺(n-nitrosodiethylamine)、N-亞 硝 基 二 甲 胺 (N-nitrosodimethylamine)、N-亞硝基二丁胺(n-nitrosodin-butylamine)、二丙基亞硝胺(n-nitrosodi-n-propylamine)、N-亞硝基二苯胺(n-nitrosodiphenylamine)、N-亞硝基甲基乙基胺(N-nitrosomethylamine)、N-亞硝基呱啶(N-nitrosopiperidine)、N-亞硝基吡咯烷(Nnitrosopyrrolidine)，純度≥97%，德國Dr.Ehrenstorfer公司；其他試劑均來于國產分析純。

供試樣品，市售奶。

1.2 樣品前處理

準確稱取5 g（精確至0.001 g）樣品于50 m L具塞離心管中，加入10.0 mL乙酸乙酯，渦旋混勻5 min，置于-20℃冰箱冷凍20 min，加1 g氯化鈉和1 g無水硫酸鎂，渦旋混勻2 min，于10℃冷凍離心機中9 000 rpm/min離心5 min，取2.0 mL上清液通過PRime HLB固相萃取柱（無需活化柱子），收集濾液，上機檢測。

1.3 GC-TEA工作條件

色譜柱：DB-FFAP毛細管色譜柱(25 mm×0.32 mm，0.5μm)；進樣口溫度：120℃；程序升溫條件：初始溫度60℃保持0.2 min，15℃/min升至82℃，1℃/min升至88℃，15℃/min升至140℃，保持12 min，20℃/min升至240℃，保持10 min；載氣：氮氣（≥99.999%）；流速：1.0 mL/min;進樣方式：不分流進樣；進樣體積：2μL；TEA條件：接口溫度：250℃；熱解室溫度：500℃；真空度：0.5 torr；氧氣壓力：2 Psi;臭氧水平：195；FILTER模式:F2；靈敏度:240。在上述條件下，標準物質色譜圖見圖1。

圖1 N-亞硝胺標準物質色譜圖

2 結果與討論

2.1 氣相色譜條件優化過程

根據N-亞硝胺類物質的性質，本文選擇了HP-5、DB-WAX和DB-FFAP 3種色譜柱對11種N-亞硝胺類化合物混標進行測試。HP-5無法做到有效分離，僅有5個色譜峰，而且保留時間很短，峰響應也低，如圖2所示。DB-FFAP色譜柱與DB-WAX色譜柱相比較，DB-FFAP可以分離11個峰，峰型對稱，分離度好，而且為了簡化凈化過程，進樣樣品溶液沒有脫水，而DB-FFAP色譜柱相比DB-WAX更適應含水樣品，因此選用DB-FFAP色譜柱。

圖2 HP-5分離10種N-亞硝基類化合物色譜圖

本文比較了進樣口溫度為200℃和250℃N-亞硝基類化合物的色譜圖，結果表明當進樣口溫度為250℃時，N-亞硝基類化合物的響應更高，因為進樣口溫度提高可以更好的氣化N-亞硝基類化合物。另外，部分品牌的玻璃棉會吸附N-亞硝基類化合物，影響測定結果的穩定性，應予以關注。

2.2 提取劑的選擇

亞硝胺類化合物沸點較低、易揮發，提取溶劑會影響其靈敏度和準確性。根據相似相溶原理，本實驗考察了甲醇、乙腈、乙酸乙酯對羊乳中11種亞硝胺類化合物的提取效果。實驗表明，用甲醇提取時，無乳化現象，提取液甲醇水混合物，不利于后續凈化和檢測，而且上清液過PRime HLB固相萃取柱后，凈化效果不明顯，檢測時有明顯的雜峰，11種亞硝胺類化合物的回收率也低于50%，影響準確定量；用乙腈提取時，11種亞硝胺類化合物只有8種在色譜上出峰，且回收率均低于50%；用乙酸乙酯提取時，11種亞硝胺類化合物均能出峰，回收率在78%~107%之間，且峰型對稱；因此選擇乙酸乙酯作為提取劑。

2.3 提取條件的優化

前處理過程中用到硫酸鎂會產生大量熱量，溫度升高，N-亞硝胺類化合物會存在較大損失，試驗對比了樣品加入乙酸乙酯提取后置于冰箱冷凍與不經過冷凍直接加入硫酸鎂和氯化鈉提取效果。結果表明樣品加入乙酸乙酯提取后置于冰箱冷凍比不經過冷凍直接加入硫酸鎂和氯化鈉提取亞硝類化合物的回收率高，因此本標準將樣品加入乙酸乙酯渦旋后，置于冰箱冷凍20 min后再進行萃取。

2.4 凈化方式的選擇

研究比較了水蒸氣法、QuECHERS法、C18固相萃取和PRime HLB固相萃取等4種凈化方法。實驗結果表明，按GB 5009.26-2016規定的亞硝胺檢測方法方法檢測，水蒸汽蒸餾法適用于低沸點N-亞硝胺，但無法將高沸點N-亞硝胺類化合物（NPYR、NmorPh、NDphA）從分離出來，回收率差且不穩定，而且檢測樣品需求量大，操作過程復雜、耗時長；用C18小柱凈化則回收率偏低，除了對NDPhA有較好的富集效果外，對NDMA、NMEA、NDEA、NPYR、NMorPh等化合物的富集效果均較差，回收率低于20%；用QuECHERS法，回收率不穩定且偏低，可能因為無水硫酸鎂溶于水會放熱，導致目標化合物不穩定。用PRime HLB固相萃取柱凈化，無須活化、淋洗、洗脫，操作簡便，減少了過程損失，而且可以有效去除磷脂、蛋白質等雜質，各目標化合物的回收率均在80%~110%之間，因此選用PRime HLB固相萃取柱進行凈化。

用乙酸乙酯液液萃取提取后，在-20℃冰箱冷凍20 min，可以使部分脂類雜質析出，再用PRime HLB固相萃取柱凈化，可以提高凈化效果。

2.5 氮吹的影響

亞硝胺類化合物穩定性差、揮發性強，因此實驗考察了氮吹對亞硝胺類化合物回收率的影響。樣品加標，提取凈化后，對比了提取液經氮吹濃縮至近干，1.0 m L乙酸乙酯定容和提取液不濃縮直接過濾膜上機。結果發現樣品經氮吹濃縮后，亞硝胺類化合物的回收率顯著降低、基質效應明顯增強，并且回收率不穩定，這可能由于亞硝胺類目標物具有一定的揮發性，受氮吹溫度、流速、時長等因素影響較大，并且這些因素受認為干擾大，而不氮吹直接上樣，在靈敏度滿足要求的情況下會避免這些不良因素的發生，因此本實驗選擇方法是：提取凈化樣品后，不經濃縮處理，直接上機。

2.6 線性范圍和檢出限/回收率及精密度

將不同質量濃度的亞硝胺類化合物的標準溶液按本方法確定的條件進行測定。以化合物的峰面積（Y）對其質量濃度（X，μg/mL）繪制標準曲線，在1~100 ng/mL濃度范圍內，線性相關系數均大于0.99。以信噪比S/N=10計算方法的定量限，其中N-亞硝基-N-乙基苯胺（NEPh A）、N-亞硝基-N-乙基苯胺（NMPhA）的定量限為20μg/kg，其他的均為10μg/kg。

選用奶粉空白樣品進行10、20、50μg/kg 3個濃度的加標回收率實驗，每個加標水平平行測定6次。實驗表明，本方法對11種亞硝胺類化合物的回收率為75.0%~107%，相對標準偏差（RSD）在4.4%~9.2%（n=6）之間，方法有良好的精密度和準確度，滿足分析要求。

3 結 論

本研究采用通過型固相萃取前處理，氣相色譜-熱能分析儀法，建立了羊乳中11種亞硝胺類化合物殘留檢測方法。方法簡便、快速、準確、靈敏、適用性強，對于研究監測羊乳中N-亞硝胺類化合物，評估羊乳質量安全具有積極作用。