木犀草素通過HIF-1α抑制糖酵解調控M1型巨噬細胞極化

張步春，張甜甜，項楚涵，劉耀武

(1.中國科學技術大學附屬第一醫院(安徽省立醫院)心血管內科，安徽 合肥 230001；徐州醫科大學2.研究生學院、3.藥學院，江蘇 徐州 221004)

巨噬細胞浸潤和促炎表型的M1型巨噬細胞極化與心腦血管等慢性疾病的發生發展密切關，M1型巨噬細胞活化過程中釋放多種促炎因子、誘導活性氧(reactive oxygen species，ROS)產生和激活NF-κB等信號通路等[1-2]。近年來研究顯示，糖酵解途徑(或稱warburg效應)是M1型極化巨噬細胞獲取能量的主要代謝方式[3]。多項研究結果也表明，糖酵解在M1型巨噬細胞炎性激活中發揮關鍵作用，而阻斷糖酵解途徑可有效抑制M1型巨噬細胞極化[4-5]。低氧誘導因子1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)作為機體缺氧反應的主要調節因子，其與糖酵解途徑和巨噬細胞炎癥表型的轉化有密切關系[6-7]。有研究報道，動脈粥樣硬化斑塊進展與HIF-1α介導的糖酵解效應和釋放炎性表型巨噬細胞相關[8]。因此，阻斷HIF-1α有可能成為抑制細胞糖酵解和M1型巨噬細胞活化的有效手段。

木犀草素(luteolin)作為一種天然黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化和抗腫瘤生成等多種藥理活性[9-10]。我們課題組前期研究發現，木犀草素通過上調細胞自噬水平，抑制ox-LDL誘導泡沫巨噬細胞形成和巨噬細胞凋亡[11],以及抑制NLRP3炎癥小體激活和巨噬細胞極化[12]。木犀草素是否通過糖酵解途徑調控M1型巨噬細胞極化目前尚無報道，本實驗就此開展研究，為今后木犀草素臨床治療心腦血管疾病提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞株小鼠巨噬細胞 RAW264.7 購自中國科學院上海細胞庫。

1.2 主要材料與試劑木犀草素(美國Sigma公司，L9283)；脂多糖(LPS)(美國Sigma公司，L4391)、干擾素γ(IFN-γ)(美國Peprotech公司，300-02-20)、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)(中國Affinity公司，AF0199)、缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)(中國Affinity公司，AF1009)和GAPDH抗體(中國Affinity公司，AF7021)；精氨酸酶-1(Arg-1)(美國CST公司)；β-actin抗體(美國Abcam公司，ab179467)；FITC染CD86抗體(美國Biolegend公司，10500)；PE染CD206抗體(美國Thermo Scientific公司，12206180)；2-脫氧葡萄糖(2-DG)(美國APExBIO公司，HY-13966)；TRIzol試劑(美國MCE公司，15596-026)；SYBR Premix Ex Taq II(日本TaKaRa公司，RR820A)；DMEM培養基(美國 Hyclone公司，SH30243.01)；胎牛血清(美國Gibco公司，10099141)。

1.3 主要儀器Light Cycle 480Ⅱ型熒光定量PCR儀(瑞士Roche公司)；164-5052型電泳儀，170-3940型半干轉印槽(美國Bio-Rad公司)；Elx808酶標儀(美國 BioTek 公司)；FACSCanto II流式細胞儀(BD Biosciences)。

1.4 細胞培養和M1型巨噬細胞炎癥模型建立小鼠RAW264.7 細胞常規培養于DMEM細胞培養液中(含有10%胎牛血清)，在5%的CO2，37 ℃條件下，恒溫培養并傳代。參照課題組既往方法[13]，100 μg·L-1LPS 聯合20 μg·L-1IFN-γ刺激RAW264.7細胞建立M1型巨噬細胞模型。

1.5 細胞分組與給藥細胞隨機分為對照組(常規培養細胞，不給予任何干預處理)(M0)和M1型巨噬細胞模型組(100 μg·L-1LPS和20 μg·L-1IFN-γ誘導)(M1)；之后將M1組分為Luteolin治療組(16 μmol·L-1)、2-DG組(0.5 mmol·L-1，糖酵解抑制劑)、Luteolin+2-DG組、Luteolin+DMOG組(10 μmol·L-1，HIF-1α激活劑)。上述各組分別藥物處理完畢后24 h收集細胞。

1.6 MTT法檢測細胞活性將木犀草素與LPS+IFN-γ誘導的RAW264.7細胞共孵育24 h，并設置對照組。每組設6個復孔，每孔加入10 μL MTT溶液避光培養細胞4 h，在酶標儀490 nm處測量各孔的吸光值，計算藥物對細胞活性的影響。

1.7 流式細胞儀檢測巨噬細胞標記物將6孔板中的細胞5% CO2孵育箱中37 ℃培養，離心吹打細胞后，然后用100 μL PBS重懸細胞。收集各組細胞，預冷PBS清洗各組細胞，離心、棄上清，100 μL PBS重懸細胞，分別加入5 μL FITC標記CD86抗體和CD206抗體4 ℃避光孵育30 min，100 μL PBS洗滌及重懸標記的細胞，用流式細胞儀檢測分析。

1.8 Western blot檢測提取各組細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，每組樣品30 μg蛋白SDS-PAGE 電泳分離，轉膜，封閉(5% BSA)1 h。分別加入一抗(1 ∶1 000)4 ℃搖床孵育過夜。TBST洗膜3次后，加入二抗(1 ∶1 000)，室溫下孵育1 h，TBST洗膜后，使用ECL化學發光法顯色，利用ImageJ軟件(美國國家衛生研究院)分析各組蛋白質的相對表達含量。

1.9 Real-time PCR檢測TRIzol法提取細胞總RNA，取1 μg反轉錄成cDNA ，上海生工生物工程技術公司合成引物，引物序列見Tab 1。按照SYBR Green PCR Master Mix試劑盒說明進行Real-time PCR操作，反應條件為：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸 30 s，45個循環，最后延伸 10 min。2-ΔΔCT值定量分析目的基因表達數據。

Tab 1 Primers for qPCR

1.10 細胞葡萄糖和乳酸濃度檢測收集各組細胞，離心取上清，按照檢測試劑盒說明書操作，96孔板每孔取200 μL進行檢測，于505和530 nm波長處分別檢測葡萄糖和乳酸吸光度值。

1.11 ELISA檢測收集各組細胞上清液，按照ELISA試劑盒說明書檢測IL-6和IL-10。

2 結果

2.1 M1型巨噬細胞模型的構建及驗證與對照組相比，100 μg·L-1LPS+20 μg·L-1IFN-γ誘導刺激RAW264.7細胞24 h后高表達M1型巨噬細胞標記物iNOS和CD86(Fig 1)，表明RAW264.7來源的M1型巨噬細胞成功建立。

2.2 木犀草素作用M1型巨噬細胞的最佳濃度不同濃度的木犀草素(1、2、4、8、16、32和64 μmol·L-1)分別處理LPS+IFN-γ誘導的巨噬細胞24 h，MTT結果顯示32 μmol·L-1木犀草素抑制了M1型巨噬細胞活性，故本研究使用16 μmol·L-1的木犀草素用于后續試驗。

2.3 各實驗組M1型巨噬細胞糖酵解關鍵基因表達變化的比較與M0組比較，LPS+IFN-γ誘導的M1型巨噬細胞糖酵解關鍵分子GLUT1、HK2、PFK1和PK的mRNA表達明顯增加；加入16 μmol·L-1木犀草素處理后，GLUT1、HK2、PFK1和PK的mRNA表達明顯降低。與M1組相比，糖酵解阻斷劑2DG處理組和木犀草素聯合2DG組GLUT1、HK2、PFK1和PK的mRNA表達也明顯降低(Fig 2)。

Fig 1 Expression of M1 macrophage markers in LPS/IFN-γ-induced RAW264.7 n=3)A:The protein expression of CD86 measured by flow cytometry；B:The protein expression of inducible NOS (iNOS) detected by Western blot.**P<0.01 vs control group.

Fig 2 The mRNA expression levels of genes related to glycolysis in each n=3)A:The mRNA expression level of GLUT1；B:The mRNA expression level of HK2；C：The mRNA expression level of PFK1；D：The mRNA expression level of PK.**P<0.01 vs control group；#P<0.05,##P<0.01 vs LPS/IFN-γ group.

2.4 各實驗組M1型巨噬細胞葡萄糖消耗和乳酸生成的比較同M0組比較，M1組巨噬細胞葡萄糖消耗減少，乳酸分泌量增加；給予木犀草素干預后，M1型巨噬細胞葡萄糖消耗增加，乳酸分泌量減少，差異有統計學意義。同M1組相比，單獨使用糖酵解阻斷劑2DG組以及木犀草素聯合2DG組M1型巨噬細胞葡萄糖消耗增加、乳酸分泌量也減少(Fig 3)。

2.5 各實驗組巨噬細胞表型相關蛋白變化的比較與M0組比較，M1組細胞高表達M1表型標記物iNOS蛋白。而木犀草素治療組、糖酵解阻斷劑2DG處理組和木犀草素聯合2DG組iNOS蛋白的表達水平均降低；M2表型標記物Arg-1蛋白的表達水平均增高(Fig 4)。

流式細胞儀檢測數據分析顯示，與M0組比較，M1組細胞M1表型標記物CD86比例增加，而M2型標記物CD206比例無明顯差異。與M1組相比，木犀草素治療組、糖酵解阻斷劑2DG處理組和木犀草素聯合2DG組CD86的表達水平均降低；而CD206的表達水平均增加(Fig 5，6)。試驗結果進一步說明，木犀草素通過抑制糖酵解水平影響M1型巨噬細胞向M2型轉化。

Fig 3 Result of glucose consumption and lactic acid test in each group n=3)A:Level of glucose consumption；B:Level of lactic acid.*P<0.05 vs control group；#P<0.05,##P<0.01 vs LPS/IFN-γ group.

2.6 各實驗組HIF-1α蛋白和基因變化的比較為了驗證木犀草素是否對M1型巨噬細胞中HIF-1α信號通路產生影響，我們采用Western blot和qRT-PCR檢測細胞中HIF-1α蛋白和mRNA的表達。研究結果顯示，與M1組相比，木犀草素降低M1型巨噬細胞中HIF-1α蛋白和mRNA表達。與木犀草素治療組比較，M1組巨噬細胞在單獨加入DMOG或者同時加入木犀草素和DMOG的檢測結果顯示，細胞中HIF-1α蛋白和mRNA表達水平均上調(Fig 7)。研究結果表明，木犀草素可能通過HIF-1α信號分子發揮作用。

2.7 HIF-1α穩定對各實驗組巨噬細胞糖酵解基因表達和巨噬細胞極化分型的影響為了證實木犀草素通過HIF-1α信號通路影響M1型巨噬細胞糖酵解和極化狀態，我們運用HIF-1α穩定劑DMOG干預巨噬細胞后，采用qRT-PCR和ELISA方法檢測了木犀草素對糖酵解關鍵分子和巨噬細胞表型標記物的表達。qRT-PCR檢測結果顯示，與M1組相比，木犀草素減低M1型巨噬細胞中GLUT1、HK2、PFK1和PK的mRNA表達。與木犀草素治療組比較，DMOG單獨處理組以及木犀草素和DMOG共培養組GLUT1、HK2、PFK1和PK的mRNA表達上調(Fig 8)。該結果進一步證明，HIF-1α激活后，木犀草素抑制M1型巨噬細胞糖酵解作用減弱。

Fig 4 The protein expression of macrophage polarization A:The protein expression of iNOS，and the histogram is protein quantification normalized to GAPDH；B:The protein expression of Arg-1,and the histogram is protein quantification normalized to GAPDH.**P<0.01 vs control group；#P<0.05,##P<0.01 vs LPS/IFN-γ group.

Fig 5 Proportion of CD86 in each group measured by flow n=3) **P<0.01 vs control group；#P<0.05 vs LPS/IFN-γ group.

Fig 6 Proportion of CD206 in each group measured by flow n=3)#P<0.05 vs LPS/IFN-γ group.

Fig 7 The protein and mRNA expression of HIF-1α in each group n=3)A:The protein expression of HIF-1α,and the histogram is protein quantification normalized to GAPDH；B:The mRNA expression level of HIF-1α.*P<0.05，**P<0.01 vs control group；##P<0.01 vs LPS/IFN-γ group；&P<0.05，&&P<0.01 vs LPS/IFN-γ group treated with luteolin.

Fig 8 The expression levels of genes related to glycolysis in each group treated by A：The mRNA expression level of GLUT1；B：The mRNA expression level of HK2；C：The mRNA expression level of PFK1；D：The mRNA expression level of PK.*P<0.05，**P<0.01 vs control group；##P<0.01 vs LPS/IFN-γ group；&&P<0.01 vs LPS/IFN-γ group treated with luteolin.

同時ELISA檢測結果也顯示，與M1組比較，木犀草素降低巨噬細胞M1型標記物IL-6濃度；增加M2型標記物IL-10濃度。而DMOG處理可拮抗木犀草素這一作用(Fig 9)。該結果也進一步證明HIF-1α激活影響木犀草素調控M1型巨噬細胞向M2型轉化。

Fig 9 The expression levels of macrophage polarization markers in each group treated by n=3)A：Level of IL-6；B：Level of IL-10.**P<0.01 vs control group；##P<0.01 vs LPS/IFN-γ group；&&P<0.01 vs LPS/IFN-γ group treated with luteolin.

3 討論

木犀草素作為一種天然黃酮類化合物，具有抑制促炎因子表達和體內、體外保護細胞氧化應激損傷等多種藥理活性。M1/M2型巨噬細胞比例失衡與動脈粥樣硬化等慢性疾病的發生密切相關[14]。然而，木犀草素調控巨噬細胞極化表型的分子機制目前尚不清楚。

本研究結果顯示，木犀草素預處理后M1型巨噬細胞中HIF-1α蛋白和mRNA表達下調，同時M1型巨噬細胞糖酵解關鍵分子GLUT1、HK2、PFK1和PK的mRNA表達下降。單用木犀草素或者聯合糖酵解抑制劑2-DG處理均能降低CD86的表達，上調CD206的表達水平。而HIF-1α激活劑DMOG能夠拮抗木犀草素上述作用。上述結果提示木犀草素負調控M1型巨噬細胞極化的機制可能與降低細胞中HIF-1α和糖酵解水平相關。

研究發現，巨噬細胞激活后HIF-1α通過GLUT1、HK2、PFK1和PK等基因促進糖酵解的發生；缺失HIF-1α的細胞表現出糖酵解速率及能量產生的降低[15-16]。說明HIF-1α對巨噬細胞具有代謝重編程的作用；除此以外，HIF-1α通過影響巨噬細胞的表型及功能影響相關疾病的發生發展。有研究報道，ω-炔基花生四烯酸通過干擾HIF-1α與糖酵解相關酶基因PKM之間的相互作用調控巨噬細胞向M2型極化來發揮減輕急性心肌損傷作用[17]。缺失巨噬細胞特異性的HIF-1α可減少LDLR-/-小鼠的動脈粥樣硬化斑塊形成，其機制與減少巨噬細胞葡萄糖攝取、抑制M1型巨噬細胞生成和炎癥相關基因表達相關[18]。以上HIF-1α介導糖酵解途徑的研究對于進一步明確木犀草素調控M1型巨噬細胞極化的作用靶點提供了新的思路。

綜上所述，本研究證實木犀草素能夠減少M1型巨噬細胞中HIF-1α表達、抑制糖酵解和促進巨噬細胞向M2型極化。這些證據為木犀草素抗動脈粥樣硬化治療提供了新的分子機制和靶點。