乳酸脫氫酶抑制劑減輕內(nèi)毒素誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷

昝欣言，楊夢(mèng)欣，張馨月，楊永強(qiáng)，張 力

(重慶醫(yī)科大學(xué)1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室、2.干細(xì)胞與組織工程研究室，重慶 400000)

由病原體感染、藥物中毒、毒素暴露等原因?qū)е碌募毙愿螕p傷是臨床常見(jiàn)疾病，嚴(yán)重者可危及患者生命[1]。失控性的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激所導(dǎo)致的肝細(xì)胞損傷被認(rèn)為是急性肝損傷發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵機(jī)制[2]。代謝反應(yīng)為細(xì)胞的正常生理活動(dòng)提供必須的能量和化學(xué)支持，也是病理反應(yīng)中不可缺少的代謝基礎(chǔ)[3]。因而，調(diào)控代謝反應(yīng)已成為急性肝損傷等多種疾病防治的新途徑。

葡萄糖代謝是細(xì)胞中最重要的代謝反應(yīng)之一，包括糖酵解、三羧酸循環(huán)、氧化磷酸化等代謝環(huán)節(jié)[4]。炎癥、腫瘤等常見(jiàn)病理過(guò)程中常伴隨糖酵解反應(yīng)的增強(qiáng)，這一代謝重編程現(xiàn)象稱(chēng)為瓦伯格效應(yīng)，與炎癥損傷、腫瘤增殖等關(guān)系極其密切[5]，而抑制糖酵解可明顯減輕炎癥反應(yīng)、抑制腫瘤增殖[6]。

內(nèi)毒素，或稱(chēng)脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革蘭陰性細(xì)菌的胞壁成分，是最常見(jiàn)的致炎刺激之一，與多種臨床肝損傷的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[7]。LPS可在D-半乳糖胺(D-galactosamine,D-Gal)致敏的小鼠中選擇性誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡，被廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)研究[8]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，采用2-脫氧葡萄糖抑制糖酵解可明顯減輕LPS/D-Gal誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷[9]。乳酸脫氫酶催化丙酮酸轉(zhuǎn)換為乳酸，是糖酵解最后一步反應(yīng)的關(guān)鍵酶[10]，本研究探討了乳酸脫氫酶抑制劑在急性肝損傷中的潛在保護(hù)效應(yīng)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)BALB/c雄鼠，6～8周齡,(20±2) g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境為相對(duì)濕度50%±5%,室溫(22～25) ℃，12 h 光照/ 黑夜循環(huán)。

1.2 試劑脂多糖、D-半乳糖胺(美國(guó)Sigma公司)，NHI-2(美國(guó)Cayman公司)，丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶測(cè)試盒、冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶測(cè)試盒、丙二醛測(cè)定試劑盒、乳酸檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)，caspase-3、caspase-8、caspase-9比色測(cè)定試劑盒(江蘇碧云天生物工程研究所)，BCA蛋白試劑盒(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)，TNF-α檢測(cè)試劑盒(欣博盛生物科技有限公司)，原位細(xì)胞死亡檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Roche公司)。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組將104只小鼠隨機(jī)分為4組(每組26只)：1)溶劑對(duì)照組；2)NHI-2對(duì)照組：乳酸脫氫酶抑制劑NHI-2(30 mg·kg-1)腹腔注射；3)LPS/D-Gal組：腹腔注射LPS(10 μg·kg-1)及D-Gal(700 mg·kg-1)誘導(dǎo)急性肝損傷；4)LPS/D-Gal+NHI-2組：NHI-2( 30 mg·kg-1)在LPS/D-Gal處理前30 min經(jīng)腹腔注入。為探討乳酸脫氫酶抑制劑NHI-2對(duì)LPS/D-Gal誘導(dǎo)的TNF-α產(chǎn)生的影響，32只小鼠(每組8只)在LPS/D-Gal處理后1.5 h處死，收集血清用于檢測(cè)TNF-α水平；為探討乳酸脫氫酶抑制劑NHI-2對(duì)LPS/D-Gal誘導(dǎo)的肝損傷的影響，32只小鼠(每組8只)在LPS/D-Gal處理后6 h處死，收集血清和肝組織樣本用于相關(guān)檢測(cè)；為探討乳酸脫氫酶抑制劑NHI-2對(duì)LPS/D-Gal處理小鼠生存率的影響，40只小鼠(每組10只)在經(jīng)上述處理后，每6 h觀察一次各組小鼠死亡情況并繪制生存曲線(xiàn)。

2.2 血清轉(zhuǎn)氨酶檢測(cè)各組小鼠在LPS/D-Gal處理6 h后處死并采集血清樣本，靜置15 min后離心取上清。使用轉(zhuǎn)氨酶比色法檢測(cè)試劑盒，將所得血清作為待測(cè)樣本進(jìn)行檢測(cè)。按試劑盒步驟加樣孵育后，使用酶標(biāo)儀測(cè)得各樣本OD值并帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算實(shí)際血清轉(zhuǎn)氨酶水平。

2.3 血清乳酸檢測(cè)各組小鼠在LPS/D-Gal處理6 h后處死并采集血清樣本，使用血清乳酸比色法檢測(cè)試劑盒，按試劑盒步驟加樣并使用酶標(biāo)儀檢測(cè)各血清樣本OD值，最終帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算得到實(shí)際血清乳酸含量。

2.4 血清炎癥因子檢測(cè)各組小鼠在LPS/D-Gal處理1.5 h后處死并采集血清樣本，使用小鼠TNE-α ELISA試劑盒，按試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟加樣孵育，并使用酶標(biāo)儀檢測(cè)各血清樣本OD值，并帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中計(jì)算得出血清中TNF-α含量實(shí)際值。

2.5 石蠟切片及HE染色肝組織置于4%多聚甲醛中固定24 h。固定后自來(lái)水流動(dòng)沖洗2 h，再進(jìn)行脫水，透明，浸蠟，包埋制成石蠟切塊。將石蠟切塊進(jìn)行切片，制成石蠟切片(4 μm)，脫蠟復(fù)水后，依次進(jìn)行蘇木精及伊紅染色。鏡下確定染色成功后，脫水，透明，封片，并于顯微鏡下拍攝觀察。參照文獻(xiàn)方法[11]，采用Suzuki評(píng)分對(duì)肝組織結(jié)構(gòu)損傷程度進(jìn)行半定量評(píng)估。(Tab 1)

Tab 1 Suzuki score

2.6 TUNEL染色石蠟切片經(jīng)脫蠟復(fù)水后，依次進(jìn)行TUNEL及蘇木精染色，脫水透明封片后，在高倍鏡下拍攝并觀察，胞核呈現(xiàn)棕褐色的為T(mén)UNEL陽(yáng)性凋亡細(xì)胞。

2.7 肝組織Caspase活性檢測(cè)采用caspase活性試劑盒中的裂解液制備10%的肝組織勻漿，將新鮮的肝組織勻漿乙酰輔酶用于caspase-3/8/9檢測(cè)。使用caspase-3/8/9活性試劑盒，按試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟加樣及孵育，并用酶標(biāo)儀檢測(cè)各樣本OD值，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算后得到勻漿樣本中caspase-3/8/9活性。再將剩余組織勻漿進(jìn)行蛋白濃度檢測(cè)，最終計(jì)算得到各個(gè)肝組織樣本中caspase-3/8/9活性。

2.7 肝組織丙二醛檢測(cè)用生理鹽水進(jìn)行10%肝組織勻漿制備。將所得生理鹽水肝組織勻漿作為待測(cè)樣本，按MDA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟加樣孵育，并用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值后計(jì)算出勻漿丙二醛含量。同時(shí)使用BCA蛋白試劑盒，檢測(cè)勻漿蛋白濃度，最終計(jì)算出各樣本肝組織MDA濃度。

3 結(jié)果

3.1 乳酸脫氫酶抑制劑降低血清乳酸含量如Fig 1所示，乳酸脫氫酶抑制NHI-2單獨(dú)處理對(duì)正常小鼠血清乳酸水平無(wú)明顯影響(P>0.05)；但LPS/D-Gal+NHI-2組小鼠血清乳酸水平明顯低于LPS/D-Gal組(P<0.05)。

Fig 1 Effect of lactate dehydrogenase inhibitor on serum lactate level in LPS/D-Gal-insulted n=8)

3.2 乳酸脫氫酶抑制劑減輕LPS/D-Gal誘導(dǎo)的急性肝損傷乳酸脫氫酶抑制NHI-2單獨(dú)處理對(duì)小鼠血清ALT及AST水平均無(wú)明顯影響(P>0.05)；但NHI-2干預(yù)可明顯降低LPS/D-Gal處理小鼠血清中的ALT和AST水平(P<0.05)(Fig 2)。與此一致，NHI-2干預(yù)可明顯減輕LPS/D-Gal誘導(dǎo)的肝組織淤血、肝小葉結(jié)構(gòu)破壞及肝細(xì)胞變性壞死等組織形態(tài)學(xué)異常改變，LPS/D-Gal+NHI-2組肝組織損傷評(píng)分明顯低于LPS/D-Gal組(P<0.01)(Fig 3)。這些結(jié)果說(shuō)明，NHI-2在LPS/D-Gal誘導(dǎo)的急性肝損傷中發(fā)揮了保護(hù)效應(yīng)。

Fig 2 Effect of lactate dehydrogenase inhibitor on serum ALT and AST level in LPS/D-Gal-insulted n=8)

3.3 乳酸脫氫酶抑制劑提升實(shí)驗(yàn)動(dòng)物存活率如Fig 4所示，LPS/D-Gal組小鼠死亡率達(dá)到80%，而采用乳酸脫氫酶抑制劑NHI-2干預(yù)后，模型小鼠死亡率僅為10%，兩組間小鼠生存率差異有顯著性(P<0 .01)。進(jìn)一步說(shuō)明，NHI-2明顯減輕了LPS/D-Gal誘導(dǎo)的急性肝損傷。

3.4 乳酸脫氫酶抑制劑減輕LPS/D-Gal誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡大量肝細(xì)胞凋亡是LPS/D-Gal誘導(dǎo)急性肝損傷的重要特征[12]。如Fig 5所示，乳酸脫氫酶抑制劑NHI-2干預(yù)也可明顯抑制LPS/D-Gal誘導(dǎo)的肝組織內(nèi)caspase-3(P<0.01)、caspase-8(P<0.05)和 caspase-9(P<0.01)的活化。TUNEL染色分析也發(fā)現(xiàn)，LPS/D-Gal+NHI-2組肝組織內(nèi)TUNEL陽(yáng)性凋亡細(xì)胞數(shù)明顯少于LPS/D-Gal組(P<0.01)(Fig 6)。這些結(jié)果說(shuō)明，NHI-2抑制了LPS/D-Gal誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡。

3.5 乳酸脫氫酶抑制劑未減輕LPS/D-Gal誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)檢測(cè)各組小鼠血清中TNF-α的水平，結(jié)果顯示，乳酸脫氫酶抑制劑NHI-2干預(yù)對(duì)正常小鼠及模型小鼠血清TNF-α水平均無(wú)明顯影響(P>0.05)(Fig 7)。

Fig 3 Results of liver sections stained with H&E and Suzuki n=8)

3.6 乳酸脫氫酶抑制劑減輕LPS/D-Gal誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA是反應(yīng)組織氧化應(yīng)激的常用指標(biāo)[14]。在本研究中，乳酸脫氫酶抑制劑NHI-2干預(yù)后，模型小鼠肝組織中MDA水平明顯下降(P<0.05)。(Fig 8)

4 討論

增強(qiáng)的糖酵解是炎癥、腫瘤等多種病理過(guò)程的關(guān)鍵代謝基礎(chǔ)和藥物干預(yù)新靶點(diǎn)[6]。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)，乳酸脫氫酶抑制劑干預(yù)可明顯降低血中轉(zhuǎn)氨酶水平、減輕肝組織病理學(xué)異常并提升實(shí)驗(yàn)小鼠存活率。這些結(jié)果提示：乳酸脫氫酶可能在LPS/D-Gal誘導(dǎo)的急性肝損傷中發(fā)揮了重要的作用。

Fig 5 Effect of lactate dehydrogenase inhibitor on caspase-3/8/9 level of liver tissues in LPS/D-Gal-insulted n=8)

Fig 6 Results of liver sections stained with TUNEL and count of TUNEL-positive n=8)

Fig 7 Effect of lactate dehydrogenase inhibitor on level of serum TNF-alpha in LPS/D-Gal-insulted n=8)

Fig 8 Effect of lactate dehydrogenase inhibitor on MDA level of liver tissue in LPS/D-Gal-insulted n=8)

Fig 9 Reaction formula of lactate dehydrogenase catalyzing production of hydrogen peroxide

大量肝細(xì)胞凋亡是LPS/D-Gal誘導(dǎo)的急性肝損傷的重要特征[12]。肝細(xì)胞凋亡依賴(lài)于caspase酶的級(jí)聯(lián)激活[13]。本研究中，乳酸脫氫酶抑制劑可明顯降低LPS/D-Gal暴露小鼠肝組織內(nèi)caspase-8、caspase-9和caspase-3的活性。與此相一致，乳酸脫氫酶抑制劑干預(yù)也減少了LPS/D-Gal暴露小鼠肝組織內(nèi)TUNEL陽(yáng)性凋亡細(xì)胞數(shù)目，提示乳酸脫氫酶抑制劑可減輕LPS/D-Gal誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡，證實(shí)了乳酸脫氫酶抑制劑在急性肝損傷中的保護(hù)效應(yīng)。

LPS/D-Gal誘導(dǎo)的促炎因子TNF-α是引起肝細(xì)胞凋亡的主要損傷因子，可與肝細(xì)胞膜上的I型TNF-α受體結(jié)合后啟動(dòng)死亡受體介導(dǎo)的凋亡途徑[13]。前期研究發(fā)現(xiàn)，2-脫氧葡萄糖抑制糖酵解可明顯下調(diào)LPS/D-Gal誘導(dǎo)的TNF-α產(chǎn)生[9]。然而，本研究中，乳酸脫氫酶抑制劑干預(yù)對(duì)LPS/D-Gal暴露小鼠TNF-α水平并無(wú)明顯影響，說(shuō)明糖酵解的不同反應(yīng)環(huán)節(jié)在炎癥反應(yīng)中的作用可能并不相同。

氧化應(yīng)激是LPS/D-Gal誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷的重要機(jī)制。有研究發(fā)現(xiàn)[15]采用抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸干預(yù)可抑制肝細(xì)胞凋亡、減輕肝組織損傷。前期發(fā)現(xiàn)，NADPH氧化酶抑制劑干預(yù)可減輕LPS/D-Gal暴露小鼠肝內(nèi)氧化應(yīng)激水平和肝組織損傷程度。本研究中，乳酸脫氫酶抑制劑干預(yù)也降低了肝組織中MDA的水平，說(shuō)明乳酸脫氫酶可能參與急性肝損傷中的氧化應(yīng)激。

有研究表明，乳酸脫氫酶可調(diào)控軟骨細(xì)胞中活性氧的生成[16]。也有研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，乳酸脫氫酶可在超氧陰離子的激發(fā)下，以NADH為電子受體，催化產(chǎn)生額外的過(guò)氧化氫。這一反應(yīng)可循環(huán)進(jìn)行，大幅增加細(xì)胞內(nèi)自由基的水平、增強(qiáng)氧化應(yīng)激[17]。與我們的結(jié)果相一致，敲低乳酸脫氫酶表達(dá)或抑制乳酸脫氫酶活性可降低Hela細(xì)胞中活性氧的水平。由此可見(jiàn)，乳酸脫氫酶抑制劑可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的氧化-抗氧化平衡而在急性肝損傷中發(fā)揮保護(hù)效應(yīng)。

綜上所述，乳酸脫氫酶可能是急性肝損傷中的一個(gè)新的重要致病因子，其機(jī)制可能與乳酸脫氫酶增強(qiáng)肝組織內(nèi)氧化應(yīng)激有關(guān)。