基于 Ca2+-CaMKII 信號通路的濟川煎治療陽虛便秘的作用及分子機制

劉 聰，張 悅，張潤濤，荊 然，郭丁丁，倪 艷，康 永

(山西省中醫藥研究院中藥方劑研究所，山西 太原 030045)

陽虛便秘(Yang deficiency constipation)屬中醫便秘癥范疇，相當于現代醫學的結腸慢傳輸型便秘(slow transit constipation，STC)，為功能型便秘的主要分型之一。多數是由于結腸傳輸能力減弱、腸神經系統功能紊亂所誘發，主要表現以便次減少、腹脹、排出困難、便意缺乏、大便干燥、久蹲難下為特征的頑固型排便障礙[1]，同時伴有不同程度的情緒低落、易激惹、失眠、焦慮等抑郁癥狀。隨著病程的遷延不愈會繼發器質性病變，也是結腸癌、直腸癌、大腸癌的重要危險因素之一。近年來，隨著人們生活節律及飲食結構的改變，我國陽虛便秘的發病率逐年攀升且呈年輕化趨勢[2]。研究證實，鈣調蛋白依賴性激酶Ⅱ (calmodulin-dependent protein kinases Ⅱ，CaMKⅡ)調節胃腸平滑肌收縮的作用是由鈣離子(Ca2+)誘發，胃腸神經釋放遞質促進Ca2+與鈣調蛋白(calmodulin，CaM)結合形成 Ca2+- CaM 復合物與 CaMKⅡ 調節區結合使其構象改變，致使 CaMKⅡ 失活，導致不規則慢波誘發的動作電位，使胃腸道平滑肌產生不規則收縮運動，結腸運動遲緩[3]。

濟川煎為治療陽虛便秘的代表方劑之一，出自明代醫家張景岳的《景岳全書》，具有溫腎益精、潤腸通便功能，主要治療由腎陽虛弱、精津不足所致的大便秘結、畏寒怕冷、精神不振等癥，為著名的“寓通于補之劑”，療效確切；并于2018年收入國家中醫藥管理局會同國家藥品監督管理局共同制定的《古代經典名方目錄(第一批)》(63#)。濟川煎課題組前期研究證明，濟川煎具有一定的雄性激素樣作用，可糾正模型動物的腎陽虛狀態及明顯的促排便作用，均與機體激素分泌、環核苷酸系統紊亂存在密切關系[4-5]。本研究通過建立陽虛便秘大鼠模型，結合相關蛋白差異表達，分析濟川煎調控Ca2+- CaMKII 信號途徑達到治療陽虛便秘作用及分子機制，從而為濟川煎臨床治療陽虛便秘提供新靶點、新途徑及可靠的科學理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物健康SD大鼠，SPF級，120只，♀♂各半，體質量(200±20) g，購自斯貝福(北京)生物技術有限公司，SCXK(京)2016-0002，批號：1103241911021763。動物飼養環境為SPF級，室溫維持在(20～25) ℃，相對濕度40%～45%，晝夜明暗交替時間12/12 h。實驗動物用常規顆粒飼料喂養；實驗動物用水為純凈水；實驗動物墊料為木質刨花墊料；飼養籠和飼養墊料每周更換1次，期間對飼養籠采取清洗滅菌處理。

1.2 藥物與試劑濟川煎(JCJ，肉蓯蓉 9 g、當歸 9 g、牛膝 6 g、枳殼 3 g、澤瀉 4.5 g、升麻 3 g)，藥物飲片購自于山西省中醫院中藥房，生藥水溶液最終濃度為1.725 kg·L-1，分裝，-20 ℃保存備用。枸櫞酸莫沙必利片(魯南貝特制藥有限公司，批號：215130511，規格 5 mg × 24 片)；復方地芬諾酯片(仁和堂藥業有限公司，批號：190202，規格：100 片/瓶)；白醋(總酸度為 6 g / 100 mL，上海寶鼎釀造有限公司生產，批號：20191203)；活性炭粉末(河南省淼源水處理材料有限公司生產，批號：20190405)；RNA提取試劑盒(QIAGEN/Gmb，Lot：163048069)；Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit(Roche，Lot：43112721)；QuantiNova SYBR Green PCR Kit(500)(QIAGEN/Gmb，Lot：163039888)；增強型RIPA裂解液(武漢博士德生物工程有限公司，Lot：15G23C02)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司，Lot：15F08A46)；飛克特超敏ECL發光液(Meilunbio，Lot：MAO186-Dec-31E)；鼠單抗β-actin(武漢博士德生物工程有限公司，BM0627)、兔多單抗CaMKⅡβ(Abcam，ab34703)、鼠單抗CaMKⅡγ(Abcam，ab201966)、鼠單抗CaMKⅡδ(Abcam，ab181052)、鼠單抗CaMKⅡ(Abcam，ab22609)、HRP標記羊抗鼠二抗(武漢博士德生物工程有限公司，BA1051)；Rat cAMP ELISA Kit(Bioswamp，Exp：202102)；Rat cGMP ELISA Kit(Bioswamp，Exp：202102)。

1.3 儀器Cytation-5多模式微孔板檢測儀(美國BioTek)；Navios 10 COLORS/3 LASER流式細胞儀(美國貝克曼)；PM.10AD光學顯微鏡(日本Olympus)；T25數顯高速勻漿機(德國IKA)；WT-L6K 迷你離心機(湖南湘儀實驗儀器開發有限公司)；Veriti-96 PCR(美國ABI)；7500 Real-Time PCR System(美國ABI)；Allegra X-30R centrifuge(美國ABI)；HD2高能成像分析儀(美國阿爾法)；Mini-sub Cell電泳系統(美國BIO-RAD)；Mini-sub Cell水平電泳槽(美國BIO-RAD)；凝膠成像儀 (日本Fuji)；全能型蛋白快速轉膜儀(美國BIO-RAD)。

2 方法

2.1 模型制備健康SD大鼠120只，♀♂各半。取100只大鼠，按每只首劑量5 mL給予4 ℃白醋(總酸6%)灌胃，從第二次開始按 15 mL·kg-1體質量給予4 ℃白醋，兩次間隔1 d，共9次。在每次給予白醋后d 2，按25 mL·kg-1體質量灌胃給予每只大鼠 16.67 mol·L-1的0 ℃活性炭冰水(活性炭300目)，亦9次；于造模開始d 14，每只大鼠在灌胃結束3 h后加灌復方地芬諾酯(20 mg·kg-1)，連續5 d[6-7]。同時滿足兩條判定標準視為模型成功：①根據造模大鼠一般評分標準，大于2～3分；②首粒黑便排出時間大于空白組均數。

2.2 分組及給藥濟川煎一日臨床推薦口服生藥量為34.5 g，按人60 kg體質量計算，34.5 g/60 kg=0.575 g·kg-1，則大鼠等效劑量(中劑量)為：0.575 g·kg-1×7.5倍=4.31(生藥)g·kg-1，得到高劑量8.62(生藥)g·kg-1，低劑量為2.16(生藥)g·kg-1。將模型成功大鼠隨機分為5組，即模型對照組、莫沙必利組(1.88 mg·kg-1)、濟川煎高(8.26 g·kg-1)、中(4.31 g·kg-1)、低(2.16 g·kg-1)劑量組，每組10只，灌胃給藥每日1 次，連續7 d；另取10只健康大鼠為空白組?？瞻捉M和模型組給予等體積的生理鹽水。末次給藥結束，室溫制備血清，-20 ℃保存備用并摘取結腸組織制備結腸平滑肌單細胞懸液。

2.3 一般狀態觀察實驗開始后觀察各組動物形體、皮膚毛發、行為狀態、情緒反應、大便數量、性狀等變化，并按表(Tab 1)評分每天記錄每只實驗動物的一般狀態及末次體質量。

Tab 1 Score sheets by performance status of rats

2.4 排便功能測定末次給藥結束，禁食不禁水12 h，稱質量，定量給予各組大鼠16.67 mol·L-1的0 ℃活性炭冰水灌胃，立刻將實驗動物逐只置于代謝籠內進行觀察，記錄首粒排黑便時間及6 h內排黑便粒數。

2.5 大鼠結腸平滑肌鈣離子(Ca2+)濃度測定把經過分離處理的結腸平滑肌細胞置入負載液內(由0.2 g·L-1Pluronic F-127與8.5μmol·L-1的 Fluo-3AM 混制而成)，在37 ℃條件下，置于細胞培養箱(95% O2，5% CO2)內孵育1 h后在1 000 r·min-1條件下進行5 min的離心處理，棄上清。選擇無染料的PBS對細胞進行沖洗，離心棄上清，洗2次。在37 ℃條件下，把經過負載處理的細胞置于細胞培養箱內孵育0.5 h，然后選擇流式細胞儀作檢測處理：發射光、激光波長分別為528 nm、488 nm，采用Cell Quest 軟件進行數據采集、分析。

2.6 RT-PCR法檢測各組大鼠結腸組織中CaM、CaMKII亞型收集細胞，離心2 000g,5 min，去上清液，標記細胞樣本放置-20 ℃備用。按照RNA提取試劑盒說明書配置工作液并標記日期，樣本常溫融化后用200 μL PBS重懸，加入400 μL Lysis Binding Buffer，渦旋15 s后將樣本轉移至組合套管內，離心10 000r，棄廢液，每個樣本加入100 μL混合液(DNaseI incubation 90 μL+DNaseI 10 μL)，常溫孵育15 min 后加入500 μL wash Buffer I，離心棄液，加入500 μL wash Buffer Ⅱ，離心棄液，加入200 μL wash Buffer Π，離心3 min，17 000r，棄液，將內管轉至去蓋的1.5 mL離心管中，打開內管的蓋子3～5 min后加入60 μL Elution Buffer，常溫孵育5 min，離心2 min，后收集內管的總RNA，置于-80 ℃保存。按照反轉錄試劑盒，常溫融化試劑和樣本，配置工作液按照說明書加入液體，在Veriti 96 PCR儀器進行反轉錄，得到的cDNA 置于-20 ℃保存。用PCR-water 按照說明稀釋目標引物至10 μmol·L-1，按熒光定量PCR檢測試劑盒說明書加入試劑，擴增，共40個循環(95 ℃，10 s 和59.5 ℃，34 s)，引物序列見Tab 2。

Tab 2 Primer sequence of target gene

2.7 Western blot檢測各組大鼠結腸組織中 CaM、CaMKⅡ 亞型按照比例將蛋白酶抑制劑和細胞裂解液加入裝有結腸平滑肌細胞的 EP 管中，4 ℃，12 000 轉 離心15 min，取上清，即得總蛋白。采用BCA法進行蛋白濃度測定。調整各組蛋白為統一濃度，用 4×SDS緩沖液稀釋(按照3 ∶1比例)取出的上樣量后，100 ℃煮沸10 min，將電泳緩沖液加入電泳槽內，然后緩慢加入樣品，參照蛋白Maker位置，當目的條帶到達最佳凝膠分離區時，停止電泳，立刻轉印至PVDF膜，轉膜結束后將膜置入5%脫脂奶粉的封閉溶液中封閉2 h。加入 CaM、CaMKII亞型的一抗中4 ℃搖床孵育過夜，次日取膜，洗膜脫3次，每次5 min。后將膜放入相應二抗中，室溫孵育1 h。之后再次TBST搖床洗脫每次5 min，3次。將配置好的發光液均勻加到PVDF膜上，暗室發光。利用ImageJ軟件進行灰度分析。

2.8 ELISA法檢測大鼠血清中 cAMP、cGMP含量-20 ℃取出大鼠血清，室溫溶解，按照 ELISA 試劑盒說明書進行預處理，每孔設置復孔，微孔板檢測儀450 nm進行測定。

3 結果

3.1 一般狀態觀察Tab 3結果顯示，造模期間，空白組皮毛光亮，活動自如、靈敏，體質量增長持續、穩定；實驗組大鼠造模開始后出現明顯腹脹、反應遲鈍、活動減少、倦怠蜷縮，隨著造模時間增長繼而出現攝食飲水量減少，排便減少，腹脹的表現，同時飼養籠墊料濕度明顯增大，評分明顯升高(P<0.01)；在造模d 14加灌復方地芬諾酯后，實驗組出現排便粒數驟減的狀況，大便干硬狀若米粒，體質量降低明顯(P<0.001)，提示模型成功。濟川煎的高、中劑量組給藥后狀態緩解(P<0.01)，體質量增長明顯(P<0.05)。

Tab 3 Effect of JCJ on performance status and

3.2 排便功能測定Tab 4結果顯示，模型組大鼠的首粒排便時間推遲，6 h內排便粒數明顯減少(P<0.01)；莫沙必利組及濟川煎各劑量組首粒排便時間明顯縮短，排便粒數明顯增加(P<0.05或P<0.01)。

Tab 4 Effect of JCJ on defecation function of rats n=10)

3.3 大鼠結腸平滑肌細胞的免疫熒光鑒定如Fig 1鑒定結果顯示，紅色熒光為α-SMA陽性，陽性率>90%，即：結腸平滑肌細胞純度>90%，提示可以進行后續實驗。

Fig 1 Cells from colonic smooth muscle of rats and identified by immunofluorescence staining

3.4 濟川煎對模型大鼠結腸平滑肌細胞Ca2+濃度的影響Tab 5結果顯示，模型組[Ca2+]i明顯升高(P<0.01)；經過不同劑量的濟川煎干預，結腸平滑細胞內[Ca2+]i明顯下降(Fig 2)，且呈劑量依賴性 (P<0.05或P<0.01)。

Tab 5 Effect of JCJ on intracellular Ca2+ concentration from colonic smooth muscle cells of rats

3.5 濟川煎對模型大鼠結腸平滑肌細胞內CaM、CaMKⅡ 亞型 mRNA 表達的影響Tab 6 結果顯示，模型組CaM及CaMKⅡ β、γ、δ亞型mRNA表達較空白組明顯升高(P<0.05或P<0.01)；濟川煎各劑量對模型大鼠進行干預治療后，CaM及CaMKⅡ β、γ、δ亞型mRNA都明顯降低(P<0.05或P<0.01)。

3.6 濟川煎對模型大鼠結腸平滑肌細胞CaM、CaMKⅡ亞型蛋白表達的影響Tab 7結果顯示，模型組CaM及CaMKⅡ β、γ、δ亞型蛋白表達較空白組明顯升高(P<0.01)；濟川煎各劑量組給藥后，CaM及CaMKⅡ β、γ、δ亞型蛋白表達均明顯降低(Fig 3)，尤以中、高劑量組明顯(P<0.05或P<0.01)。

Tab 6 The mRNA expression of CaM and CaMKⅡ subtypes analyzed by RT-PCR

Tab 7 The protein expression of CaM and CaMKⅡ subtypes analyzed by Western blot

Fig 2 Effect of JCJ on intracellular Ca2+ concentration from colonic smooth muscle cells of ratsA：Normal group；B：Model group；C：Mosapride citrate group ( 1.88 mg·kg-1)；D：JCJ low-does group ( 2.16 g·kg-1)；E：JCJ middle-does group( 4.31 g·kg-1)；F：JCJ high-does group( 8.26 g·kg-1).

Fig 3 Effect of JCJ on protein expression of CaM and CaMKⅡ subtypes in colonic smooth muscle cells of ratsA：Normal group；B：Model group；C：JCJ low-does group( 2.16 g·kg-1) ；D：JCJ middle-does group( 4.31 g·kg-1)；E：JCJ high-does group( 8.26 g·kg-1);F：Mosapride group( 1.88 mg·kg-1).

3.7 濟川煎對模型大鼠血清中cAMP、cGMP含量及其比值的影響Tab 8 結果表明，與空白組相比，模型組cAMP含量明顯下降，cGMP 含量明顯升高(P<0.01)；給藥后，濟川煎中、高劑量組可增加cAMP含量，減少cGMP的含量，cAMP/cGMP比值增加明顯(P<0.05或P<0.01)。

Tab 8 Effect of JCJ on content of cAMP，cGMP in serum of rats

4 討論

4.1 流行病學及病因病機陽虛便秘證以女性及老年人為主要高發人群，是由于腎臟受邪，虛而津液枯燥，致令腸胃干燥，傳導糟粕能力減弱，故大便難下。大量的基礎和臨床研究表明，導致陽虛便秘的危險因素主要包括：精神壓力、濫用藥物、運動量減少、胃腸傳輸功能減弱、腸神經遞質分泌合成受阻、腸道菌群功能紊亂等，其中胃腸傳輸功能減弱是引起該疾病的主要原因。所以，針對由于胃腸傳輸功能減弱引發的且癥狀輕微者進行藥物導瀉治療，長期使用會出現毒副作用，并對藥物產生明顯耐受；對癥狀嚴重的患者進行手術治療，但術后并發癥的產生或無明顯癥狀改善等情況時有發生，不僅嚴重影響患者的生活質量及精神狀態，還會加重患者家庭及社會負擔。因此，尋找新的治療陽虛便秘的靶向藥物至關重要，而中醫藥在治療陽虛便秘上顯示出獨特優勢。

4.2 陽虛便秘與陰陽“二元論”關系陽虛便秘主要是指腎陽虛便秘，與HPA軸、甲狀腺軸及性腺軸的紊亂密切相關[8]。本實驗采用白醋與0 ℃活性炭冰水聯合復方地芬諾酯片復制腎陽虛便秘大鼠模型。造模后，大鼠出現體質量下降、被毛疏松、精神倦怠、弓背蜷縮、肢涼尾冷、自主活動減少、排便驟減且質硬等明顯的“陽虛及便秘體征”。研究證明，環磷酸腺苷(cAMP)和環磷酸鳥苷(cGMP)參與細胞反應的調節，具有相互拮抗作用，CAMP和cGMP的相對平衡有益于維持機體的穩定生理狀態，據此提出生物控制二元論，即陰陽學說[9-10]。本實驗中，模型組cAMP明顯降低，cGMP明顯增加，且cAMP/cCMP比值明顯降低，表明大鼠機體環核苷酸系統失衡，腎上腺皮質系統受到抑制；給予濟川煎后，血清cAMP含量明顯升高，cGMP明顯降低，cAMP/cGMP比值明顯升高，表明濟川煎可以改善機體環核苷酸系統失衡狀態及腸道傳輸功能，增加排便量。

4.3 CaMKⅡ 與陽虛便秘密切相關CaMKⅡ是一種多功能、作用底物廣泛的絲氨酸/蘇氨酸磷酸化蛋白激酶，具有α、β、γ、δ 4個不同轉錄亞基，主要調節神經元活動、肌肉收縮、細胞周期控制等。研究發現，CaMKⅡ的4種亞基進行選擇性拼接可以形成同源多聚體和異源多聚體，且功能強大，由3個單元域組成，即高度保守的氨基端催化域、變化較多的中間連接域及羧基端結合域，其中羧基端結合域與4種亞基會形成六元環結構對CaMKⅡ感受Ca2+信號的振幅和頻率產生重要影響；中間連接域大小發生的變化影響CaMKⅡ對鈣信號的頻率敏感性；氨基端催化域呈放射結構對蛋白與CaMKⅡ的結合起到關鍵作用[8]。當胞內 Ca2+濃度升高形成Ca2+-CaM復合物，導致CaMKⅡ的β、γ、δ亞基發生快速磷酸化激活 CaMKⅡ 產生活性[9-10]；當Ca2+濃度下降或CaM從CaMKⅡ解離后，而發揮抑制功能[12]。本實驗中，采用FCM技術對濟川煎干預陽虛便秘模型大鼠的結腸平滑肌細胞中Ca2+濃度進行測定，發現模型組Ca2+濃度較空白組明顯升高，推測是由于 Ca2+- CaM 復合物增多，直接或間接激活CaMKⅡ產生活性，導致結腸平滑肌收縮障礙；給予濟川煎后，胞內Ca2+濃度下降明顯，表明濟川煎能夠有效降低結腸平滑肌胞內Ca2+增多現象，而莫沙必利組則對胞內Ca2+變化無明顯的調節作用。隨后，采用 RT-PCR及Western blot法對胞內CaM、CaMKⅡ亞型蛋白進行檢測，發現模型組 CaM、CaMKⅡ的β、γ、δ亞型確有在結腸平滑肌細胞中表達，且較空白組均明顯增多，在給予濟川煎后下降明顯，表明濟川煎對 CaM、CaMKⅡ的β、γ、δ亞型具有明確的直接或間接的調節作用；同樣，莫沙必利組對CaMKⅡ的β、γ、δ亞型較空白組無明顯的調節作用，推測莫沙必利促進胃腸蠕動與調節 CaMKⅡ無關。

本研究結果表明，濟川煎作用于陽虛便秘模型大鼠，可明顯緩解造模出現的明顯腹脹、反應遲鈍、活動減少、倦怠蜷縮及排便減少狀態，縮短排便時間，增加排便粒數；并明顯降低模型大鼠結腸平滑肌細胞內Ca2+濃度、CaM、CaMKⅡ β、γ、δ的表達；濟川煎還能明顯恢復機體環核苷酸系統紊亂狀態。提示，濟川煎可能是通過調控Ca2+-CaMKⅡ信號通路達到治療陽虛便秘的目的，或成為陽虛便秘潛在的臨床生物標志物，但其可行性尚需進一步研究證實。