ARMS-PCR技術在玫瑰果鑒別中的應用

邵婕，楊正修，鄒強，陸崢飛，李凡*

1. 康寶萊蕾碩（湖南）天然產物有限公司（長沙 410100）；2. 康寶萊全球測試中心HP1實驗室（托倫斯 90502）

玫瑰果（Rosa canina）在世界上有著悠久的藥食兩用歷史。玫瑰果中多酚、黃酮、維生素C等活性物質含量豐富，具有抗氧化、抗癌、抗輻射和抑菌等多種藥理作用[1]*。但玫瑰果原料品種繁多，薔薇屬果實的化學成分、抗氧化能力和個體酚類物質含量存在顯著差異[2]*。刺玫果（Rosa duvarica）和玫瑰果屬于同一植物屬，兩者不僅在外觀上非常相似，活性物質也非常相似，主要包括黃酮、多糖、三萜等[3]*。由于化學成分的相似性，常見的化學鑒定方法難以對二者進行區分，使得玫瑰果摻假特別是混合摻假的檢測具有挑戰性。擴增阻滯突變系統-聚合酶鏈式反應（amplification refractory mutation system-PCR，ARMSPCR）技術[4]*常用于遺傳疾病[5]*、基因分型[6]*和微生物學[7]*等許多快速檢測研究領域，在植物鑒定和分析化學中的應用鮮有報道。

試驗通過對玫瑰果和刺玫果基因組序列的比較分析，建立一種基于特征SNP位點的ARMS-PCR方法，可用于鑒定玫瑰果和刺玫果。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

化學標準品Isoquercetin（ChromaDex ASB-00009505-025）。

植物對照藥材（Botanical Reference Material，BRM）：玫瑰果果實BRM（Lot 00030792-473，ASB-00030792-005，ChromaDex. Inc）；刺玫果果實BRM（Lot 121255-201203，121255，購自National Institute of Food and Drug Control，NIFDC）。

植物材料：從中國原料市場采購11份玫瑰果用于驗證。

Automatic TLC Sampler 4（Chromacim，Moirans，法國）；硅膠板（60 F254，20×10 cm，Merck，德國）；CAMAG TLC可視化儀（Chromacim，Moirans，法國）；DNeasy mericon Food Kit；Qubit 3.0熒光計（Thermofisher，廣州，中國）；C1000 Touch（BIORAD，上海，中國）；Integrated DNA Technologies（Thermofisher，廣州，中國）；AmpliTaq GoldTM*360 Master Mix（Thermo Fisher，立陶宛）。

1.2 高效薄層色譜（high-performance thin layer chromatography，HPTLC）

樣品處理：稱取500 mg玫瑰果或刺玫果果實BRM到15 mL試管中，加入10 mL甲醇，渦旋30 s。超聲處理15 min。將一部分樣品通過0.45 μm濾膜過濾到HPLC進樣瓶中。

使用Automatic TLC Sampler 4將樣品噴涂到預制硅膠板上，Isoquercetin作為化學標準品噴涂到預制硅膠板上。用流動相（乙酸乙酯/乙酸/甲酸/超純水100/11/11/26）展開，使用10%硫酸進行顯色。用CAMAG TLC可視化儀和Vision cats軟件拍攝照片。

1.3 DNA提取

DNA提取過程均根據制造商的說明使用DNeasy mericon Food Kit進行。過程：將50～100 mg玫瑰果或刺玫果果實BRM，1 mL Food Lysis Buffer和2.5 μL Proteinase K加入離心管中，在60 ℃下孵育30 min，并以2 500×g離心5 min；取700 μL上清液于新的離心管中，加入500 μL氯仿，渦旋15 s，并將混合物以14 000×g離心15 min；將350 μL上清液轉移到新的離心管中，加入350 μL PB Buffer，將混合液轉移到吸附柱中，以17 000×g離心1 min；棄去收集管中溶液；向吸附柱中加入500 μL AW2 Buffer，并以17 000×g離心1 min；將收集管中的溶液再次倒出，并將吸附柱以17 000×g離心2 min；將吸附柱放入新的離心管中，加入100 μL TE緩沖液，并將其以17 900×g離心2 min；使用Qubit 3.0熒光計進行定量。

1.4 DNA Barcode序列采集及植物鑒定

使用2對引物對玫瑰果和刺玫果gDNA（genomic DNA）進行擴增，擴增體系包含10 μL AmpliTaq GoldTM*360 Master Mix、2 μL引物混合物（每種引物5 μmol/L）、5 μL gDNA和3 μL Free-Nuclease Water。在C1000 Touch上進行PCR擴增，反應條件為95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s（58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s）×35，72 ℃終末延伸3 min。RbcL-F：5’-TGTAAAACGACGGCCAGTATGTCACCACAAACAGAAAC-3’；RbcL-R：5’-CAGGAAACAGCTATGACCGTAAAA TCAAGKCCACCRCG-3’；ITS2-F：5’-TGTAAAACGACGGCCAGTATCCGATACTTGGTGTGAAT-3’；ITS2-R：5’-CAGGAAACAGCTATGACCGACGCTTCTCCAGACTACAAT-3’。獲得RbcL與ITS2基因片段，通過sanger測序獲取序列信息。引物由Integrated DNA Technologies（Thermofisher，廣州，中國）合成。

雙盲試驗：將11份玫瑰果市場樣品與14份刺玫果果實BRM由試驗人員1隨機編排順序并編號，通過DNA barcode技術對25個樣品進行鑒定。提取25個樣品gDNA后，通過RbcL和ITS2這2對引物對gDNA進行PCR擴增，擴增體系包含10 μL AmpliTaq GoldTM*360 Master Mix、2 μL引物混合物（每種引物5 μmol/L）、5 μL gDNA和3 μL Free-Nuclease Water。在C1000 Touch上進行PCR擴增，反應條件為95 ℃預變性5分鐘，95 ℃變性30 s（58 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸30 s）×35，72 ℃終末延伸3 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果后進行Sanger測序，確認樣品種屬信息。試驗人員2通過ARMS-PCR對25個樣品進行鑒別。

1.6 ARMS-PCR

使用AmpliTaq GoldTM*360 Master Mix對玫瑰果與刺玫果的gDNA進行擴增，擴增體系包含10 μL AmpliTaq GoldTM*360 Master Mix、2 μL引物混合物（每種引物5 μmol/L）、5 μL gDNA和3 μL Free-Nuclease Water。在C1000 Touch上進行PCR擴增，反應條件為95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s（58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s）×35，72 ℃終末延伸3 min。原始DNA洗脫用于PCR反應，無需調整濃度。每次運行都包括陽性對照和陰性對照，PCR產品在帶有DNA染料的2%瓊脂糖凝膠中可視化。各基因及其引物的擴增引物序列詳見表1。引物由Integrated DNA Technologies合成。

表1 ARMS-PCR引物信息表

1.7 生物信息學分析

從NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載所有序列，從NCBI下載的所有序列在MEGA X中使用ClustalW默認設置進行比對，引物設計使用Primer 3.0 plus（https://www.primer3plus.com/）。DNA條形碼序列使用CodonCode Aligner和APE軟件進行分析。Sanger測序結果在NCBI上進行比對。

1.8 統計學分析

雙盲試驗所獲得的試驗數據通過POI（probability of identification）進行分析[8]*。

2 結果與分析

2.1 HPTLC鑒別玫瑰果和刺玫果

通過HPTLC方法檢測玫瑰果和刺玫果，玫瑰果果實含有Isoquercetin[9]*，以Isoquercetin作為化學標準品，其位置和可見度如圖1所示。Rf值為0.59。玫瑰果和刺玫果HPTLC指紋圖譜非常相似，兩者之間的主要區別是檢測到的條帶的相對密度。因此，HPTLC難以區分玫瑰果和刺玫果。

圖1 玫瑰果和刺玫果HPTLC指紋圖譜

2.2 玫瑰果與刺玫果DNA barcode序列采集及引物設計

由于植物中ITS和rbcL區域的選擇壓力小、變異大，因此選擇該區域進行ARMS-PCR分析可更有效地區分遺傳關系密切的物種。通過DNA barcode方法獲取玫瑰果和刺玫果的ITS2和RbcL基因片段，Sanger測序得到序列信息（表2）。

表2 玫瑰果及刺玫果ITS2和RbcL序列信息

為驗證ARMS-PCR區分玫瑰果和刺玫果的可行性，根據3個不同的SNP位點分別設計P1、P2和P3這3種方案。P1方案的設計基于RbcL區域序列，而P2和P3方案的設計基于ITS2區域序列（圖2）。

圖2 候選ARMS-PCR引物在RbcL（P1）和ITS2區域（P2和P3）中的位置

以P2方案為例，分析ARMS-PCR的工作原理（圖3）。基于SNP位置設計4條引物（表1）Outer F，Outer R，Inner F和Inner R，為玫瑰果和刺玫果提供不同長度的PCR片段。Outer F和Outer R配對從基因組DNA中擴增出1個182 bp的片段作為內參，Inner F和Inner R分別作為玫瑰果和刺玫果的特異性引物。玫瑰果DNA存在時，Inner F與玫瑰果的DNA模板之間形成完美匹配，Inner F與Outer R配對擴增出1段135 bp的片段。只有當Inner R與刺玫果的DNA模板之間形成完美匹配時，Inner R才能與Outer F配對擴增出1段86 bp片段。DNA模板中只存在玫瑰果DNA時，可以得到1條182 bp的內參條帶和1條135 bp的特異性條帶。DNA模板中只存在刺玫果DNA時，可以得到1條182 bp的內參條帶和1條86 bp的特異性條帶。當DNA模板中同時存在玫瑰果和刺玫果DNA時，可以得到1條182 bp的內參條帶，1條135 bp的特異性條帶和1條86 bp的特異性條帶。

圖3 ARMS-PCR的P2設計示意圖

接表2

2.3 ARMS-PCR條件優化

為從P1、P2和P3中篩選最佳的試驗方案，使用玫瑰果和刺玫果果實BRM，通過DNA提取和PCR擴增，2%瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，P1方案針對玫瑰果和刺玫果進行擴增，其擴增產物一致，均為1條100 bp左右的條帶，P3方案針對玫瑰果和刺玫果均得到兩條200 bp左右的條帶，P1和P3方案均無法區分玫瑰果和刺玫果。P2方案針對玫瑰果可得到1條182 bp的內參條帶和1條135 bp的特異性條帶，針對刺玫果可得到1條182 bp的內參條帶和1條86 bp的特異性條帶，可明顯區分玫瑰果和刺玫果。結果表明P2方案優于P1和P3方案，可以達到預期結果（圖4）。

圖4 3種設計的ARMS-PCR的驗證結果

由于設計的4條引物的退火溫度不同，設計梯度PCR試驗。從圖5（A）可以看出，最佳退火溫度為58℃。PCR的循環數決定擴增產物的產量，循環數太多會易出現非特異條帶。為避免非特異性條帶干擾，分別測試25 cycles和28 cycles的擴增效率，從圖5（B）可以看出，28 cycles和25 cycles均無非特異性條帶，但28 cycles電泳信號強度優于25 cycles，表明28 cycles優于25 cycles。

圖5 ARMS-PCR條件優化

2.4 ARMS-PCR驗證

為驗證ARMS-PCR玫瑰果鑒定的準確性，通過雙盲試驗測試玫瑰果市場樣品和刺玫果果實BRM，25個樣品經DNA barcode技術進行鑒定。ARMS-PCR結果表明（圖6），S-1，S-3，S-6，S-8，S-9，S-10，S-12，S-15，S-16，S-17，S-21，S-22，S-24，S-25這14個樣品被鑒定為刺玫果，S-2，S-4，S-5，S-7，S-11，S-13，S-14，S-18，S-19，S-20，S-23這11個樣品被鑒定為玫瑰果。該結果與DNA barcode方法結果完全一致。基于POI統計分析，該測定對于鑒別玫瑰果和刺玫果果實原材料具有大于0.9（95%CI）的識別概率。

圖6 ARMS-PCR驗證市場25批樣品

2.5 玫瑰果中刺玫果的最低檢測限確認

為進一步探索ARMS-PCR的檢出限，將玫瑰果和刺玫果BRM粉末按質量比10/90，20/80，30/70，40/60，50/50，60/40，70/30，80/20和90/10進行混合。從這些混合材料中提取DNA用于擴增。結果顯示（圖7A），100%玫瑰果電泳結果僅有1條182 bp的內參條帶和1條135 bp的特異性條帶，添加10%～90%刺玫果后，電泳結果顯示多1條86 bp的刺玫果特異性條帶，且隨著刺玫果添加量的升高，135 bp的玫瑰果特異性條帶強度降低。為確認刺玫果的最低檢測限，對10%的刺玫果進行重復驗證，結果如圖7（B）所示。結果顯示，10次重復結果一致，均可檢出86 bp的刺玫果特異性條帶。綜上所述，該方法對玫瑰果中刺玫果的最低檢測限為10%。

圖7 ARMS-PCR最低檢測限測定

3 結論與討論

建立一種基于特征SNP位點的ARMS-PCR方法，并應用于玫瑰果及其近緣種刺玫果的鑒定。該方法對玫瑰果和刺玫果的最低檢測限為10%。試驗方法客觀、分辨率高。與DNA Barcode方法相比，檢測周期短，無需測序，結果以圖位差異的形式呈現，易于進行判斷。

為確保目標序列的擴增和鑒定，高質量DNA的獲取極為重要。植物材料中蛋白質、脂肪、多糖、多酚等物質含量較高，這些物質可能抑制PCR擴增。因此，在DNA提取過程中盡可能地去除這些物質非常重要。此外，植物的加工過程也會影響DNA的最終產量、純度以及完整性。

基于DNA技術的植物鑒定方法通常只能得到種屬、基因型等信息，而無法獲得植物中活性物質的鑒定及定量信息。這些信息通常需要化學方法提供，如LC、LC-MS、GC-MS、NMR。在組學時代，基因組學、蛋白質組學和代謝組學相輔相成，從而能夠對各種復雜的植物原料進行全面鑒定。