雙水相分離技術應用于蛋白質純化的研究進展

趙悅彤，尤一，馬小來，段小群*

桂林醫學院藥學院（桂林 541000）

雙水相分離技術，是利用聚合物之間或聚合物與鹽之間的不相容性造成的兩水相間物質分配系數差異，而實現的分離技術。因其操作簡單、價格低廉、無污染、易放大等優勢，已被廣泛被應用于各種生物物質分離應用中。不同雙水相體系組成可以分離許多不同物質，因材料科學和液體處理等方面的最新研究進展，可以給研究人員提供更多思路。基于此，對雙水相體系的歷史和成相原理及在蛋白純化工藝中的應用進行概述。

1 介紹

當2種不相容的聚合物、1種聚合物和1種鹽在水基溶劑中超過閾值濃度導致液-液分離時，形成雙水相系統（ATPS），這一現象早在1896年就由荷蘭微生物學家馬提努斯·拜耶林克發現。20世紀50年代，人們開始利用ATPS分離生物物質，因各種物質在ATPS各區域（上相、下相、界面）的分配存在不同優先性，可利用這一原則分離蛋白質、病毒、細胞和細胞碎片[2]*。

雙水相的優勢在于蛋白在雙水相體系中不會失活或變性，因為其水分占大比例且分離過程溫和，尤其適合用于熱敏蛋白。同時做到分離、純化兩步驟一步完成。設備要求低，操作簡單易于放大，可實現工業連續自動操作。但雙水相分離效率不高且易乳化。相組成中的鹽類如硫酸銨含量過高會導致蛋白析出，影響后續分離。分離后的蛋白質溶液含有高分子聚合物和鹽類，需將其去除。

2 雙水相分離技術應用

ATPS被廣泛應用于分離科學領域，除了分離純化蛋白[3]*外，還可用于分離和回收抗體[4]*、病毒樣顆粒[5]*、抗生素[6]*、DNA[7]*、細胞、胞外小泡[8]*和激素[9]*。ATPS在微流體[10]*、細胞工程、生物打印和環境保護的應用方面使用率也逐漸增多。

2.1 傳統雙水相系統

傳統的液-液萃取技術通常不適用于酶的純化，因為有機物的存在會造成酶活性損失[11]*。超濾技術和硫酸銨沉淀技術用于蛋白質純化的效率比較低，而另一些蛋白純化技術則程序復雜而收率偏低[12]*，例如親和色譜、離子交換色譜、疏水色譜柱都是步驟繁瑣、成本昂貴和低收率的純化技術。而ATPS技術用于蛋白質純化則廉價而易操作[13]*，也不會導致蛋白質失活。

Ramakrishnan等[14]*采用傳統的聚合物-鹽（PEG/磷酸鹽）ATPS從乳酸細菌屎腸球菌中提取細胞內脂肪酶，結合超濾后活性回收率為82.09%，純化系數為5.99%。王瑩等[15]*采用PEG4000/硫酸銨雙水相體系分離萃取香菇柄水提液中的多糖與蛋白質，結果顯示，在最佳提取條件下，蛋白質萃取率達81.57%。另外Saravana等[16]*使用單步聚乙二醇/檸檬酸三鈉兩相系統中從南美白乳桿菌廢物中提取和純化增殖蛋白。在最佳條件下，最大分配系數和蛋白質收率分別為2.79%和92.37%。

2.2 親和雙水相系統

親和雙水相是在雙水相中引入親和配基利用親和配基與目標產物之間的特異性親和作用，有效改善目標產物在雙水相中的選擇性分配，從而大幅提高分離過程的效率和分離產品純度的提取方法[17]*。

蔣志國等[18]*利用金屬螯合雙水相親和分配技術萃取木瓜蛋白酶。在PEG/PEG-IDA-Cu2+*/Na2SO4雙水相體系中，最優條件下木瓜蛋白酶的酶活性回收率可達90%左右，蛋白分配比達5.11。Liu等[19]*構建一種由混合膠束組成的新型親和力ATPMS，結果表明基于親和力的HM-EO/TX-Cu（II）體系具有較高的分配性能，有望有效分離組氨酸標記的蛋白質。

2.3 離子液體雙水相系統

2002年Dupont等[20]*在合成離子液體1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽（[C4mim][BF4]）時發現KCl和（[C4mim][BF4]）之間存在鹽析效應，有學者對這種鹽析效應做了進一步研究，并提出“離子液體雙水相”這一新概念，由此開始離子液體雙水相體系的研究。離子液體雙水相是基于高聚物雙水相發展而來的一種高效溫和萃取分離體系，用親水性的離子液體（ILs）與無機鹽的水溶液進行混合，形成互不相溶的兩相。離子液體可以替代一些有毒揮發性有機化合物且陰陽離子之間的可調節性、良好的熱穩定和化學穩定性使得離子液體雙水相得到更多的應用[21-22]*。

施婭楠等[23]*采用[C4mim]Br/K2HPO4雙水相抽提技術從辣木葉蛋白中分離凝乳酶，最佳萃取條件下木葉凝乳酶的酶活性回收率達85.5%，純化因子達1.49。與已報道用的鹽析法相比分離效果好且步驟簡單，降低酶活性損失。李夢瑤等[24]*基于[C4mim]Cl/K2HPO4雙水相體系，萃取分離番茄中5種抗氧化酶（CAT、POD、SOD、AAO、PPO）。建立的新方法比已報道的采用緩沖溶法提取的5種抗氧化酶活性高、穩定性好，且萃取時間由原來的30 min縮短至20 min。

2.4 雙水相逆流色譜

固體分離介質可能引起酶不可逆吸附、失活和變性等問題。雙水相體系逆流色譜技術結合逆流色譜的快速高效、制備量大及雙水相體系簡單溫和、無污染的特點避免這些問題的發生，因此在蛋白質的分離方面有很好的應用潛力[25]*。

Wade等[26]*使用高濃度磷酸鉀和聚乙二醇雙相水性兩相系統聯用逆流色譜（CCC）裝置，直接在ATPS中提取初始粗植物提取物并只在下相注入使之能高度選擇性地分配黑芥子酶復合體，然后在螺旋圓盤CCC上進行短層析。最佳結果和從其他植物蛋白中分離出的黑芥子酶相比純化倍數提高60倍。

2.5 雙水相與其他方法的聯用

雙水相又可以與其他方法聯用達到更好的純化效果和工作效率，如超聲輔助雙水相[27]*、超聲高效、節能常用于生物活性物質提取[28]*。超聲波有富集效應，可縮短有機相和水相的相分離時間，且隨超聲時間增加溫度升高可以提高物質溶解度。微波輔助雙水相法的優勢是微波可以穿透式加熱，利用熱效應促進蛋白溶出，縮短提取時間，有研究顯示使用微波輔助雙水相應用于提取酚類[29]*、多糖等，也能應用于蛋白的純化工作。超聲輔助離子液體雙水相法則利用了離子液體良好的溶解能力和穩定性高等優點。反萃取后的離子液體水溶液還可以作為提取溶劑循環使用，降低成本[30]*。

3 結語與展望

ATPS已實現簡單、經濟高效的目標。利用形成ATPS的聚合物的低界面張力、分配效應和高度的生物相容性等特性來達到分離目的。溫和易放大的優勢使更多人使用這種純化方法，不過影響成相的因素也有很多，如pH、溫度、聚合物或鹽濃度、目的蛋白特性等會給實驗探索造成困難。不過雙水相帶來的優勢遠超于其劣勢。雙水相還被用于金屬離子分離、環境修復、冶金應用等方面，希望日后雙水相的更多特性可以被探索，以便研究人員應用于新的領域。