CGRP/ASIC3參與大鼠食道擴張內臟痛模型中背根神經節神經元高敏感機制的研究

許草，顧勇，石亞婷，汪桂祥，牛小平

（1.皖南醫學院研究生院，安徽 蕪湖 241002；2.皖南醫學院弋磯山醫院兒科；3.皖南醫學院弋磯山醫院消化內科）

食管內臟高敏感在非糜爛性反流病發病機制中的作用日益受到重視，深入了解內臟高敏感的細胞與分子機制可為臨床治療提供重要的理論依據。脊髓背根神經節（DRG）神經元作為內臟痛覺信號傳導與調控的初級靶點，是目前內臟高敏感的研究熱點之一［1］。研究表明，當大鼠應激發生內臟高敏感反應時，其DRG 神經元興奮性顯著提高［2］。酸敏感離子通道3（ASIC3）在感受體液pH 值和調控痛覺方面有著重要作用［3］。Hattori等［4］研究發現，ASIC3 基因敲除小鼠肌肉痛和心臟痛傳入的DRG 神經元中，表達酸誘導電流的神經元大量減少。在小鼠急性關節炎疼痛模型中，ASIC3 僅在降鈣素基因相關肽（CGRP）表達陽性的DRG 神經元中表達，且ASIC3 的表達隨CGRP表達上調而上調［5］。然而，ASIC3 與CGRP在食管內臟痛中的具體作用尚不清楚。本研究將建立大鼠食管擴張（ED）內臟痛模型［6］，探討ASIC3 與CGRP參與大鼠ED 內臟痛模型中DRG 神經元興奮性改變的可能機制，并揭示CGRP是否通過調節ASIC3 表達與功能改變，參與大鼠ED 內臟痛模型中DRG神經元高敏感性的發生。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 健康雄性SD 大鼠50 只，6～8 周齡，體重220～250 g，上海杰思捷公司提供，實驗動物許可證號SYXK（滬）2008-0021。單籠飼養，在動物實驗室適應1周后開始實驗。將大鼠隨機分成2組，實驗組30只，對照組20只。

1.2 動物模型的建立和DRG 神經元分離培養 于SD 大鼠腹腔注射氯胺酮（75 mg/kg）與賽拉嗪（10 mg/kg）麻醉，于中上腹部沿腹中線逐層打開腹腔，切口為（2.5±0.5）cm，暴露胃，分離胃底和賁門周圍結締組織，將食道向腹腔牽拉，暴露食管下段，于食管壁多點注射5 μmol/L的1，1'-二十八烷基-3，3，3'，3'-四甲基吲哚羰基花青高氯酸鹽（DiI）乙醇溶液（7～8點，1 μl/點）。采用熒光逆行示蹤技術進行標記DRG 神經元，被標記的DRG 神經元為食道特異DRG 神經元。注射DiI 10 d 后，所有大鼠常規腹腔注射麻醉，利用PE-240 管對實驗組大鼠的胸段食管進行1 h 重復ED刺激，對照組則不予處理［7］。

1.3 DRG 神經元分離培養 ED 刺激結束后30 min，頸椎脫臼處死2 組大鼠，取出胸段脊髓兩側的DRG，經過洗滌、消化、離心等步驟，逐步分離DRG 細胞［7］。其中隨機選取15份實驗組樣本加入CGRP8-37（10 mol/L，美國Sigma 公司）。根據培養液中有無加入CGRP8-37將實驗組進一步分為ED組（n=15）和ED+CGRP8-37組（n=15）。

1.4 全細胞膜片鉗技術記錄DRG 神經元動作電位頻率及形態的改變 DiI 標記的DRG 神經元在熒光顯微鏡下呈橘紅色，對DiI 標記的電容＜40 pF的神經元的動作電位頻率及形態改變進行記錄［7］。

1.5 免疫熒光檢測技術記錄DRG 神經元中CGRP與ASIC3 的表達定位 對ED 組及對照組DRG 細胞進行固定和透化、封閉、抗體孵育，最后用顯微鏡（德國Leica公司）采集圖片，核染色采用4'，6二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）［7］。

1.6 逆轉錄實時聚合酶鏈反應（qRT-PCR）法檢測CGRP與ASIC3 mRNA 表達 所有采集的標本均在24 h 內進行檢測，檢測前將標本置于微量振蕩器上震蕩1 min，充分混勻后，按照CGRP、ASIC3 核酸測定試劑盒（德國Qiagen 公司；美國Ambion 公司）及PCR 擴增儀（美國Applied Biosystems 公司）使用指導書規定的方法進行。整個試驗操作均嚴格按照操作規范進行，采用β-actin為內參，同時做陰性和陽性對照，均在控。結果判讀以試劑說明書為準，本實驗所有的PCR 引物序列及擴增片段：CGRP上游引物：5'-CTCTCAGCAGCATGTGGGT-3'，下游引物：5'-TAACTCATTTATACTTGGTTTCA-3'，擴增片段554 bp；ASIC3 上游引物：5'-CCCAGCTCTGGACGCTATG-3'，下游引物：5'-TCTTCCTGGAGCAGAGTGTTG-3'，擴增片段414 bp；β-actin上游引物：5'-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3'，下游引物：5'-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3'，擴增片段：241 bp。

1.7 Western blot 法檢測CGRP 與ASIC3 蛋白表達 按照BCA Kit（美國Thermo Pierce 公司）說明書進行操作。提取組織蛋白，制備蛋白樣品，采用α-tublin 為內參，進行電流強度確定、轉膜及封閉，得出蛋白電泳條帶，并測量各蛋白值。

1.8 全細胞膜片鉗技術測定DRG 神經元中ASIC3電流 應用全細胞膜片鉗技術，采用ASIC3 特異性阻斷劑APETx2（英國Tocris 公司）將ASIC3 電流與其他電流區分開。檢測正常及ED 刺激后大鼠ASIC3通道離子電流的變化。

1.9 統計學方法 采用SPSS 24.0 軟件進行統計學分析，符合正態分布的計量資料采用獨立樣本t檢驗或單因素方差分析；不符合正態分布的計量資料采用Wilcoxon秩和檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ED 刺激使DRG 神經元高敏感性發生 全細胞膜片鉗技術記錄結果顯示，給予大鼠1 h 重復ED 刺激后，大鼠胸段脊髓DRG 神經元受去極化刺激產生的動作電位頻率明顯增多，所記錄的ED組DRG 神經元動作電位個數與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.01），見圖1。

圖1 全細胞膜片鉗技術記錄DRG神經元動作電位個數

2.2 CGRP 與ASIC3 在DRG 神經元中共表達 免疫熒光結果顯示，CGRP 主要表達于DRG 神經元細胞質中，ASIC3 主要表達于DRG 神經元細胞質和細胞膜中，DRG 神經元細胞核由DAPI 染色，將CGRP 表達與ASIC3 表達疊加后發現，兩者在DRG 神經元中存在共表達；且ED 組DRG 神經元中CGRP與ASIC3表達較對照組密集，見圖2。

圖2 免疫熒光技術檢測CGRP與ASIC3在DRG神經元中的表達定位（箭頭所示）（scale bar=50 μm）

2.3 ED 刺激使DRG 神經元中CGRP、ASIC3 mRNA 和蛋白表達上調 qRT-PCR 和Western blot檢測結果顯示，與對照組比較，ED 組DRG 神經元中CGRP、ASIC3 mRNA 和蛋白表達水平顯著上調（P＜0.01）；ED 組CGRPmRNA 與ASIC3 mRNA 表達呈正相關（r=0.833，P＜0.01），CGRP蛋白與ASIC3 蛋白表達呈正相關（r=0.981，P＜0.01），見圖3、圖4。

圖3 qRT-PCR檢測大鼠DRG神經元CGRP、ASIC3 mRNA 的表達

圖4 Western blot檢測大鼠DRG神經元中CGRP、ASIC3蛋白的表達

2.4 ED 刺激與CGRP8-37 影響DRG 神經元中ASIC3 電流變化 全細胞膜片鉗技術記錄結果顯示，ED 組 和ED+CGRP8-37 組DRG 神經元中ASIC3 電流較對照組顯著增加（P＜0.01）；與ED組比較，ED+CGRP8-37 組DRG 神經元中ASIC3電流顯著減少（P＜0.01），見圖5。

3 討論

非糜爛性反流病是指胃-十二指腸內容物反流至食管，引起反流、燒心等癥狀，但無食管黏膜破損或Barrett 食管表現的疾病，是胃食管反流病中最常見類型。長期反復的酸暴露使食管上皮感覺受體和黏膜下層神經元致敏，形成食管內臟高敏感［8-10］。部分非糜爛性反流病對質子泵抑制劑（PPIs）療效差，可能由于PPIs 不能解決內臟高敏感［11-13］，明確食管內臟高敏感發生機制可為臨床治療提供重要理論依據。

在既往研究中發現，給予大鼠1 h 重復ED 刺激后，胸段脊髓DRG 神經元受到去極化刺激產生的動作電位數量較對照組明顯增多（P＜0.01），且DRG 神經元細胞膜和細胞質中ASIC3 的表達分布較對照組密集［7］。本研究也同樣證實了這點，本研究還通過qRT-PCR 及Western blot 法檢測發現，ED組ASIC3 mRNA及蛋白表達水平顯著高于對照組（P＜0.01）；全細胞膜片鉗技術記錄的ED組DRG 神經元細胞中ASIC3 電流也較對照組顯著增加（P＜0.01）。由此可見，在ED 誘導的大鼠內臟痛模型中，ASIC3 參與了DRG 神經元高敏感性發生，增加食管內臟敏感性。酸誘導的ASIC3 能被快速激活并介導穩態電流，進一步誘發DRG 神經元的動作電位。此外，過度表達的ASIC3 可能會改變DRG 神經元中相關離子通道的通透性，產生異位放電，導致痛覺過敏。

CGRP是一種由37 個氨基酸殘基組成的感覺性神經肽，由感覺神經末梢釋放，廣泛分布于中樞神經系統及外周組織，參與傷害性信息的傳遞和痛覺敏感化，屬痛覺一級傳遞興奮性神經遞質［14-15］。本研究發現，在大鼠ED 內臟痛模型中，CGRP 與ASIC3 在胸段脊髓DRG 神經元中存在共表達。ED 組CGRPmRNA 及蛋白表達水平較對照組顯著上調（P＜0.01），且CGRPmRNA、蛋白表達與ASIC3 mRNA、蛋白呈明顯正相關（P＜0.01）。由此可推測，CGRP與ASIC3 可能共同參與食管內臟高敏感的發生。為進一步證實推測，我們通過向DRG 神經元細胞的培養液中加入CGRP8-37 來觀察DRG 神經元中ASIC3 電流變化，CGRP8-37 作為CGRP 的受體拮抗劑，可對CGRP競爭性抑制。最終檢測結果顯示，ED+CGRP8-37組ASIC3 電流較ED 組明顯減少（P＜0.01）。這說明CGRP及CGRP受體參與調節DRG 神經元中ASIC3 的功能表達。在DRG 神經元中，CGRP對ASIC3 的功能表達有正向調節作用，但CGRP及其受體是如何參與調節ASIC3 的功能表達呢？目前具體作用機制尚不明確。有實驗證實，CGRP與CGRP受體特異性結合后，可激活腺苷酸環化酶（AC），催化ATP 轉變為cAMP，促進cAMP 濃度上調，激活cAMP 依賴性蛋白激酶A（PKA），進而表現出高度多樣的生物學活性，包括炎性介質釋放、靶蛋白表達增加、離子通道開放等，從而影響痛覺的產生［16-18］。CGRP可能就是通過與CGRP受體結合后激活AC-cAMP-PKA 信號傳導通路，誘導改變ASIC3 功能表達，使細胞去極化，增加DRG 神經元興奮性，從而影響痛覺信號的傳導，但這需要進一步實驗證實。

綜上所述，內臟高敏感的發生是由多因素共同參與的復雜過程，主要涉及外周敏感化和中樞敏感化，初級傳入神經元敏感化是中樞敏感化發生的必要條件［19-20］。所以了解初級傳入神經元敏感化機制對抑制痛覺信號的傳導無疑具有重要意義。本研究成功構建了食道擴張內臟痛動物模型，從ASIC3 表達及功能改變的機制入手，進一步研究ED 內臟痛動物模型中DRG 神經元興奮性改變的機制，并揭示CGRP可能通過調節ASIC3表達及功能改變，參與ED 內臟痛動物模型中DRG 神經元高敏感性的發生，為非糜爛性反流病內臟高敏感的靶向治療提供初步的理論依據。