腸神經膠質細胞在帕金森病中的作用研究進展

趙孟琪 綜述，董 莉 審校

內蒙古醫科大學附屬醫院檢驗科，內蒙古呼和浩特 010050

帕金森病(PD)是一種黑質致密部多巴胺能神經元退行性變性、死亡，以殘存神經元細胞質內α-突觸核蛋白(α-syn)聚集形成路易小體為主要病理改變的運動障礙性疾病[1]。目前PD尚無有效的治療方法，隨著其發病率的逐年上升，社會負擔也逐漸加重，成為當今社會面臨的重大挑戰之一。造成這種局面的原因是PD病因及發病機制不明。雖然研究表明PD特征性α-syn病理沉積物首先出現在腸神經系統(ENS)[2]，與腸道微生物群引起的腸道局部炎癥有關，但其中具體的細胞及分子機制尚不清楚。腸神經膠質細胞(EGC)作為ENS數量最多的細胞，與腸道微生物群聯系緊密。研究發現，魚藤酮誘導的PD小鼠模型中存在腸道微生物群失調、腸道局部免疫性炎癥、EGC病理性激活[3]。此外，來自PD患者的結腸活檢標本顯示,存在以膠質纖維酸性蛋白(GFAP)表達上調但磷酸化降低為特征的EGC[4]。這表明EGC病理性激活及其誘導的腸道局部免疫性炎癥在PD中發揮著重要的作用。因此，本文對EGC的概述、EGC在PD患者腸道免疫性炎癥中的作用及EGC對PD診斷和治療的啟示進行闡述。

1 EGC概述

1.1EGC的起源及異質性 EGC起源于神經嵴衍生細胞，在小鼠胚胎第9.0天至第13.5天，迷走神經嵴及骶嵴衍生細胞遷移、定植于發育中的腸道后分化為EGC及腸神經元，共同構成ENS；而人類EGC在胚胎 8～11周時逐漸從腸壁肌間神經叢、黏膜下神經叢遷移至腸黏膜中，最后分布于所有類型神經元周圍[5-6]。根據EGC在消化道中的位置和形態，可分為4種主要類型：Ⅰ型“原生質”EGC(位于神經節中)、Ⅱ型“纖維狀”EGC(位于神經節結締組織)、Ⅲ型“黏膜”EGC(位于黏膜下)、Ⅳ型“肌內”EGC(位于肌間)[7]。基于EGC在位置和形態上存在差異，BOESMANS等[8]研究發現大部分Ⅰ型EGC共同表達GFAP、S100鈣結合蛋白B(S100B)和轉錄因子(Sox10)，Ⅱ型和Ⅲ型EGC只有少數會表達GFAP，而Ⅳ型EGC幾乎不表達GFAP，表明其在表型上可能也存在不同。與此同時，BOESMANS等[8]進一步通過檢測單個EGC在三磷酸腺苷(ATP)刺激下細胞內Ca2+濃度的變化作為EGC激活的替代標記探討各種類型EGC的功能，結果顯示，與Ⅱ型和Ⅲ型相比，Ⅰ型EGC具有更高的鈣反應率，表明不同形態和定位的膠質亞群也表現出不同的活性。由此可以推測，EGC具有位置、形態、表型、功能上的異質性，這種異質性可能促使其在腸道中發揮多種功能。

1.2EGC的生理功能 EGC被認為是一種細胞網絡，不僅為腸神經元提供結構支持和營養支持，還與腸道微生物群、腸上皮細胞、腸內分泌細胞、腸道免疫細胞相互作用，在ENS內建立穩態環境。其生理功能有：(1)EGC可表達多種模式識別受體(PRR)，例如Toll樣受體(TLR)、炎癥小體、晚期糖基化終產物受體(RAGE)等。TLR通過富含亮氨酸的細胞外結構域識別病原體相關分子模式(PAMP)和損傷相關分子模式并形成受體復合物，引起Toll/白細胞介素(IL)-1受體結構域響應并募集下游銜接分子，促進細胞內信號轉導并激活核因子-κB/p38蛋白激酶(NF-κB/p38MAPK)、Janus激酶/信號轉導和轉錄激活因子等，導致炎癥因子的表達、釋放增加，EGC可表達TLR3、TLR4、TLR7[9]；核苷酸結合域樣受體蛋白3(NLRP3)炎癥小體是先天免疫系統的重要組成部分，NLRP3可以識別不同的刺激而被激活，隨之吸引凋亡相關微粒蛋白和富含半胱氨酸的天冬氨酸水解酶(caspase-1)組裝成炎性體，觸發caspase-1激活和caspase-1介導的IL-18和IL-1β的釋放，從而引發細胞凋亡[10]；RAGE是一種新的PRR，其可以結合胞外蛋白，例如S100B，引起細胞內促炎信號通路激活，最終導致促炎性細胞因子表達增加[11]。(2)生理情況下，EGC還表達釋放GFAP、S100B、Sox8/9/10、蛋白脂蛋白1、43半通道蛋白(Cx43)等多種標志性蛋白及膠質細胞源性神經營養因子(GDNF)、腦源性神經營養因子(BDNF)、亞硝基谷胱甘肽等膠質衍生物質[6]，參與腸道多種病理生理過程。

2 EGC在PD腸道免疫性炎癥中的作用

2.1EGC響應微生物的侵襲而在PD中發揮作用 自從BRAAK等[12]發現PD的特征性α-syn病理沉積物分布在PD患者疾病進展各個階段的黏膜下和肌間神經節之后，提出了一種假說：胃腸道的假定致病性損傷可能導致腸神經元內α-syn錯誤折疊，然后通過迷走神經傳輸到中樞神經系統(CNS)。雖然多項嚙齒類動物研究通過將α-syn注入腸壁，發現α-syn可從胃腸道傳輸到大腦[13]，但卻無法得出具體的致病因素。這種致病因素最有可能是腸道微生物，PD動物模型及臨床試驗也都發現腸道微生物的變化。而腸道微生物通過何種機制在PD的發生、發展中發揮作用仍處于正在探索的階段。EGC特別是黏膜EGC因其位置特殊，可與腸道微生物群密切接觸，并對微生物的侵襲作出反應。現發現，EGC在面對微生物的侵襲時表現為促炎及抗炎的兩面性：其不僅可以響應病原微生物的侵襲而發生病理性激活，誘導腸道針對病原微生物的免疫炎性反應，目的是清除微生物；還可以通過釋放膠質衍生物而抑制腸道免疫性炎癥，保護腸道屏障(IEB)，這可能是其在PD中發揮作用的基礎，具體機制如下。

2.1.1EGC促進腸道免疫性炎癥 (1)EGC可通過PRR識別PAMP而觸發細胞內信號轉導。相關研究發現細菌脂多糖(LPS)、IL-6可通過與EGC細胞膜上PRR的結合，激活EGC，觸發TLR4/NF-κB等促炎信號通路及NLRP3炎性體的形成，促進腸道免疫性炎癥以清除病原體[9,14]。有研究表明，PD患者體內產生LPS的革蘭陰性菌增多，并且可以誘導腸道炎癥，其是TLR4的一種主要配體[15]。最近，CHOI等[16]通過向小鼠直腸內注射奇異變形桿菌衍生的LPS，發現其可增加腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平，并在治療16 d后導致結腸中TLR4過度表達。這些效應擴展到大腦可引起黑質紋狀體區域的小膠質細胞激活及中樞和腸道神經元中的α-Syn聚集。因此，過度的TLR4信號傳導可能導致PD中腸道免疫性炎癥而促進PD相關病理成分形成及疾病進展。緊接著GORECKI等[17]通過飲用水對小鼠模型長期、低劑量施用LPS，發現這會加劇α-syn過表達小鼠的PD病理學表現，進一步支持TLR4介導的腸道炎癥在疾病進展中的作用。目前已經發現在PD小鼠模型中存在EGC病理性激活，并且TLR4表達增加和腸道炎癥并存[18]，提示EGC上的TLR4信號通路可能積極參與PD的腸道炎癥。(2)EGC可響應微生物的侵襲而表達和分泌促炎介質。研究者從暴露于細菌LPS的人腸肌間叢EGC的原代培養中發現，在LPS的刺激下，EGC上調了多種促炎介質的轉錄物，例如促炎性細胞因子(IL-6、IL-8、IL-33、TNF-α)、趨化因子(CCL2、CCL3、CCL12)、S100B[19]。促炎性細胞因子和趨化因子具有特殊的作用，因為它們可以進一步募集中性粒細胞、巨噬細胞及肥大細胞直接促進針對病原體的免疫性炎癥。而S100B可通過多種方式促進腸道免疫炎癥。有研究表明，腸道感染期間EGC釋放S100B增加，S100B不僅可以與EGC表面的TLR4受體結合，通過激活下游NF-κB通路，促進黏膜一氧化氮(NO)的產生和釋放[20]；還可以通過自分泌的方式與EGC表面的RAGE受體結合，引起細胞內信號通路S100B/RAGE/PI3K/NF-κB激活，進一步促進促炎性細胞因子(TNF-α、IL-6)、趨化因子表達、釋放增加及保護性因子IL-22表達、釋放減少[11]，最終促進腸道免疫性炎癥。對于EGC病理性激活后釋放的炎癥介質在PD中均發現表達升高，雖然細胞因子并非EGC特異性的，但不可否認其可能參與PD的腸道免疫性炎癥。有研究發現，PD患者的血腦屏障(BBB)受損，外周細胞因子可以通過受損的BBB而進入CNS[21]，提示上述細胞因子可能通過受損的BBB進入腦內而參與PD的發生、發展，這還需要進一步研究證實。S100B是一種鈣結合蛋白，在大腦中主要由星形膠質細胞表達、釋放，有研究表明，S100B可以與小膠質細胞上的RAGE受體結合，引起小膠質細胞活化和遷移，隨后小膠質細胞進一步釋放釋放CCL3、CCL5和CXCL12等趨化因子促進腦內神經炎癥[22]。在PD動物模型中，S100B已被證明對神經退行性變有顯著貢獻，特別是1-甲基-4苯基-1，2，3，6四氫吡啶(MPTP)誘導的PD小鼠模型中的多巴胺能神經元變性在S100B靶向消除后被部分抑制[23]。目前研究主要集中在星形膠質細胞釋放的S100B在PD中的作用，鑒于越來越多的證據表明EGC在PD發病機制中起著至關重要的作用，對于EGC釋放的S100B在PD中的作用有待進一步研究。(3)EGC可對細菌成分進行抗原提呈。EGC在接觸細菌或寄生蟲后，可表達主要組織相容性復合體-Ⅱ類分子而充當抗原提呈細胞，將LPS等呈遞給CD4+T細胞，從而誘導CD4+T細胞活化并分化為輔助性T細胞(Th)17和調節性T細胞(Treg)[24]，引發針對病原體的免疫反應，并且最終引起促炎性細胞因子釋放而促進腸道免疫性炎癥。Th17是腸道黏膜免疫的主要適應性免疫細胞，而Treg是一種免疫抑制細胞，可抑制Th17功能，二者之間處于動態平衡，從而保證機體的免疫耐受[25]。大量研究表明，PD患者外周血存在Th17/Treg平衡失調，并且Th17和Treg均有機會進入CNS，PD尸檢及動物模型研究也發現腦內Th17水平增加而Treg水平減少[25-26]。相關研究還發現Th17及其特征性IL-17對多巴胺能神經元的神經毒性作用，而Treg發揮神經保護作用[26]。因此，EGC與適應性免疫細胞之間的作用可能是其參與PD的一種機制。

2.1.2EGC抑制腸道免疫性炎癥 除了促炎作用外，EGC還具有免疫抑制和抗炎作用。這些抗炎作用部分是通過釋放膠質衍生物質來控制的。具體包括GDNF、BDNF等，這些膠質衍生物質可作用于自身及周圍的免疫細胞而有益于減弱腸上皮通透性、抗炎作用和促進神經元存活。GDNF是腸道感染期間最有代表性的保護性因子，其可以通過與其他細胞上的酪氨酸激酶受體(RET)結合而減少促炎性細胞因子的產生并有助于維持腸上皮屏障功能。研究表明，GDNF釋放后可與3型淋巴細胞(ILC3)上的RET結合，從而激活ILC3并促進抗炎因子IL-22的釋放和腸道上皮細胞中修復基因的表達增加，保護結腸炎癥上皮[27]；釋放的BDNF則通過下調EGC上的TLR4受體而降低LPS誘導的小鼠一氧化氮合酶及促癥因子IL-6的表達[28]，減輕腸道炎癥。現有證據表明，GDNF不僅能通過抑制腸道炎癥而改善結腸炎上皮細胞功能，還能通過改善腸上皮細胞中的緊密連接而改善IEB功能及減輕由橋粒芯糖蛋白2損失引起的IEB功能損害[29-30]。CHEN等[31]的研究發現，便秘的PD患者血清GDNF水平較低，提出假設：低GDNF水平更容易導致腸黏膜屏障功能受損，腸道通透性改變，ENS更容易受到腸道菌群的影響，從而導致PD患者的便秘癥狀。由此，EGC源性GDNF可能在PD中發揮保護作用。綜上所述，EGC既可以響應微生物的侵襲而被激活并釋放促炎介質擴大腸道免疫性炎癥，同時釋放的促炎介質又可以進一步作用于EGC，形成類似于正反饋的閉環系統，級聯放大腸道免疫性炎癥；相反，其釋放保護性因子可以減輕腸道炎癥而保護IEB功能，從而對抗微生物的侵襲。因此，EGC具有兩面性效應，這可能源于其是一種異質性細胞群體。對于EGC病理性激活后啟動的促炎信號通路及其釋放的炎癥介質均可能在PD的進展中發揮某些促進或者保護作用，除此之外其與適應性免疫細胞之間的相互作用可能促進CD4+T細胞向腦內聚集并與腦內先天性免疫細胞相互作用而促進PD的發生、發展。然而，對于EGC在PD中的確切作用還需要更多的臨床前及基礎實驗來進一步探討。

2.2EGC與PD中的α-syn聚集 研究表明，PD中存在EGC的病理性激活[32]。DEVOS等[33]通過在結腸活檢中使用聚合酶鏈反應，發現與健康對照組相比，PD結腸活檢中編碼4種促炎性細胞因子和3種神經膠質標志物的mRNA轉錄物增加，表明PD中存在腸道炎癥，并可能與EGC的病理性激活密切相關；除此之外，PEREZ-PARDO等[18]的小鼠實驗發現，口服魚藤酮的小鼠結腸黏膜呈現促炎狀態，存在結腸肌間神經叢EGC病理性激活、結腸α-syn聚集和多巴胺能神經元丟失，而免受魚藤酮誘導的小鼠則表現為更少的肌間神經叢EGC激活、結腸α-syn聚集和多巴胺能細胞丟失，PEREZ-PARDO等[32]的最新研究通過對死亡小鼠結腸的固定切片進行免疫熒光染色，也發現EGC源性GFAP與α-syn的表達同步升高，推測EGC可能在腸道α-syn病理形成中也發揮著作用；除此之外，有研究表明，α-syn可通過腸神經膠質Cx43半通道(通過Cx43半通道連接的神經膠質-神經膠質合胞體是胃腸道和中樞神經系統之間細胞間通信的途徑)或迷走神經上升到中樞神經系統[34]，進一步發現EGC在α-syn上升到中樞神經系統的過程中也發揮作用。目前在CNS中發現細胞外α-syn可以刺激小膠質細胞和星形膠質細胞產生促炎分子和氧化應激效應物質，神經炎癥和氧化應激可以促進并加劇神經退行性過程[35]，提示作為星形膠質細胞消化系統等效物的EGC也可能受到ENS中α-syn的刺激而激活從而加劇PD中腸道炎癥。綜上所述，PD中的EGC可能發生病理性激活，可能通過參與腸道免疫性炎癥而促進ENS中α-syn錯誤折疊，并且有助于α-syn向大腦傳播，反過來α-syn也可能作為一種效應分子進一步促進EGC病理性激活，未來應具體探索它們之間的復雜串擾。

3 EGC對PD診斷和治療的啟示

3.1EGC對于PD診斷的啟示 PD患者結腸組織中發現EGC反應性增生及其特異性的膠質標志物陽性，并且在PD早期就出現，因此通過胃腸黏膜活檢獲取EGC并進行分析可能優于α-syn對早期PD進行預測。傳統的對于細胞類型的分析主要通過分選技術，如熒光活化細胞分選(FACS)，用于從特定細胞類型生成數據并更深入地了解這些細胞，然而這種方法需要大量的細胞制備或熒光報告信號，試驗過程復雜，任何一個環節出現問題都會影響試驗結果的準確性，從而使FACS復雜化，并且它對于組織中的EGC并不是很適用[36]。另一種可行的方法是通過單細胞RNA測序分析細胞特異性轉錄組，它能夠提示單個細胞的基因結構和基因表達狀態，反映細胞間的異質性，目前已經應用于腫瘤學、神經科學等多個領域。近期SMAJI等[37]通過對6例特發性PD患者和5例年齡性別匹配的健康人死后中腦的41 000個單核轉錄組進行分析，可以區分出少突膠質細胞、星形膠質細胞、小膠質細胞等多種細胞類型，并且發現這些細胞在PD中都存在明顯的基因表達差異，最后得出小膠質細胞是與特發性PD風險基因相關的細胞類型。DROKHLYANSKY等[38]將單細胞測序用于人和小鼠ENS分析，發現肌間和黏膜EGC的表達基因存在明顯不同，并且發現多個PD風險基因在ENS中富集，其中NRXN1、ANK2富集在EGC中，表明EGC的功能障礙可能會加劇CNS的疾病。以上結果說明了單細胞測序技術可達到對細胞類型的精準分析。EGC是一種異質性細胞群體，未來應利用單細胞測序技術的優勢深入探索EGC的異質性在PD及其他胃腸道疾病中的作用。

3.2EGC對于PD治療的啟示 對于EGC相關信號通路、標志性蛋白的研究，可以發現潛在的治療靶點，并可設計治療策略來防止多巴胺能神經元進行性退化。主要作用靶點有：(1)靶向TLR4信號通路。減輕TLR信號傳導可促進免疫平衡，迄今為止，已經發現了6種水平的負調控[39]。①TLR蛋白的降解；②TLR及相關基因轉錄機制的下調；③微小RNA的轉錄后抑制；④釋放作為可溶性誘餌的可溶性TLR；⑤細胞內抑制劑；⑥TLR與其配體結合后，TLR信號通路的膜結合阻滯劑。研究發現，敲除EGC上TLR4基因的小鼠可免受魚藤酮誘導引起腸道炎癥，這種小鼠表現為PD癥狀減輕[18]。(2)靶向S100B/RAGE/NF-κB信號通路。研究發現，噴他脒阻斷S100B/RAGE/NF-κB通路可防止EGC激活、腸道炎癥、神經元丟失[11]。(3)靶向GDNF。研究發現，5羥色胺受體激動劑可增加EGC源性GDNF，減輕腸道炎癥并保護ENS中的神經元損傷[40]。雖然上述靶向治療減弱了EGC激活、改善了腸道炎癥，但EGC是一種功能異質性細胞，在PD中還未進行針對異質性EGC的精準治療，未來可探索靶向異質性EGC實現疾病精準治療的技術和方法。

4 展 望

隨著PD腸道發病機制探索的不斷深入，EGC在PD發生、發展中的作用日益顯現，本文綜述了EGC對微生物的侵襲作出反應的某些機制，希望可以對PD早期診斷及干預提供新的思路。EGC是一種異質性細胞群體，未來應利用單細胞測序技術的優勢深入探索EGC的異質性在PD及其他胃腸道疾病中的作用，并進一步研發靶向異質性EGC實現疾病精準治療的技術和方法。