非標準抗體在血清陰性抗磷脂綜合征中的診斷價值*

安 然，楊樹艷，劉 磊 綜述，李佩玲 審校

1.哈爾濱醫科大學附屬第四醫院婦產科，黑龍江哈爾濱 150001；2.哈爾濱醫科大學附屬第二醫院婦產科，黑龍江哈爾濱 150001

抗磷脂綜合征(APS)由HUGHES在1983年首次提出。APS病因復雜，可能與免疫、感染、遺傳等因素相關。關于APS血栓形成的機制，目前醫學界提出了“二次打擊學說”[1]。抗磷脂抗體激活血管內皮細胞、血小板、單核細胞及中性粒細胞，形成“一次打擊”，手術、感染、制動等因素為“二次打擊”，從而誘發血栓形成。APS病理妊娠發病機制復雜，其發病機制可能為：(1)抗磷脂抗體(aPLs)可使胎盤血管收縮，減少胎盤血供。(2) aPLs抑制胎兒血管內皮細胞前列環素釋放，胎兒血管收縮導致循環障礙。(3) aPLs直接與妊娠滋養細胞表面磷脂結合，破壞滋養細胞引起流產、子癇、胎兒生長受限、死胎等。抗磷脂抗體介導的免疫炎癥反應是發病的主要機制。

1 抗磷脂綜合征的診斷

當前APS的診斷標準采用2006年札幌國際分類標準悉尼修訂版[2]。APS診斷需滿足至少1項臨床標準及至少1項實驗室標準，且中高抗體滴度測定需間隔12周及以上。臨床標準包含血管性血栓：任何組織器官出現≥1次動脈、靜脈或小血管血栓形成(影像學或組織病理明確發現)，且血栓部位的血管壁無血管炎表現；病理妊娠：(1)≥1次孕10周后不明原因胎停(需經超聲或直接檢查證實)；(2)≥1次孕34周前因子癇/重度子癇前期或重度胎盤功能不良所致正常胎兒早產。(3)連續≥3次孕10周前原因不明流產(排除女方激素水平、解剖異常及男女雙方染色體異常)。實驗室標準包含(1)≥2次狼瘡抗凝物陽性；(2)≥2次血清或血漿中/高滴度IgG和/或IgM型aCL(數值>40 GPL/MPL或滴度>99%普通人群)；(3)≥2次血清或血漿中/高滴度IgG和/或IgM型抗β2糖蛋白-Ⅰ抗體(抗β2-GPⅠ)抗體(滴度>99%普通人群)。抗體滴度存在時間應在血栓事件發生后持續12周至5年[3]。抗體滴度持續存在的原因不明，考慮可能與感染、氧化應激有關。APS臨床表現主要為血栓和/或病理妊娠。在對160例確診APS患者的回顧性分析中，47.5%出現深靜脈血栓，43.1%出現動脈血栓，9.7%出現產科并發癥，2.5%出現災難性APS[4]。此外，APS還可表現為網狀青斑、血小板減少癥、溶血性貧血、心臟瓣膜病、腎病及神經系統病變。目前臨床常規檢測的aPLs分別是抗β2-GPⅠ、aCL和狼瘡抗凝物(LA)。aCL和抗β2-GPⅠ需用酶聯免疫吸附試驗檢測(ELISA)，分為IgG型和IgM型。狼瘡抗凝物是功能性凝血試驗，不區分抗體同種型。

LA表現為體外低凝，體內高凝。相較于aPLs，與血栓及妊娠并發癥相關性更強。LA是APS診斷最特異的檢測方法[5]，無單一試驗對LA完全敏感，建議同時選擇兩種不同分析原理試驗(硅化凝血時間和稀釋蛙蛇毒時間試驗)，驗證狼瘡抗凝物的存在。

抗β2-GPⅠ是含有5個結構域(DI-DV)的高度糖基化蛋白，存在于血漿中，具有強親脂性，參與脂代謝。抗β2-GPⅠ主要由肝細胞合成，胎盤絨毛也可合成。抗β2-GPⅠ優先結合并清除帶負電荷的磷脂。這使得其與磷脂疾病及脂代謝疾病相關。抗β2-GPⅠ的DⅠ、DⅡ是其與抗體或其他蛋白結合的主要位點，在系統性自身免疫疾病和APS中，自身抗體主要識別抗β2-GPⅠ的DⅠ。抗β2-GPⅠ構象由閉合型改變為活性開放魚鉤結構，暴露DI與抗體結合、作用。抗β2-GPⅠ參與凝血、纖溶系統調節，同時作為一種生物性蛋白，參與卵巢顆粒細胞的增殖分化，調控精子生成及精子活力，與不孕及流產相關。

2 抗磷脂綜合征的分類

不合并其他免疫系統疾病，以APS為首發疾病的為原發性APS(P-APS);繼發于其他免疫系統疾病的為繼發性APS(SAD-APS)，30.0%～40.0%狼瘡患者合并APS[6]，APS還可繼發于其他免疫系統疾病。以血栓為主要表現的為血栓性APS(TAPS)，以反復流產、子癇、胎盤功能不全等病理妊娠為主要臨床表現的稱為產科 APS(OAPS)。一些OAPS患者，僅符合APS診斷標準中的臨床標準或實驗室標準，或抗體間斷性陽性，稱為非典型 OAPS(NOAPS)[7]。多部位、多臟器迅速血栓形成，造成多器官衰竭稱為災難性APS(C-APS)。C-APS多由外科手術或感染引起。手術或感染誘發過度的促炎細胞因子、凝血級聯反應和血小板活化，導致多器官、多系統血栓形成和微血管病性溶血性貧血[8]。

3 血清陰性抗磷脂綜合征的定義和非標準抗磷脂抗體的臨床應用

一些患者臨床表現高度提示APS，但典型的aPLs,包括aCL,抗β2-GPⅠ,LA均為陰性，稱之為血清陰性APS(SN-APS)。2003年首次提出SN-APS的概念。SN-APS為排除性診斷，患者需除外遺傳性血栓性疾病(如凝血因子突變、蛋白S缺乏、蛋白C缺乏、抗凝血酶缺乏)、活動性癌癥、創傷、遭受大手術或長期臥床等。近年研究發現多種抗磷脂抗體，為SN-APS的診斷提供了更好的依據。

一項中國隊列研究[9]，實驗納入192例APS、90例SN-APS、193例自身免疫性疾病對照組和120例健康人群對照組進行評估，研究發現60.9%SN-APS和93.5%APS患者至少檢測到一種非標準aPLs。

一項英-美聯合研究分析了一例系列“非標準”aPLs，包括175例APS患者和68例SN-APS患者，研究發現，1/3的SN-APS患者“非標準”aPLs呈陽性。研究結論為，具有APS臨床特征但常規典型標記物陰性的患者應接受額外的非標準抗體檢測[10]。

GABRIELA[11]對70例原發性APS患者進行了回顧性分析，當典型抗磷脂抗體轉陰5年后再次檢測抗體，70例患者中有24例aPLs持續陰性。自aPLs消失并隨訪60個月后，24例患者中有11例(45.8%)在接受抗凝治療后出現血栓復發。COMARMOND等[12]研究了10例aPLs轉陰的APS患者，在停止口服抗凝劑后平均隨訪19個月，其中1例患者發生肺栓塞。故研究建議對于APS治療后aPLs持續陰性的患者，應在停止抗凝治療之前對患者進行非典型抗體二級篩查，同時進行徹底的心血管風險因素評估[13]。

3.1IgA 型抗磷脂抗體 IgA型aPLs 分為IgA型aCL和IgA型抗β2-GPⅠ。與IgG/IgM型aPL比，IgA-aPL的研究較少。但近年研究發現，SLE患者(伴或不伴APS)會出現IgA-aCL和IgA-抗β2-GPⅠ水平升高。IgG/IgM型aPL陰性的患者,IgA型抗β2-GPⅠ水平升高與血栓形成以及妊娠并發癥相關[14]，IgA型抗β2-GPⅠ在體內具有促血栓形成作用。 有研究[15]評估430例患者的IgA、IgM、IgG型aPL。研究包含230例患者(111例APS患者和119例不合并APS的SLE患者)及200例健康對照組患者。APS患者中，IgG型aPL抗體陽性率(41.0%～74.0%)高于IgA、IgM型aPL。APS患者中，抗β2-GPⅠ 3種抗體靈敏度，IgG 型(64.8%)高于IgA型(40.5%)高于IgM 型(33.3%)；抗β2-GPⅠ 3種抗體特異度IgM 型(97.5%)高于IgA 型(97.2%)高于IgG 型(95.6%)。APS患者中IgG 型aCL、IgG 型抗β2-GPⅠ與血栓性并發癥相關，與產科并發癥無關。一項病例對照研究[16]包括244例IgA型抗β2-GPⅠ陽性且IgG 、IgM型陰性的患者和221例抗體均陰性的健康對照組患者，隨訪5年，結果表明IgA型抗β2-GPⅠ的存在與血栓性APS事件風險增加相關(OR：5.15；P<0.001)。因此，在其他aPL陰性的無癥狀患者中，IgA型抗β2-GPⅠ的孤立陽性似乎是發生APS事件的獨立風險因素。第13屆國際抗磷脂抗體大會(2010年)[17]，建議對伴有APS癥狀的IgG和IgM陰性患者進行IgA型抗β2-GPⅠ檢測。

3.2抗磷脂酰乙醇胺抗體 磷脂酰乙醇胺(PE)構成細胞膜磷脂，主要存在于線粒體中，是一種不帶電荷，數量較小的兩性磷脂分子。它通過增強活性蛋白C活性而起到抗凝的作用。PE可誘導被抗磷脂酰乙醇胺抗體(aPE)識別的激肽原發生特定的構象變化，影響激肽釋放酶-激肽原-激肽系統增強凝血酶誘導的血小板聚集，進而影響血栓形成及凝血功能。

一些研究發現，aPE與胎兒丟失、血栓形成顯著相關，且主要存在于缺乏APS實驗室標準的情況下。SANMARCO等[18]進行了研究：(1)選擇98例不明原因血栓形成患者與142例血栓形成傾向患者(67例APS，75例遺傳性凝血功能障礙)進行對比實驗，(2)對110例無血栓患者(60例SLE，50例患感染性疾病)與健康獻血者對比。本研究發現，與無血栓患者相比，APS患者(43.0%；P<0.000 1)和不明原因血栓形成患者(18.0%；P=0.001)的aPE檢出率顯著升高。一項大型多中心研究(包括317例深靜脈血栓患者和52例動脈血栓患者)發現[19]，15.0%的血栓患者檢出aPE。GRIS等[20]檢測了518例不明原因早期胎兒丟失的女性和一組健康母親的對照組中的各種aPLs。IgM-aPE被發現是不明原因孕早期流產的獨立危險因素。在一項大型多中心研究中(包含317例深靜脈血栓患者和52例動脈血栓患者)，15.0%的血栓患者中發現了aPE，其中大多數僅aPL陽性。aPE可被視為SN-APS潛在標志物。

3.3抗凝血酶原抗體及抗磷脂酰絲氨酸/凝血酶原復合物抗體 凝血酶原(PT)參與凝血級聯反應，由肝臟合成，是一種血漿蛋白。在凝血的第二階段由外源性凝血活酶轉化為凝血酶，介導高凝狀態，與血栓形成密切相關。抗凝血酶原抗體(aPT)的靶點是磷脂結合蛋白β2糖蛋白Ⅰ和PT。磷酯酰絲氨酸(PS)參與細胞膜磷脂組成，帶負電荷。磷脂酰絲氨酸與凝血酶原組成磷脂-磷脂結合蛋白復合物。ELASA可檢測到抗凝血酶原抗體和抗磷脂酰絲氨酸/凝血酶原復合物抗體(aPS/PT)。臨床大量回顧性研究印證了aPT的臨床意義。aPT在SLE患者中檢出率約50.0%～60.0%，在一些研究中，其檢出率甚至高于aCL、抗β2-GPⅠ。aPT增高的患者心血管意外增高5倍。aPT是誘發動脈或靜脈血栓的獨立風險因素。一項15年縱向研究發現，抗凝血酶原抗體是系統性紅斑狼瘡患者血栓形成的預測因子[21]。有研究發現[22]，血栓患者的IgG-aPT水平高于IgM-aPT。血栓患者IgG-aPT、IgG-aPS/PT和IgM-aPS/PT水平高于無血栓患者。48.0%標準抗心磷脂抗體陰性患者中可檢出aPT。有研究發現[23]，包含191例抗磷脂抗體陽性攜帶者，40例(20.9%)中檢測到IgG-aPS/PT，102例(53.4%)中檢測到IgM-aPS/PT。在IgG-aPS/PT陽性攜帶者中，血栓性事件的累積發生率顯著較高(P=0.035)，但在IgM-aPS/PT陽性攜帶者中則沒有。有研究發現[9]，aPS/PT -IgG對APS和SN-APS診斷價值最高。IgG-aPS/PT是血栓高風險因素。ZIGON等[24]研究發現aPS/PT在抗磷脂綜合征相關妊娠并發癥患者中的檢出率及臨床相關性。結果發現24.3%的患者至少有一項抗磷脂抗體陽性，aPS/PT和aCL的檢出率最高(分別為13.0%和12.4%)，其次是LA(7.7%)和抗β2-GPⅠ(7.1%)。169例有APS相關不良妊娠表現的患者中，11例僅檢出aPS/PT。17.8%的患者LA或aCL和/或抗β2-GPⅠ陽性，然而，當增加檢測aPS/PT時，另外7.0%的患者可以考慮APS。故aPS/PT與孕早期復發性流產或晚期妊娠丟失以及早產有關，aPS/PT現已被公認為APS的高效潛在標記物，并被納入了全球APS評分系統(GAPSS)，用于患者血栓風險評估。aPT多與血栓形成相關，在APS患者中aPS/PT比aPT更多見。

3.4抗波形蛋白/心磷脂復合物 波形蛋白(Vimentin)是一種Ⅲ型細胞骨架中間絲蛋白，波形蛋白形成抗原后暴露，并與抗波形蛋白抗體(AVA)結合。波形蛋白還可以與凋亡細胞表面的心磷脂相互作用，產生波形蛋白/心磷脂復合物(AVA/CL)。該復合物的抗體，波形蛋白/心磷脂復合物抗體，導致內皮細胞釋放促炎因子和促凝因子，誘導血小板聚集和激活凝血級聯，在動脈血栓形成中起關鍵作用。TRUGLIA等[25]研究發現，93.9%APS患者AVA/CL 陽性，31.5%SN-APS患者AVA/CL 陽性，SN-APS患者和APS患者的AVA/CL中位數顯著高于健康對照組，差異有統計學意義(P<0.000 1)，APS患者的AVA/CL中位數也顯著高于SN-APS患者(P<0.000 1)。原發性SN-APS和繼發性SN-APS患者的AVA/CL水平差異無統計學意義，且AVA/CL陽性幾乎持續存在。另一項對61例產科SN-APS患者回顧性分析中發現，76.0%患者的AVA/CL呈陽性[26]。這種抗體的監測對SN-APS患者意義重大。AVA/CL檢測靈敏度很高，但特異度差。類風濕性關節炎及系統性紅斑狼瘡患者也攜帶此種抗體。

3.5β2-GPⅠ結構域Ⅰ抗體 抗β2-GPⅠ含有5個結構域(DI-DV)，研究發現針對抗β2-GPⅠ所有結構域抗體，其中抗D1的IgG抗體與APS關系最密切[27]。小鼠注射單克隆DI-IgG，可誘發血栓以及妊娠丟失[28]。第14界國際抗磷脂抗體大會上，專家認為APS患者中，合并血栓病史者，其抗β2-GPⅠ結構域Ⅰ(抗β2-GPⅠD1) 抗體陽性率高于無血栓者。血栓形成與結構域I抗體相關性較強，該抗體檢測有助于患者風險分層及管理。血栓性APS比產科APS的抗β2-GPⅠ 結構域 I 抗體陽性率高[29]。aCL和/或抗β2-GPⅠ陽性患者中，抗β2-GPⅠ結構域I抗體存在使APS血栓風險增加3～5倍。診斷APS時IgG-抗β2-GPⅠD1抗體特異度高于IgG-抗β2-GPⅠ及IgG-aCL(分別為100.0%、96.0%、30.0%)。其靈敏度與IgG-抗β2-GPⅠ及IgG-aCL相似(分別為61.0%、63.0%、65.0%)。有研究發現，同時聯合檢測IgG-抗β2-GPⅠD1抗體及IgG-aPS/PT、IgM-aPS/PT將提高APS診斷的陽性預測值，并可提高發現APS血栓高風險人群[30]。另一項多中心研究31，包含抗β2-GPⅠ陽性患者442例，其中結構域I抗體陽性患者243例，研究發現IgG-aD1陽性與孕10～34周的流產、早產顯著相關。故抗β2-GPⅠ 結構域Ⅰ抗體有潛力成為APS血栓及不良妊娠風險評估工具。

3.6抗膜聯單白A5抗體 膜連蛋白是能與帶負電荷的磷脂在鈣離子存在時相結合的糖蛋白，分為A,B,C,D,E,5組，有60個成員，膜連蛋白A5(Annexin A5)目前研究較多。研究發現，膜連蛋白A5能影響花生四烯酸的代謝，阻止血栓形成，它在血管內皮細胞表面可形成保護性抗凝屏障，維持血液流通。在人內皮細胞和胎盤滋養層中高度表達。抗β2-GPⅠ抗體與抗β2-GPⅠ結合可破壞屏障，內皮細胞“抗栓”特性消失，轉而聚集前炎癥因子、前凝血因子等進而導致患者易栓癥。SINGH等[32]將112例APS患者與40例健康對照組進行比較，發現69例APS患者抗膜連蛋白A5抗體(aANX)陽性，對照組中只有3例aANX陽性。另一項研究發現IgG-aANX與孕早期不明原因復發性流產密切相關[33]，研究尚未發現IgM亞型aANX與產科并發癥的獨立相關性。當IgG-aANX與多種抗磷脂抗體同時出現時，陽性抗體種類越多臨床癥狀發生率越高。

3.7抗膜聯單白A2抗體 膜連蛋白A2是A亞族成員，越來越多的研究發現膜聯單白A2可以活化內皮細胞，聚集前炎癥因子啟動凝血瀑布反應，膜連蛋白A2同時參與纖溶活動，若受到病理因素影響，使內皮細胞表面膜連蛋白A2的表達降低，就會破壞纖溶，誘導血栓形成。膜連蛋白A2表達于內皮細胞、胎盤合體滋養層刷狀緣、腎小球系膜細胞[34]。敖文[35]研究IgG型抗膜連蛋白A2抗體在APS患者、SLE合并血栓患者,無血栓SLE患者及在健康人群中的水平，研究發現APS組IgG型膜連蛋白A2 抗體陽性率為 21.8%，SLE合并血栓組IgG型抗膜連蛋白A2抗體陽性率26.8%，均顯著高于無血栓的SLE 組(6.5%)(均P<0.01)。膜連蛋白A2 抗體IgG陽性的患者血栓和/或不良妊娠的概率顯著高于A2抗體陰性者(P<0.01)。故抗膜連蛋白A2抗體與血栓及不良妊娠相關，且有助于APS診斷。

3.8抗磷脂酸、磷脂酰絲氨酸和磷脂酰肌醇抗體 磷脂酸(PA)、磷脂酰絲氨酸(PS)和磷脂酰肌醇 (PI)均為帶負電荷的磷脂，對血清陰性抗磷脂綜合征的診斷作用存在爭議。一項中國地區研究發現IgG型抗磷脂酰肌醇抗體(aPI)與動脈血栓顯著相關,IgG和IgM型抗磷脂酰絲氨酸抗體(aPS)均與動脈血栓顯著相關，但與靜脈血栓無關[36]。體外模型中研究發現，PS可抑制胎盤滋養層的發育和侵襲，延緩合體滋養層的形成，降低HCG水平[37]。一項對866例抗心磷脂抗體陰性的復發性流產患者的研究發現，10.1%的患者存在其他抗磷脂抗體陽性，其中包括抗磷脂酰絲氨酸(PS)。此類患者應用低分子肝素或普通肝素治療后分娩率升高[38]。另一項對872例復發性流產的研究發現，49例患者(3.6%)aCL及LA均陰性，但aPS陽性，aPS的存在與復發性流產呈正相關。

4 總結和展望

抗磷脂綜合征的盡早診斷及治療對預防不良妊娠及血栓性疾病的發生極其重要。臨床表現滿足APS而三大血清學抗體陰性的患者，亟需新的檢測方法。對SN-APS患者的研究，促進了新的特異性標記物的發現，越來越多的臨床研究證明新標記物的臨床價值。本文發現，IgA 型抗磷脂抗體與血栓相關；抗磷脂酰乙醇胺抗體與孕早期不明原因流產、血栓及產科并發癥相關；抗凝血酶原抗體與血栓形成相關，是靜脈或動脈血栓形成的獨立風險因素；抗磷脂酰絲氨酸/凝血酶原復合物抗體與孕早期復發性流產或晚期妊娠丟失以及早產相關，并且與血栓相關；抗波形蛋白/心磷脂復合物與血栓及產科并發癥相關；抗β2-GPⅠ 結構域Ⅰ抗體與血栓形成相關性較強，有助于風險分層和患者管理，且與妊娠10～34周流產、早產相關，抗β2-GPⅠ 結構域 I 抗體有潛力成為APS血栓及不良妊娠風險評估工具；抗膜聯單白A5抗體與血栓及不明原因復發性流產相關；抗膜聯單白A2抗體與血栓及不良妊娠相關；抗磷脂酰絲氨酸IgG/IgM型抗體與動脈血栓顯著相關，可能與不良妊娠相關；抗磷脂酰肌醇IgG型抗體與動脈血栓顯著相關，可能與不良妊娠相關；抗磷脂酸抗體可能與不良妊娠相關。

對反復出現不明原因血栓形成、不明原因復發性流產或反復妊娠相關并發癥的女性，臨床高度懷疑APS，但aPLs滴度間斷陽性或持續陰性，考慮可能為SN-APS的患者，可行相關非標準抗體檢查，且檢查發現的非標準抗體數目越多，血栓、不良妊娠等疾病發病風險越高。APS患者典型抗體持續陰性，在中斷抗凝治療之前，強烈建議對患者進行非典型抗體二級篩查，同時進行徹底的心血管風險因素評估。對于APS的診斷，非標準抗磷脂抗體是對現行aPLs標準的重要補充。但由于各實驗室檢測方法及標準不同，導致非標準抗磷脂抗體實驗結果偏差，這就需要將實驗室檢測方法標準化，同時需要開展多中心、不同種族、大樣本、更規范的臨床研究。非標準抗體存在巨大潛在價值。