中藥干預Hippo通路抗腎纖維化的研究進展*

樊尚珩 李 均

遵義醫科大學珠海校區,廣東省珠海市 519000

腎臟纖維化(renal fibrosis)是慢性腎臟病(Chronic kidney disease,CKD)發展的病理基礎,其病變包括上皮受損激活炎癥反應,持續的炎癥損傷導致腎臟內環境抗損傷修復系統失調,誘導肌成纖維細胞過度增殖轉化,基質金屬蛋白酶(MMPs)/基質金屬酶組織抑制因子(TIMPs)失衡致大量細胞外基質(ECM)過度沉積,引起腎小管萎縮、腎小管組織結構的永久性破壞,最終細胞凋亡器官功能喪失[1-2]。隨著腎臟纖維化的進行性發展,無法避免危及至人體其他系統功能,引發一系列并發癥最終導致死亡。越來越多的研究證實河馬—薩爾瓦多通路(Hippo信號通路)對腎纖維化的發展發揮著重要作用。Hippo通路關鍵核效因子YAP/TAZ持續激活誘導下游致纖維化靶基因過度表達致組織損傷修復不良和纖維化[3]。長期以來,使用中藥治療腎纖維化具有獨特的優勢和應用前景。基于中藥整體療效應且通過多靶點、多機制抑制腎纖維化,將中藥應用于抗腎纖維化的研究獲得越來越多的關注。使用中藥干預Hippo通路防治腎纖維化也取得了一定的研究成果。本文就Hippo信號通路對腎纖維化的作用以及近年來中醫藥靶向Hippo信號通路治療腎纖維化的相關研究進展予以簡要綜述,為尋找潛在的治療靶點及后續相關研究提供新思路。

1 Hippo信號通路與腎纖維化

1.1 Hippo信號通路構成 Hippo途徑是一條由一系列蛋白激酶和轉錄因子組成的信號傳導鏈。哺乳動物Hippo通路由三個激酶級聯組成：哺乳動物不育20樣激酶1/2(MST1/2)、大腫瘤抑制因子1/2(LAST1/2)、下游重要效應因子yes相關蛋白(YAP)和帶有pdz結合基序的轉錄共激活因子(TAZ)[4]。MST1/2和LAST1/2是該途徑上游信號的核心組成部分, 而YAP、TAZ是Hippo信號通路下游眾多靶基因的轉錄輔助激活因子,其中TEADs是主要的YAP下游轉錄因子[5]。生理狀態下通路的激活可被看成一條線性級聯,Hippo通路的激活源于MST1磷酸化,磷酸化的MST1與Salvador(SAV1)結合形成MST-SAV復合體,其直接磷酸化LAST1/2,活化的LAST1/2磷酸化YAP中的絲氨酸殘基,導致YAP與支架蛋白14-3-3結合后阻礙YAP由細胞質轉移到細胞核的途徑,使YAP滯留在細胞質中泛素化、降解;位于細胞質中的YAP不能與核內TEAD結合,從而抑制了YAP轉錄活性,使細胞增殖和器官生長受到限制[6]。當該途徑上級效應因子受外界不良環境影響而發生突變、缺失而出現畸變,導致上游MST1/2、LATS1/2激酶級聯被抑制,去磷酸化的YAP由細胞質轉移至細胞核內積聚;為誘導下游靶基因的表達,移位至核內的YAP本身不與DNA結合,而與轉錄因子TEA結構域家族成員蛋白形成復合體誘導下級靶基因表達,如CTGF、EGFR、TNF-α,從而激活細胞增殖[7]。

1.2 Hippo信號通路對腎纖維化的影響

1.2.1 Hippo信號通路調控炎癥反應：在器官纖維化中,炎癥導致氧化應激誘導TGF-β產生和上皮—間充質轉變樣表型(EMT),上調YAP/TAZ蛋白表達,并觸發炎癥信號NF-κB途徑促進炎癥反應進一步加重并導致促纖維化進展的一系列細胞機制使組織硬度增加[8]。周細胞存在于大血管和毛細血管的壁上,它積極參與血栓形成和新生血管的炎癥反應。當血管內皮細胞受損時,周細胞表達的組織因子促進血小板聚集并釋放促炎因子[9]。Yang等[10]通過YAP基因敲除(YAP-SiRNA)抑制了周細胞、內皮細胞炎癥反應,觀察到對下游炎癥因子JNK、NF-κB和TNF-α的抑制作用。提示YAP/TAZ激活參與了周細胞炎癥反應的啟動,并證實了YAP/TAZ是所有炎癥因子的上游基因。此外,Zheng等[11]使用腎缺血/再灌注誘導小鼠AKI-CKD轉變模型發現腎臟不良修復、巨噬細胞浸潤和MCP-1過表達與YAP持續激活有關,且使用YAP抑制劑維替泊芬(VP)可抑制上述改變。

1.2.2 Hippo信號通路參與EMT：Seo等[12]在腎小管上皮細胞特異性缺失Sav1基因的單側輸尿管梗阻模型誘導小鼠中發現腎臟纖維化加重,上皮—間充質轉變樣表型改變,EMT標志物如α-SMA、波形蛋白、成纖維細胞特異性蛋白-1、上皮細胞標志物E-cadherin等表達增加,細胞凋亡和不良增殖。Xu等[13]使用突變小鼠研究發現特異性敲除MST1、MST2可使YAP/TAZ在組織中表達增加,導致纖維相關因子纖連蛋白、Ⅰ型膠原蛋白等表達增加。與之對比,選擇性敲除YAP表達可顯著減輕腎功能下降,并降低纖維化因子TGF-β和CTGF的表達[14]。此外,MST1/2的缺失可誘導炎癥細胞因子TNF-α表達增加,且TNF-α通過正反饋回路激活YAP,最終突變小鼠腎臟出現進行性炎癥、腎臟組織結構損傷導致纖維化和功能損害[15]。

1.2.3 Hippo通路參與機械轉化及與其他信號通路的串擾：YAP/TAZ可感應細胞微環境如細胞外基質硬度、細胞密度和細胞骨架張力等變化,即通過機械轉導感知器官物理環境,將機械力和變形轉化為生化信號,影響基因表達、細胞形狀和細胞命運[16]。Jin等[17]在單側輸尿管梗阻小鼠模型中發現腎缺血性損傷引起的炎癥反應促進腎實質ECM沉積,ECM的過度積累驅動進行性器官纖維化,增加組織硬度,激活機械敏感的“物理傳感器”YAP。活躍的YAP上調ECM沉積并激活正反饋回路,誘導成纖維細胞激活加重腎纖維化。TGF-β信號轉導在腎間質纖維化的發生發展中起重要作用,包括Smad依賴和非Smad依賴途徑。Szeto等[18]的研究表明腎臟硬化后,在堅硬的基質中YAP/TAZ通過將激活的Smad2/3保留在細胞核中來促進TGF-β信號轉導,首次證明了TGF-β誘導的典型Smad2/3信號是通過ECM剛性變化控制Smad2/3的定位來調節的,并且這種機制的調節可能依賴于蛋白Yap和TAZ。YAP/TAZ通過機械調節TGF-β/Smad信號通路促進UUO小鼠腎纖維化,從而導致成纖維細胞轉化和ECM的產生。

2 腎纖維化在中醫領域的認知

腎纖維化是西醫病理名詞,中醫古籍中無此定義,根據其各種病理與臨床表現,包括“水腫”“關格”“癃閉”“虛勞”“腎勞”“腎風”“溺毒”“腰痛”“尿濁”等病證范疇。其病因病機可總概括為“本虛標實”,本虛為脾腎兩臟的氣血陰陽虧虛為疾病發病之本,以外邪、濕濁、濕熱、水飲、瘀血、濁毒等為標,尤其以瘀血貫穿于慢性腎臟病至纖維化的始終[19]。“痰”“濁”“瘀”“毒”既是病理產物又是致病因素,與“本虛”相互作用,互為因果。綜上所述,RIF發展涉及多種病機,因此治療上當以活血化瘀、補虛培本、益腎健脾、排濁解毒、清熱利濕為法。相較于西藥作用靶點單一,中醫藥注重整體觀念和人的整體功能,考慮疾病的綜合因素以及臟腑之間的關系。通過充分認識腎纖維化的病機及中醫藥發揮的功效有助于創造更多更優的治療選擇。

3 中藥調控Hippo信號通路干預腎纖維化的相關研究

3.1 單味中藥

3.1.1 祛濕類：雷公藤作為一類祛風通絡、除濕止痛的中藥,臨床上常用來治療腎臟疾病、風濕免疫類疾病等,可通過調節NF-κB、Wnt/β-catenin、TGF-β等多條信號通路發揮抗炎、抗氧化、抗纖維化等作用。臧勇等[20]使用致纖維化因子TGF-β誘導HK-2細胞發生EMT變化,產生纖維化現象。同時發現使用TGF-β誘導的HK-2細胞中TAZ蛋白表達量相較于TGF-β與TP共同誘導的HK-2細胞TAZ蛋白表達量顯著升高,提示TP可通過調節Hippo通路效應因子表達抑制腎小管上皮細胞纖維化。

桑枝作為藥食兼用植物是一味傳統中藥材,其是桑科植物的干燥枝條,性平味苦,入肝、脾、肺、腎經,具有祛風活絡、利關節和燥濕利水等療效,臨床上可用于治療關節腫痛、手足麻木、風濕癰痛等疾病。余文勝等[21]對糖尿病db/db小鼠模型使用不同劑量桑枝多糖進行干預發現,桑枝多糖高劑量組(1 200mg/kg)小鼠腎功能、腎臟組織纖維化因子、炎癥因子以及YAP、TAZ蛋白表達量明顯低于桑枝多糖低劑量組(600mg/kg),且桑枝多糖低劑量組腎功能及腎臟病理變化較模型組明顯改善。以此提示桑枝多糖可能通過調節腎臟組織YAP、TAZ蛋白表達以及抑制YAP/TAZ信號通路下游的效應因子生成減緩腎間質纖維化的形成從而發揮抗纖維化作用。

3.1.2 活血類：姜黃素是一種姜黃屬根莖提取物,具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、調脂降糖等生物學活性[22]。嚴穎等[23]運用改良的5/6腎結扎方式誘導CKD模型觀察腎纖維化病理、腎功能及纖維化指標α-SMA的表達量增加,而使用姜黃素100mg/kg的含藥飼料治療3個月后發現可以顯著減緩CKD進程,減慢腎纖維化進展,有利于腎功能恢復,且姜黃素治療組腎組織YAP蛋白表達量較結扎組顯著下降。

3.1.3 槲皮素：槲皮素屬于天然黃酮類物質,具有抗炎、抗氧化、抗菌等多種生物活性,且已有研究報道槲皮素具有緩解腎纖維化的作用[24]。Du等[25]證實了Hippo通路參與了高糖 (HG) 誘導的腎小球系膜細胞(MCs)的增殖,促進系膜基質和ECM的合成、沉積增加,導致腎小球硬化。研究發現槲皮素呈劑量依賴性方式逆轉HG誘導的MCs中降低的磷酸化MST1和LATS1,使用槲皮素逆轉HG誘導的YAP-TEAD結合,減少YAP的核表達。總之,槲皮素可以通過重新激活糖尿病小鼠的Hippo 通路來抑制 MCs 的增殖,并減輕糖尿病小鼠的腎間質纖維化。

3.2 中藥復方

3.2.1 黃芪三七合劑：黃芪三七合劑為臨床上長期用于治療慢性腎病的復方制劑,對腎功能能受損有明顯改善作用。該方主要由黃芪、三七、昆布、懷牛膝等組成,對糖尿病腎病、急性腎損傷炎癥發展有一定改善作用[26]。雷小琴等[27]使用黃芪三七合劑對AKI小鼠(86.746mg/只)連續灌胃3d,發現治療組NF-κB p65及相關炎癥因子、YAP蛋白水平量較模型組降低。因此認為黃芪三七合劑改善小鼠急性腎損傷可能與YAP/NF-κB信號軸有關。

3.2.2 蟲草益腎方：蟲草益腎方是宋立群教授治療CKD的經驗方。全方以冬蟲夏草為君藥,以改善脾腎臟腑虛損之本;黃芪為臣藥,益氣健脾,補后天以養先天。全方兼健脾益腎、活血化瘀、瀉濁解毒之效。苑伯菲等[28]觀察到UUO大鼠模型中蟲草益腎方組腎功能指標、組織纖維化面積較模型組減少,磷酸化MST1、LATS1、YAP蛋白表達量較模型組上調。因此考慮蟲草益腎方保護UUO大鼠腎功能、抑制EMT、延緩RIF進展,其機制可能與調控Hippo信號通路中核心蛋白YAP、Mst1、Lats1蛋白磷酸化表達程度相關。

4 展望

腎纖維化病理機制復雜,涉及多條信號轉導途徑相互作用。近年更多的研究顯示Hippo信號通路在腎纖維化中發揮重要作用,涉及細胞凋亡、氧化應激、炎癥損傷、EMT、ECM合成及沉積等多種機制。鑒于中藥的多靶點治療效應,且中藥治療腎纖維化的療效明確。現已有相關研究表明中藥靶向調控Hippo信號通路的各級激酶蛋白及下級效應因子表達達到抗腎纖維化作用。盡管中藥干預Hippo信號通路延緩腎纖維化的研究取得了一定的成果,但目前的研究現狀仍有不足：第一,中醫藥種類繁多,單味中藥及復方其有效成分、藥理作用復雜,但真正發揮療效的組分提取、劑量,不同有效組分劑量配伍仍有待深入研究;第二,目前很多研究限于基礎實驗和動物實驗,于臨床應用仍有一定差距,中藥發揮作用機制復雜,未來仍需進一步研究以得到現代醫學的接受;第三,在已有的中藥干預Hippo信號通路抗腎纖維化研究中,大部分為祛濕類、清熱類、活血類,那么屬于以上類別的其他中藥是否也具有相似的抗腎纖維化機制,在未來研究類別相同的中藥可否通過Hippo通路抗腎纖維化值得我們進一步實踐。總之,依據目前已有的Hippo通路在腎纖維化中的作用及中藥干預實驗,未來仍需更深入的研究中醫藥防治腎纖維化的潛在機制并將其應用在臨床工作中,并逐漸完善中藥有效組分之間的配伍—劑量關系,“精準配伍”有利于提高主效應,減少毒副反應,為延緩腎纖維化提供理論參考和藥物策略。