男性不育患者Y染色體微缺失的臨床研究進展*

蘭貴斌 余 飛 黃承樂 馮國鋼

廣西百色市人民醫院檢驗科 533000

男性不育癥是由于男性的各種生理因素引起的夫妻未采取任何避孕措施進行正常性生活>1年未能使女方懷孕,近年隨著社會工作壓力的增加及不良生活習慣的形成,男性不育癥的發病率呈逐年升高趨勢,根據相關流行病學調查顯示,男性人群中有10%～15%的男性不育發生率,另外各種不孕不育癥患者中,由男方因素導致的不育比例也約占一半[1]。因此,男性不育癥的發生對有生育需求的患者及家庭產生嚴重的負面影響,并對患者的身心健康有不良影響[2]。目前,對于男性不育癥的研究已成為臨床研究關注的重點方向,經臨床研究確證的男性不育發生原因有多種,精索靜脈曲張、精索梗阻、隱睪癥、性腺功能異常、感染性疾病、免疫性疾病等均為男性不育的常見原因,另外由染色體異常、基因突變導致的遺傳缺陷是男性不育發生的重要原因,占所有男性不育患者的30%～40%[3]。

Y染色體微缺失是引起男性不育的一項重要遺傳因素,Y染色體上有多達220個基因,其中Y染色體長臂上存在著與精子發生相關的基因,即為無精子癥因子(Azoospermia factor, AZF),在進一步的研究中將這種AZF定位于Y染色體長臂(Yg11),將這種基因片段的缺陷稱為Y染色體微缺失[4]。然而由于個體間遺傳信息的差異性,Y染色體基因編碼區也不是完全相同,不育癥患者的Y染色體微缺失基因分布、表型、頻率、缺失機制等也有差異性,這也成為目前臨床對于男性不育Y染色體微缺失研究的主要方向[5]。為此,本文在查閱大量國內外相關文獻報道的基礎上,對男性不育Y染色體微缺失的研究現狀、進展進行歸納分析,并從Y染色體微缺失基因分布、表型、發生率、Y染色體微缺失的機制研究、Y染色體微缺失與男性不育等進行綜述,為揭示男性不育癥患者的發病機制、診斷、治療提供參考性建議。

1 Y染色體微缺失基因分布、發生率、表型

1.1 Y染色體微缺失基因分布 Y染色體在結構上有一個近端絲粒結構,以此絲粒為界將Y染色體分為長臂和斷臂兩部分,根據細胞遺傳學的研究通常將Y染色體分為7個大區和43個亞區,而Y染色體微缺失主要定位在長臂(Yq11)位置,進一步對Y染色體微缺失位置的劃分,AZF區在Y染色體長臂上由近至遠分為3個不同的亞區段,分別是位于Yq11.21位點的AZFa,位于Yq11.23位點的AZFb、AZFc,其中AZFb的遠端與AZFc的近端會出現部分重疊現象[6]。

AZFa是位于Yq近端的區域5內,其大小為1～3Mb,通過基因型的分析該區域能夠識別的基因包括：DBY、DFFRY、FTY、UTY、TB4Y、TB10Y等。AZFb具體位置在Yq缺失區間的5～6近端,大小也為1～3個Mb,目前研究發現該區域能夠識別5個基因包括CDY、eIF-1A、RBM、SMCY、XKRY。AZFc主要位于異染質的鄰近區段,大小為1～4Mb,目前已經識別的基因BPY2、CDY、DAZ、PRY、RBM和TTY2等[7]。

1.2 Y染色體微缺失發生率 根據國內外相關研究報道[8],Y染色體上AZF缺失發生率為10%～55%,造成此區間范圍的原因是AZF缺失受到人種、地域、環境、生活習慣等因素的影響。在具體的缺失類型中,微缺失發生率最高的是在AZFc區,能夠占到總微缺失的60%左右,而AZFa、AZFb區域的缺失呈現少見的特點,AZFb缺失發生率為16%～30%,AZFa區域缺失發生的概率最低,據相關統計一般在1%～10%。另外還有極少比例的AZFd區域的缺失,占1%～5%[9]。

造成各基因型微缺失發生范圍的差異性主要的原因包括以下幾個方面[10]：(1)各臨床報道納入的研究對象存在的差異性,納入的患者不育的原因可能是無精子癥、弱精癥、精子正常等不同的人群,而不同的癥狀也預示著患者病因的差異性,由此也表現出缺失發生率的不同;(2)患者在年齡、種族、職業、生活方式等方面有所不同,都會使得染色體微缺失基因型發生率的不同;(3)各報道中的試驗研究方法不同,具體的如STS標記位置的選取差異性也會使得在微缺失基因型發生率方面的差異性體現。

1.3 Y染色體微缺失基因型與表型 AZFc區域缺失在總微缺失中占據絕大部分,進一步對其表型分析認為AZFc區域的缺失也存在表型多樣化的特點,從輕度少精子癥到無精子癥,約有75%的缺失患者僅有Sertoli細胞,即病理表現為Sertoli細胞綜合征(SCOS)Ⅰ型,而25%患者表型為無精子癥或少精子癥[11]。相關研究也揭示了AZFc表型眾多的原因是患者的Y染色體的多個基因參與調控表達精子生成過程[12]。AZFb區域的表型主要與無精子或嚴重少精子有一定的關聯性,通常其病理表現為精子生成受阻且停滯在在精母細胞階段。AZFa區域缺失發生率最低,缺失患者主要表型與精子計數從無到正常但伴精子形態異常,病理檢查表現為SCOS Ⅱ型相關[13]。

目前,關于Y染色體微缺失基因型與表型的研究雖然有很大的進展,但關于基因型與表型的關系尚未完全明確。首先,在現有的研究中仍然缺失睪丸活檢的規范化實施方案及組織病理學的分類標準[14]。其次,男性不育患者隨著病情的進展其病理學分型也有改變,如患者的生精子細胞的減少會隨著時間的進展而加重。雖然各項報道間有一定的差異性,但總體上微缺失基因型與表型還是存在一定的趨勢,表現為微缺失大部分發生在無精子及少精子患者中,且無精子患者的Y染色體微缺失的發生率大于少精子者,另外在精索靜脈曲張、隱睪癥等患者中也發現了Y染色體的微缺失現象[15]。

2 Y染色體微缺失的機制研究

對于Y染色體微缺失的機制研究是不育癥研究的熱點方向,現已明確的是Y染色體微缺失除小部分是遺傳因素控制外,絕大多數是后天的再生現象,但導致染色體微缺失的原因及機制過程尚不清楚。一般認為是患者的睪丸來源的精子細胞起源時減數分裂出現差錯導致,較少可見的是在受精卵起始階段引起,由此可阻止胎兒精原細胞的合成。Y染色體微缺失發生率較高的原因也表明了患者對遺傳物質的缺失是高度敏感的,但關于其缺失的機制研究仍然處于推測階段[16]。

首先,機體的X和Y染色體之間以及Y 染色體本身出現的不平衡姐妹染色單體在遺傳過程中的互換,以及患者Y染色體同源或相似的重復序列之間出現的異常重組情況。在患者細胞減數分裂時的Y 染色體的基因型分布對于異常的X、Y染色體互換轉移是異常敏感的,而這種異常敏感特性會導致Y染色體微缺失的發生[17]。其次,Y染色體的微缺失與Y染色體自身不穩定性有關,Y染色體本身存在的高頻重復序列在精子形成和胚胎發育的有絲分裂期間,Y染色體重復序列出現交叉互換,特別是在高度重復異染質Yq12、Yq11區域內,易出現微缺失,因此也可解釋為什么主要微缺失區域在AZFa、AZFb、AZFc。再者,存在AZF微缺失的患者,其Y染色體序列通過測序分析,與正常人的Y染色體相比更易于發生缺失[18]。一項對Y 染色體常染色質區的3.5Mb段的基因測序表明,在最易出現微缺失的AZFc 區域,由于存在的大量重復擴增子序列,容易導致此區域的序列發生結構變異。擴增子相當于AZFc區多拷貝的大的 DNA 序列,其大小常為115～678kb,這些緊密排列的擴增子形成了人類基因組中空前復雜的遺傳學結構,這些擴增子包含生精所需的基因片段,會導致患者Y染色體序列變異并出現Y染色體微缺失,最終導致不同程度的生精障礙及不育的發生[19]。

目前,隨著研究的進展和深入,臨床已經發現了多個AZF區域缺失的候選基因,最佳的一個候選基因DAZ基因位點,以DAZ基因位點以及其他位點基因所編碼蛋白在生精細胞周期的調控和減數分裂過程中發揮重要作用,而這些基因位點的缺失會造成不同程度的生精障礙[20]。

3 Y染色體微缺失與男性不育

男性Y染色體具有遺傳動力,并且由于高比例的節段重復序列的存在而易于發生顯著性的變異,節段重復形成了在Y染色體各基因位點出現的各種缺失和重復的基礎。大量的相關文獻報道顯示,Y染色體微缺失能夠參與精子的發生過程,并能影響男性患者睪丸的發育狀態,從而導致患者出現無精癥或少精癥[21]。也有研究表明,Y染色體長臂基因座含有大量的在睪丸中的轉錄基因,并且在精子發展中有明確的作用,這些區域的喪失會導致男性患者的不育[22]。

隨著相關研究的深入,對于Y染色體長臂三個易出現微缺失的AZFa、AZFb、AZFc基因位點與男性不育關系研究也有了進一步的認識。AZFa區域編碼的兩個重要基因位點包括DFFRY、USP9Y,主要涉及RNA的代謝和轉錄過程,在睪丸組織中有表達。臨床觀察顯示,輕度少精表型的病人仍然保留著轉錄的USP9Y基因但缺失DFFRY基因,這也反映了這兩個基因有結合的需要以避免同時缺失所引起的SCOS發生[23]。既往的研究表明,在Y染色體微缺失中,AZFa最為少見,占整個Y染色體微缺失的1%～10%,但AZFa缺失患者的病情程度最為嚴重,大多數AZFa患者表現為SCOS,伴有睪丸體積縮小及無精癥。AZFb區域包含的基因位點最重要的是RBM,而RMB基因可進一步細分為RBMY1～RBMY6,其中RBMY1在男性患者的睪丸內有特異性表達,且主要存在于生殖細胞發育的早期,包括精原細胞、初級精母細胞的細線期晚期和精母細胞,對粗線期中期和其隨后的分化階段以及單倍體的精子細胞中,研究表明RBMY1基因對精子發生初期過程有重要的調控作用,當患者缺失RBMY1時會導致患者在精子發生初期即不能進行[24]。AZFb基因全部缺失的患者表現為生精阻滯,生精過程停留在精母細胞或精子細胞階段形成早期,臨床表現為SCOS、無精癥、少精癥等具體類型的不育。AZFc區域缺失最為常見,該區域臨近異染質區域,其調控的最重要基因是DAZ,但該區域出現微缺失時,臨床表現為多樣化[25]。

4 Y染色體微缺失檢測

對于Y染色體微缺失的檢測,常規染色體核型分析不易發現缺失Y染色體的微缺失區域,現階段臨床主要檢測方法為序列標簽位點(STS)的PCR擴增技術檢測,以獲取Y染色體的AZF微缺失區域信息。STS是一段已知核苷酸序列的DNA片段,能后反映染色體的不同序列組合,在檢測Y染色體微缺失過程中通過以STS設計不同的引物序列,對AZFa、AZFb、AZFc等三個主要區域進行篩查,在每個計劃篩查的區域以2～3個STS位點進行PCR擴增[26]。目前研究中,STS的數目還存在很大的差異性,在檢測時采用多少個STS還存在一定的爭議,無統一的標準,盡管Y染色體的AZF缺失的檢測包括多個STS,但AZF缺失個體總會發生某些熱點的缺失,故有必要提出一個簡便快速的篩查原則以滿足臨床檢測的需要。

在采用通過STS標記的PCR擴增技術檢測Y染色體微缺失區域時,也應注意以下幾點內容[27]：(1)采用單拷貝或局限于Y染色體小區域的PCR-STS是最有效的,而重復拷貝或跨越Y染色體長臂和短臂的全區域性標記在檢測中難以獲得滿意的信息。(2)在一些男性不育患者中,一些標記的染色體信息會呈現自然丟失,造成檢測結果的偏差,這往往與研究對象的選取、樣本的采集等有關。(3)在一般男性不育患者的Y染色體中,多個、不連續的區域性缺失是較為少見的,在檢測過程中遇到此類情況時應密切注意標記序列的順序和PCR反應的可靠性。(4)在進一步確證任何可疑的重要Y染色體微缺失區域時,合適的對照和高質量的模板DNA序列是檢測過程中所必備的條件。

5 小結與展望

近年來我國男性不育癥發病率呈現逐年升高的趨勢,有著龐大的男性不育癥人群,既往的臨床對于男性不育癥發病機制的研究也取得了一定的進展,初步揭示了Y染色體微缺失導致患者遺傳物質結構和數目的異常,都可能造成男性的生育障礙。Y染色體的AZF區域的缺失被證實與無精癥、少精癥和SCOS等發生有密切關聯。因此,通過對Y染色體AZF區域微缺失的檢測已發展成為診斷遺傳性男性不育的重要技術手段,對于男性不育癥患者的Y染色體微缺失篩查逐步受到臨床的重視。隨著研究的深入,對于男性不育患者Y染色體微缺失研究還存以下方向需要深入探討,如進一步明確Y染色體微缺失基因型與表型的關系,為臨床的診斷和治療提供依據。其次,對Y染色體AZF基因缺失是否存在種族、環境、年齡等因素的影響也應進一步探討闡明。另外,目前的研究主要集中在微缺失特征及基因的發現,對Y染色體基因編碼的蛋白質則知之甚少,在RNA代謝和加工過程及生殖細胞的分化機制方面并未深入涉獵。再者,規范和統一臨床檢測的標準尚未完全建立,多項研究間的差異性并不能有效地對比分析。這些方向都是今后此類研究中亟待解決的內容,相信隨著對Y染色體部分缺失區域性研究的不斷深入,能為我國男性不育患者的基因診斷及臨床治療提供更理想的理論和科學依據。